昆虫杆状病毒表达系统及用其表达E2蛋白的方法

摘要

提供了昆虫杆状病毒表达系统及用其表达E2蛋白的方法。具体的，提供了重组的杆状病毒，其具有保藏号CCTCC No：V200909；提供了用该重组杆状病毒转化的宿主细胞，以及用该宿主细胞生产重组E2蛋白的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组的昆虫杆状病毒表达盒，含有它的病毒，以及使用该病毒表达重组丙肝病毒蛋白E2的方法。

背景技术

丙型肝炎病毒(HCV)为具包膜的单股正链RNA病毒，属于黄病毒家族。HCV是已知唯一能造成慢性感染的RNA病毒(除逆转录病毒外)，据估计，目前全球约1.7亿HCV感染者中，60％-80％为慢性携带者，而持续性感染最终发展为肝硬化/肝癌的机率高达3.5％-20％。如此高比例的慢性感染率意味着在可能的病毒免疫逃逸机制下，机体往往无法激发或维持有效的抗病毒免疫反应。越来越多的证据表明，使细胞免疫在其中发挥主要作用，即在感染早期建立针对多个HCV抗原表位、多特异性的CD8CTL和CD4Th细胞的强细胞免疫屏障，对于急性感染的控制与病毒清除至关重要。

HCV基因组长约9.6kb，编码一个长约3000个氨基酸残基的多聚蛋白前体，在宿主信号肽酶和病毒自身编码蛋白酶的作用下生成4种结构蛋白(C、E1、E2、p7)和6种非结构蛋白(NS2-NS5B)，其中E1、E2为包膜糖蛋白，是中和抗体的主要靶抗原。E1和E2都属于I型整合膜蛋白，包括一个较大的N端膜外区和一个C端疏水性跨膜结构域。在其各自N端上游信号肽的引导下，定位于内质网膜上完成高度的N-糖基化，并被宿主信号肽酶切割后，非共价结合形成成熟的异源二聚体滞留于内质网上，在病毒萌出时与膜结构一同包裹在病毒表面。E1/E2的这种天然构象与修饰在病毒与细胞受体结合、细胞膜融合及进入细胞等病毒感染过程中起着至关重要的作用

目前对HCV受体及其与HCV包膜蛋白的相互作用仍所知有限。已知可能的受体分子包括四跨膜蛋白家族成员CD81，B族I型清道夫受体(SR-BI)，低密度脂蛋白受体(LD L.R)以及甘露糖结合凝集素L-SIGN和DC-SIGN，而E2蛋白则是与他们直接相互作用的亚单位。其中，体外和体内实验也已证实CD81和SR-BI在HCV侵入过程中发挥着直接作用，E2蛋白上和他们相互作用的位点信息也被逐渐确认。对HCV受体和病毒侵入机制的进一步研究对于HCV疫苗和特异性药物的研制具有重要意义。

鉴于E2蛋白与受体结合的机理，通过大量表达接近天然构型的E2蛋白，免疫筛选得到针对E2蛋白受体结合表位的中和抗体，注入体内，即可阻断E2蛋白与细胞受体的结合路径，从而起到治疗丙肝的目的。

通常制备抗原所采用的系统是原核表达系统，原核表达系统具备高通量表达、易于扩大再生产、低成本、菌体繁殖迅速、无转录后修饰和表达蛋白可被标记等优点，然而原核系统表达出的蛋白往往缺乏较好的空间构型和基本的糖基化修饰，与天然蛋白相差甚远，这导致在某些情况下用原核系统表达的蛋白免疫动物所制备的单抗识别天然表位能力低，对筛选中和性抗体不利，而不能用来开发治疗性抗体。同时，由于病毒蛋白的特殊性，采用大肠杆菌(如BL21)原核系统表达，E2在表达过程中会在很大程度上被降解。

因此，开发针对E2蛋白的丙肝治疗性抗体，迫切需要一种可以大量稳定表达接近天然E2的方法。

Bac to Bac系统是最新发展的昆虫细胞一杆状病毒表达系统之一，是利用转移载体pFastBac转化含有杆状病毒穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac，外源基因通过位点特异性转座作用整合到Bacmid中。Bacmid含有完整的昆虫多角体杆状病毒AcMNPV基因组，既能在大肠杆菌中低拷贝复制和稳定分离，又可以直接转染昆虫细胞，得到病毒粒子，经过筛选重组Bacmid，直接转染昆虫细胞，得到纯的重组病毒，同时高效表达外源基因。该昆虫系统具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰、加工以及转移外源蛋白的能力，同时表达的蛋白水平高达1～500mg/L，高于哺乳动物细胞表达量。

然而，仍然需要能够在生产过程中便于分离纯化的重组蛋白质，和能够大规模生产的培养方法。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种能够成功表达HCV E2蛋白的重组病毒，并用其大规模生产重组蛋白的方法。

在本发明的一个方面，提供了一种重组杆状病毒，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CGMCC No.CTCC-V200909。

在该方面的一个实施例中，该病毒含有重组表达盒，所述重组杆状表达盒含有：病毒多角体蛋白启动子P10、GP67信号肽序列、E2蛋白编码序列、凝血酶酶切位点接头、人源IgG-Fc编码序列、和Sv40PolyA。

在该方面的一个优选例中，GP67信号肽位于多角体蛋白和E2蛋白编码序列之间。在该方面的另一个优选例中，凝血酶酶切位点接头和人源IgG-Fc编码序列依次连接在所述E2蛋白编码序列下游。

在该方面的一个优选例中，E2蛋白编码序列编码SEQ ID NO：2的E2蛋白。E2蛋白也可以是其重组形式，或与其具有至少70％以上，优选80％以上，优选90％，优选95％以上的相同性的重组E2功能性蛋白。也可以是其任何具有E2功能的片段。

在本发明的另一个方面，提供了一种生产重组E2蛋白的方法，包括以下步骤：

用上述重组杆状病毒感染昆虫细胞，分离纯化产生的重组E2蛋白。

在该方面的一个优选例中，昆虫细胞通过重复悬浮培养除去抱团细胞。

在该方面的另一个优选例中，昆虫细胞是highfive昆虫细胞。也可使用任何与杆状病毒相容的其它昆虫细胞，或甚至原核或其它种类的真核细胞。

在本发明的另一个方面，提供了一种重组E2蛋白，为E2-凝血酶酶切位点接头-人源IgG-Fc融合蛋白。

在该方面的一个优选例中，在所述蛋白的凝血酶酶切位点接头和人源IgG-Fc片段之间有XhoI酶切位点。在另一个优选例中，人源IgG-Fc片段的氨基酸序列为SEQ ID NO：7。

附图说明

图1A显示了本发明的穿梭载体pFastBacHTb的构建图谱。

图1B显示了本发明的E2蛋白的氨基酸序列、其两端的信号肽编号序列，多克隆位点的序列，凝血酶酶切位点或蛋白纯化标签(Fc)的编码序列。

图2显示了本发明使用昆虫系统表达E2蛋白的流程图。

图3显示了pFastBacHTb-signal-Fc载体酶切后回收图(BamH1&Xho1双酶切)。

图4显示了E2-凝血酶酶切位点接头融合基因PCR跑胶切割后的结果。

图5显示了E2-thrombin基因构建入pFastBacHTb载体后菌液验证图示。

图6显示了pFastBac-E2质粒双酶切(BamH1&Xho1)后图示。

图7为中抽所得重组后E2黏粒，以M13通用引物PCR所得结果。

图8为中抽所得重组后E2黏粒，50V，150min，跑0.8％胶后所得结果。

图9显示了昆虫细胞Highfive感染前后状态的比较图示。

图10显示了病毒感染贴壁细胞48h后，裂解胞浆，western-blot方法，检测Fc标签的结果。

图11显示了ProteinG柱纯化后，所得E2蛋白样品。

图12显示了HCV病毒模型，昆虫系统所制备E2蛋白与HCV天然蛋白竞争实验。

具体实施方式

为了获得成功大规模生产E2蛋白的方法，本发明人发现，将E2蛋白与人IgGFc融合，使该蛋白能够被稳定表达，分泌到细胞周围或细胞内，能够通过简便的分离纯化步骤就可以方便收集。

人IgG Fc片段来源于pWS3质粒的Fc片段，在本发明中利用了其稳定表达病毒蛋白的特性。

本发明所使用的E2蛋白来自昆虫细胞杆状病毒重组表达。

重组病毒的制备可以通过本领域的各种已知的途径制备。本发明优选了Bacto Bac系统，利用可在大肠杆菌和昆虫细胞之间穿梭的载体Bacmid，将E2蛋白的序列转化杆状病毒，从而能够在昆虫细胞中高度表达E2蛋白。

根据本发明，可采用本领域技能中的常规分子生物学，微生物学，和DNA重组技术。这些技术在文献中有充分说明，如参见Maniatis & Sambrook，Fritsch，″Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1982)；″DNA Cloning：APractical Approach，″卷I和II(D.N.Glover ed.1985)；″OligonucleotideSynthesis″(M.J.Gait ed.1984)；″Nucleic Acid Hybridization″[B.D.Hames &S.J.Higgins eds.(1985)]；″Transcription and Translation″[B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1984)]；″Animal Cell Culture″[R.I.Freshney，ed.(1986)]；″Immobilized Cells And Enzymes″[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，″APractical Guide To Molecular Cloning″(1984)。因此，如果出现于本文下列术语的定义如下。

“DNA分子”指脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、或胞嘧啶)的聚合形式，以其单链形式或双链螺旋形式。这一术语只指分子的一级和二级结构，不限制它的任何具体三级形式。所以，本术语包括特别是在线型DNA分子(如，限制片段)，病毒，质粒和染色体中发现的双链DNA。这里讨论的结构，按常例给出的只是DNA非转录链的5‘到3’方向的序列(即，具有与mRNA同源序列的链)。

“RNA分子”指核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、或尿嘧啶)的聚合形式，以其单链形式或双链螺旋形式。这一术语只指分子的一级和二级结构，不限制它的任何具体三级形式。所以，本术语包括特别是在线型RNA分子(如，限制片段)，病毒中发现的单链RNA。在本文中给出的序列统统都翻译成基因组正链DNA形式。但应理解，在HCV的基因组中其为正链RNA形式，要通过转录成mRNA然后才能翻译和表达。

“载体”指一种复制子，如质粒，嗜菌体或粘粒，它们可以结合另一DNA片段，从而产生所结合片段的复制。“复制子”是一种基因元件(如，质粒，染色体，病毒)，其功能为体内DNA复制的自主单元，如能在其自身控制下复制。“复制起点”指参与DNA合成的DNA序列。“表达控制序列”是控制和调节转录和翻译另一DNA序列的DNA序列。编码序列是细胞中当RNA聚合酶将编码序列转录为mRNA时，与转录和翻译控制序列操作性连接并在它们的控制下，被翻译成编码序列所编码的蛋白。

通常，采用含有启动子序列的表达载体来促进与宿主连接的插入的DNA片段有效转录和翻译。表达载体通常包括复制起点，启动子，终止子，以及有能力在转化细胞中提供表型选择的特殊基因。被转化的宿主可以按本领域已知的方法发酵和培养，以达到最佳细胞生长。

DNA“编码序列”是当置于适当的调节序列控制下，能体内转录和翻译为多肽的双链DNA序列。编码序列的边界在5‘(氨基)端为起始密码子，在3’(羧基)端为翻译终止子。一个编码序列可以包括，但不限制于，原核序列，真核mRNA的cDNA，真核(如，哺乳动物)DNA的基因组DNA序列和合成的DNA序列。聚腺苷酸化信号和转录终止子序列通常位于编码序列的3‘端。“cDNA”指的是拷贝-DNA或互补-DNA，它是mRNA转录物的反转录反应产物。

转录和翻译的控制序列是DNA的调节序列，如启动子，增强子，聚腺苷酸化信号，终止子等，它们提供编码序列在宿主细胞中的表达。“顺式元件”是一种核苷酸序列，也被称为“共有序列”或“基序”，它可与那些能上调和下调特定基因位点表达的蛋白相互作用。“信号序列”也可以包括在编码序列中。这个序列编码位于多肽N-端的一种信号肽，其与宿主细胞联系并且将该多肽引向合适的细胞内位置。已发现信号序列可与许多原核和真核生物的天然蛋白相结合。

“启动子序列”是一种DNA调节区域，能在细胞内结合RNA聚合酶和引发下游(3’向)编码序列的转录。本发明定义，启动子序列其3’端为转录的起始位点并向上游(5‘)方向延伸包括最小数量的引发可检测水平(高于背景)的转录所必需的碱基和元件。在启动子序列中，可找到转录起始位点和负责与RNA聚合酶结合的蛋白结合区域(共有序列)。真核启动子经常，但并非总是，含有“TATA”盒和“CAT”盒。原核启动子除了-10和-35共有序列外，还含有SD(Shine-Dalgarno)序列。

术语“寡核苷酸”指的是一种由两个或更多(最好三个以上)脱氧核糖核苷酸组成的分子。它的确切大小由很多因素决定，取决于该寡核苷酸的最终功能和用处。本文用的术语“引物”指一种寡核苷酸，不论是以限制性酶消化的纯化天然寡核苷酸，还是合成产生的寡核苷酸，当其被置于引物延伸产物的合成条件下，如存在核苷酸和诱导剂如DNA多聚酶和适当的温度及pH时，可以作为引发合成的点，而所诱导的引物延伸产物与核苷酸链是互补的。引物可以是单链的也可以是双链的，但必须足够长使能在诱导剂存在时引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度、引物来源和所用的方法。例如，诊断应用，取决于靶序列的复杂性，寡聚核苷酸引物通常包含15-25或更多的核苷酸，虽然它也可以包含更少的核苷酸。

本文所选引物须与特定的靶DNA序列的不同链基本互补。这意味，引物必须与它们各自的链充分的互补性杂交。因此，引物序列无需反映模板的确切序列。例如，一段非互补核苷酸片段可附着于引物的5’端，而引物序列的其余部分与此链互补。另外，只要引物序列和与之杂交的序列足够互补时，非互补碱基或更长的序列可散布在引物中，这样形成了延伸产物合成的模板。

本文所用的术语“限制性内切酶”和“限制性酶”指能在一特定核苷酸序列上或附近切割双链DNA的酶。

“DNA重组技术”指合并两个异源DNA分子的技术，通常这是体外连接不同生物体DNA的结果。重组DNA分子通常用基因工程实验生成。同义的术语包括“基因拼接”，“分子克隆”和“基因工程”。这些操作的产物是“重组体”或“重组分子”。

当这种DNA被引入到细胞内时，细胞就被外来或异源DNA“转化”或“转染”了。转化DNA可能或没有被整合(共价连接)到细胞的基因组中。例如在原核生物，酵母和哺乳动物细胞中，转化DNA可能被维持在游离型元件如载体或质粒上。对于真核细胞来说，稳定转化的细胞是转化的DNA已整合到染色体中的细胞，这样通过染色体的复制将遗传给子代细胞。这种稳定性的证据是该真核细胞能够建立由含转化DNA的子代细胞群组成的细胞系和克隆。“克隆”是由一个细胞或有丝分裂祖先衍生的一群细胞。“细胞系”是能在体外稳定生长许多代的一个原代细胞的克隆。一种生物，如植物或动物，用外源DNA转化后称为“转基因的”生物。

本文用的术语“宿主”不仅包括原核生物，也包括真核生物如酵母、植物和动物细胞。原核宿主可以包括大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(S.tymphimurium)、灵杆菌(Serratia marcesens)、和枯草杆菌(Bacillus subtilis)。真核宿主包括酵母如巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、哺乳动物细胞和昆虫细胞，以及植物细胞如拟南芥(Arabidopsis thaliana)和烟草(Tobaccum nicotiana)。

当确定长度的两个DNA序列中的核苷酸有至少75％(较好的是80％，最好的是90％或95％)是配对的，则这两个DNA序列是“基本同源”的。序列的基本同源可通过用序列数据库的标准软件或Southern杂交实验，例如在为特殊系统所确定的严谨条件下，进行序列比较来鉴定。明确适合的杂交条件在本领域技术人员的能力之内见如Maniatis er al.，同上；DNA Cloning，Vols.I & II，同上；NucleicAcid Hybridization，同上。

DNA结构中的“异源”区域是在较大的DNA分子中天然不能与该较大DNA分子缔合的一段区域。因此，当该异源区域编码一哺乳动物基因时，该基因往往侧接了在来源生物基因组中不会侧接的哺乳动物基因组的DNA。另一例子为，该编码序列其自身在自然中是没有的(如，cDNA中的基因组编码序列包括内含子，或合成序列中包含了与自然基因不同的密码子)。等位(基因)变异或天然发生的突变并不产生本文所说DNA的异源区域。

另外，本发明还包括E2蛋白或E2基因的一部分或片段。本文的“片段”或“部分”指一个基因或一个多肽，长度上通常至少10个残基，较好的是至少20个残基，最好的是至少30个残基(如50个)，但必须少于全部完整的序列。这些基因片段可用本领域技术人员所知的方法制得，例如通过天然存在的E2基因或重组E2基因或E2蛋白基因的限制性消化，通过用编码E2确定片段的载体的DNA重组技术，或通过化学合成来制得。

按照本领域普通技术人员所公知的常规Northern杂交技术，可采用标准Nothern印迹试验来确定细胞或组织中的mRNA的相对量。另外，按照本领域普通技术人员所公知的常规Southern杂交技术，可采用标准Southern印迹试验来确认兴趣基因的存在和拷贝量。Northern印迹和Southern印迹都用到了杂交探针，即放射性标记的cDNA，或至少20(较好的是至少30，更好的是至少50，最好的是至少100)个连续核苷酸长度的寡核苷酸。DNA杂交的探针可以用本领域普通技术人员所公知的许多不同方法中的一种来标记。

这些研究中最常用的标记物是放射性元素、酶、暴露在紫外光下能发荧光的化学剂，等。已知有许多的荧光材料可用于标记。它们包括，如，荧光素、罗丹明、金胺、得克萨斯红(Texas Red)、AMCA蓝和荧光黄。一种特殊的探测物质为山羊中制得的通过异硫氰酸盐与荧光素交联的抗-兔抗体。蛋白质可用放射性元素或酶标记。放射性标记可用目前能得到的计数方法检测。较佳同位素可选自³H、¹⁴C、³²P、³⁵S、³⁶Cl、⁵¹Cr、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I和¹⁸⁶Re。

酶标记也同样有用，可用比色、分光光度计、荧光分光光度计、电流计或气体计量技术来测定。通过与桥连分子(如碳二亚胺、二异氰酸盐、戊二醛等)反应使酶与所选择的粒子交联。许多可用于这种方法的酶已经知道并采用了。较佳的是过氧化物酶、β-葡糖醛酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡糖氧化酶和过氧化酶及碱性磷酸酶。美国专利NO.3,654,090、3,850,752和4,016,043里还公开了其它的标记物质和方法。

术语“免疫活性”或“免疫原性”指由天然、重组或合成的肽诱导哺乳动物体内的特异性体液和/或细胞免疫应答的能力。本文所用的术语“抗原性氨基酸序列”、“抗原性多肽”或“抗原性肽”指可引发哺乳动物免疫应答的氨基酸序列，无论是单独或与辅助分子结合(如I或II类主要组织相容性抗原分子)。

本文所用的术语“免疫应答”包括细胞性和/或体液性免疫应答，它们足以抑制或防止感染；或防止或抑制由微生物(尤其是病原性微生物)导致的疾病的发作；和/或抑制、减少或防止肿瘤细胞的增生；和/或降低肿瘤细胞的数量或肿瘤的质量；和/或降低肿瘤性形成的可能性。

术语“抗原”和“表位”是本领域熟知的，指可由免疫系统的一种成分(如抗体或T细胞抗原受体)特异性识别的大分子的一部分。表位可由溶液中的抗体识别，如与其它分子相对游离。当表位与I或II类主要组织相容性复合物分子结合时，就可由T-细胞抗原受体识别表位。“CTL表位”就是当表位存在于与MHC I类分子结合的细胞表面上时，由细胞毒性T淋巴细胞(通常为CD8⁺细胞)识别的表位。

本文所用的术语“分离的”指描述处于与一种化合物的天然形成环境所不同的条件下的有关化合物(如重组病毒、肽等)。“分离的”包括在样本中一种有关化合物基本处于富集状态和/或在其中一种有关化合物有部分或基本上达到纯化的各种化合物。

包含本发明的重组杆状病毒的各种组合物

本发明还提供了包含本发明的重组杆状病毒的各种组合物(包括药用组合物)。

包含本发明的重组杆状病毒的各种组合物可以包含按重组杆状病毒的实际用途所选用的缓冲剂；还可包含适用于预定用途的其它物质。本领域技术人员都善于选择的缓冲剂，本领域已知有多种缓冲剂适用于预定用途。在有些实例中，该组合物可含有药学上可接受的赋形剂，本领域已知有多种而无需在此详细讨论。药学上可接受的各种赋形剂在多种出版物已有详述，包括如“Remington：药学和药学实践”，第19版(1995)Mack Publishing Co.。

可将药用组合物制备成各种剂型，如粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾、栓剂、透皮药物(如贴片等)、油膏、洗剂等。适用于口服或局部使用的药用级别的有机或无机载体和/或稀释剂，可用于配制包含治疗活性化合物的各种组合物。本领域已知的稀释剂包括水性介质、植物性和动物性油和脂肪。还可用稳定剂、润湿剂和乳化剂、改变渗透压的盐类或维持合适pH值的各种缓冲剂、和皮肤渗透增强剂等作为辅助性材料。

本发明的重组杆状病毒可用作免疫筛选针对E2蛋白的中和抗体。将本发明产生的E2蛋白注射入动物体内，可大量产生多克隆抗体，并可通过常规方法筛选单克隆抗体。通常，按本领域熟知的各种方法，用合适的药用载体和/或运载体配制本发明的疫苗。合适的载体是无菌盐水。为此也可使用其它水性和非水性等渗无菌注射液以及水性和非水性无菌悬浮液(已知都是药学上可接受的载体，也是本领域技术人员所熟知的)。

给出以下的实施例目的为说明本发明的各种具体实施方案，对本发明没有任何形式的限制。

实施例1重组杆状病毒的制备

1.重组供体质粒的构建：

如图1B所示，E2蛋白的编码序列来自NCBI(http;//www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站收录的HCV1b型丙肝病毒表面糖蛋白E2的基因序列，选取E2胞外区序列克隆。使用HCV1b的cDNA基因组为模板合成了其编码序列，其序列为SEQ ID NO：1。氨基酸序列如SEQ ID NO：2。将该序列利用限制性酶切重组克隆入转移载体pFastBacHTb(本实验室提供)的多克隆位点(凝血酶酶切位点)。该质粒中的Fc片段来源于pWS3(购自于Sigma公司)的Fc片段，其序列如SEQ ID NO：7中所示，见图1B。用正向引物5’-CCGCTCGAGACATGCCCACCGTGCCCA-3’(SEQ ID NO：3)和反向引物5’-CCCAAGCTTTTTACCCGGAGACAGGGA-3’(SEQ ID NO：4)从该质粒中克隆出Fc片段，并构建入pFastBac载体，在凝血酶酶切位点接头序列CTGGTGCCGCGCGGCTCT(SEQ IDNO：6)之后。该质粒还含有一信号肽序列，位于E2蛋白序列之前，其序列为ATGCTACTAGTAAATCAGTCACACCAAGGCTTCAATAAGGAACACACAAGCAAGATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCG(SEQID NO：5)。

质粒的构建步骤：

1.克隆E2胞外区全长序列

模板为来自上海巴斯德研究所的HCV1b的cDNA基因组，根据www.ncbi.nlm.nih.gov查找的E2基因序列，采用软件Primer Premier设计其胞外区引物。引物中引入凝血酶酶切接头。

正向引物：CGCGGATCCGAGACCCGTGTGACAGG(SEQ ID NO：8)

反向引物：CCGCTCGAGAGAGCCGCGCGGCACCAGCCATTTGATTGCA(SEQ ID NO：9)

反义引物中引入凝血酶切位点(Ler-Val-Pro-Arg-Gly-Ser)，直接与E2基因相联。

采用pfu聚合酶的PCR体系(50ul)进行PCR，条件为94℃ 5m预变性；94℃45s变性；60℃45s退火；72℃ 1m45s延伸；33个循环。琼脂糖PAGE胶浓度为1％(mg/ml)

2.E2的基因回收，基因回收后跑胶验证，证明得到了目的大小的单一的基因片段，BamHI & XhoI限制性内切酶37度酶切过夜，回收酶切基因片段。

3.pFastBacHTb载体(BamHI&XhoI)双酶切后回收

4.酶切基因与酶切载体10ul连接体系，16度连接5-8h

5.将连接产物转化DH5α，挑取6个克隆，进行菌液PCR验证。挑取阳性克隆株进行菌液的小量抽提。

该质粒图谱如图1A。

采用上海申能博彩生物技术有限公司提供的小量质粒快速抽提试剂盒，操作步骤如下：

(1)取菌液2-3ml，高速离心12000rpm，1min收集菌体。

(2)弃上清，加入100ul Solution I溶液，振荡至菌彻底悬浮。

(3)加入200ul SolutionII溶液，立即温和颠倒5-10次(即加一管混匀一管)，室温静置2min。

(4)加入400ul Solution III溶液，立即温和颠倒5-10次(即加一管混匀一管)，室温静置2min。

(5)15000rpm离心10min(无需低温离心)，上清移入3S吸附柱中，室温静置2min。

(6)12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中。

(7)在吸附柱中加入700ul Wash Solution溶液，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱入同一收集管中。

(8)重复步骤7一次

(9)12000rpm离心2分钟，尽量去除液体，倒掉收集管中的液体。

(10)将3S柱置于干净的1.5ml的离心管中，在3S柱的膜中央加入30ulTEsolution，55-65℃水浴放置2分钟，12000rpm离心1分钟，弃去3S柱，离心管中即为质粒，-20℃保存。

图3为pFastBacHTb载体双酶切后的基因割胶图，载体为5600bp，条带大小正确。

图4为E2基因割胶图，大小为1kb，条带大小正确。

图5为构建后的质粒转化DH5a，4个克隆菌液验证的结果，结果显示4个克隆均为阳性。

图6为小抽所得质粒37度过夜双酶切(BamHI&XhoI)，跑胶验证。结果显示所切得基因大小正确，即酶切位点正确无误。

2.重组黏粒的制备：

将获得的重组pFastBac载体通过基因重组的方式转化入大肠杆菌DH10Bac(来自生化细胞所王纲组)中，获得重组的宿主大肠杆菌细胞。

37度，摇床250rpm，培养大肠杆菌，使E2编码序列以及人源IgGFc序列在转座酶作用下重组入Bacmi黏粒的mini-attTn7位点。所述转座酶由大肠杆菌DH10Bac中携带的辅助质粒pMON7124提供。然后，大肠杆菌在Luria培养基上涂布培养。

挑取白斑菌落在含抗生素(筛选卡那霉素、庆大霉素和四环素抗性)LB培养扩增质粒，加入50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素筛选抗性菌株；37℃摇菌培养24h。高速离心收集菌液沉淀(14000g×1min)。

用300μl Solution I充分重悬沉淀；300μl Solution II至澄清，室温放置5min；300μl Solution III轻混至形成白色沉淀；置于冰上5-10min。

14000g离心10min，上清液转移至加入800μl异丙醇的EP管，轻轻混合，置于冰上5～10min。15min14000g离心，加入500μl 70％乙醇，14000g离心5分钟；重复步骤，尽可能多吸去上清夜置于空气中，40μlddH₂O溶解DNA，可存于-20℃。

3.重组杆状病毒的制备：

(1)悬浮细胞的驯化过程：

待贴壁培养的昆虫细胞Highfive(来自中科院生化细胞所王纲组)传至3代，细胞呈明显分裂相，视野清澈；收集贴壁细胞传至250ml血清瓶(转瓶)，细胞密度4×10⁵，终体积50ml；低温摇床，27度，130rpm，培养2-3天；将转瓶细胞移入10cm培养皿，水平静置5分钟，抱团细胞颗粒沉淀于培养皿底部；吸取上清悬浮细胞，重新置于250ml血清瓶，细胞密度4×10⁵，终体积50ml；低温摇床，27度，130rpm，培养2-3天；重复抱团细胞沉淀步骤3次，悬浮细胞可呈现单个细胞均匀分散的状态，从而大大提高感染效率。250ml转瓶细胞，于低速离心机，以960rpm离心4分钟，弃去上清；将细胞重悬，并以4×10⁵细胞密度传至3L大转瓶，终体积为400ml，于低温摇床27度，130rpm培养至2×10⁶细胞/ml。

(2)昆虫细胞的转染：

27度恒温培养箱培养上述驯化的昆虫细胞，细胞状态良好，传至六孔板(康宁公司)各孔9×10⁵细胞，贴壁时间大于1h；将上述步骤中所制得黏粒与脂质体Cellfectin^TM(英伟托金公司Invitrogen)混合，覆盖于六孔板昆虫细胞表面，结合5h；换液后，培养72h，收获上清即得病毒滴度为10⁷的第一代重组杆状病毒；裂解液(实验室自制，甘油(100％)30ml；Tris-Cl(pH6.8，1M)，15ml；EDTA，0.22g；SDS，6g；溴酚蓝0.03g；DTT 0.6mol/L)裂解胞浆，超声破碎细胞(工作4”，间歇3”，4个循环)，释放蛋白，western-blot检测目的蛋白的表达；将第一代重组杆状病毒再次感染贴壁细胞，48h后收取上清即得病毒滴度为10⁸的第二代重组杆状病毒，加入2％胎牛血清，避光保存于4度。第二代病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcNPV/E2-Fc于2009年4月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CTCC-V200909。

4.重组病毒成功包装的验证：

(1)黏粒成功重组的验证：

挑选3-5个纯白色阳性克隆，以M13通用引物对黏粒进行PCR验证，结果见图7。如步骤2所述抽提黏粒，50V，150min，0.8％琼脂糖凝胶(简恩泰克公司)，五组条带齐备；结果如图8所示。

(2)黏粒成功感染的验证：2-4管黏粒分别转染六孔板细胞，并观察感染状况，结果如图9所示。细胞感染后，体积增大并呈空泡透明状。

实施例2：E2-Fc蛋白的制备和验证

1.E2-Fc目的蛋白的表达：

250ml血清瓶培养实施例1中所得的驯化好的highfive细胞至密度为2×10⁶cells/ml；用所获第二代阳性病毒，感染血清瓶中悬浮细胞(M.O.I＝2)，于低温摇床27度，130rpm，培养72h，避免紫外线照射；于低速离心机，以2500rpm离心5分钟，上清即为扩增后病毒；将扩增后的病毒，感染细胞密度为2×10⁶的大瓶悬浮细胞(M.O.I＝4)，于低温摇床27度，130rpm，培养72h，避免紫外线照射；如上文所述观察到明显的感染表征后，收集大瓶细胞移至离心瓶，于低温离心机4度，以6000rpm离心20min；收集上清，经由0.45um滤膜过滤，再次收集上清，即得分泌表达的目的蛋白E2-Fc。

2.E2-Fc的纯化：

得到的E2-Fc蛋白由AKTA纯化仪(GE healthcare)过ProteinG柱(GEhealthcare)纯化得到，一步纯化即可得到较单一的目的大小条带，SDS-PAGE，western-blot验证条带的正确性。结果如图10(western-blot)和图11(SDS-PAGE)所示。

实施例3E2-Fc的生物学功能验证试验

E2-Fc蛋白和HCV天然E2结构蛋白的竞争性试验：

使用Huh7.5.1细胞模型(来自于上海生科院巴斯德研究所)培养HCV病毒(来自于上海生科院巴斯德研究所)，病毒分泌于细胞周围或者存在于胞内，同时，病毒表达HCV天然蛋白，例如E2结构蛋白。

在96孔板(corning)中接入上述Huh7.5.1细胞，(在P2实验室，37度，5％CO2条件下)培养HCV病毒，48h；用PBS润洗细胞3次后，加入2％多聚甲醛固定液使细胞固定，从而保留HCV天然蛋白E2。人抗-E2抗体(该抗体由美国Scripps研究所Denis Burton博士馈赠的含有人抗-E2抗体的细胞培养上清，1∶100倍稀释)分别与待检蛋白E2-Fc(0.15mg/ml)，不相关蛋白RBD-Fc(来自本实验室，浓度0.3mg/ml)(阴性对照)37度体外孵育1h，用PBS润洗固定细胞3次后，加入孵育混合物，之后用购自Invitrogen公司的山羊抗人的红色荧光标记的二抗(0.5ug/ml)进行检测。

试验结果如图12所示。非相关蛋白与天然HCV结构蛋白无竞争能力，所固定HCV蛋白牢固结合E2抗体，故显示强的荧光；E2-Fc蛋白与所固定HCV蛋白竞争结合E2抗体，显示为极弱的荧光。

试验结果如图12所示。非相关蛋白RBD-Fc与天然HCV结构蛋白无竞争能力，所固定HCV蛋白牢固结合E2抗体，故显示强的荧光；E2-Fc蛋白与所固定HCV蛋白竞争结合E2抗体，显示为极弱的荧光。

实验结果说明，E2-Fc与天然HCV结构蛋白E2形成竞争，抗E2特异性抗体对其有特异性，因此具有生物活性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>昆虫杆状病毒表达系统及用其表达E2蛋白的方法

<130>092115

<160>7

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>999

<212>DNA

<213>丙肝病毒(Hepatitis virus C)E2蛋白

<400>1

gagacccgtg tgacaggggg gcagatagcc agaaatgcct actcgctcac gaccctcttt     60

tcatctgggt cggctcagaa catccagctc ataaacacca acggtagctg gcacatcaac    120

aggactgccc tgaactgcaa tgactccctc aacaccgggt ttcttgccgc gctgttctac    180

acgcacaagt tcaacgcgtc cggatgtcca gagcgcttgg ccagctgccg ccccattgac    240

aagttcgatc aggggtgggg tcccatcact tatgctgagc agggcggcca ggaccagagg    300

ccttattgct ggcactacgc acctaaacca tgtggtattg tatccgcgtc gaaggtgtgt    360

ggtccagtgt attgtttcac cccaagccca gttgtagtgg ggacgaccga tcggttcggt    420

gtccctacgt atagctgggg ggagaatgag acagacgtgc tgctccttaa caacacgcgg    480

ccgccgcaag gcaactggtt cggctgtacg tggatgaacg gcactgggtt caccaagaca    540

tgcgggggcc ccccgtgtaa catcgggggg ggcggcaata acaccttgac ctgccctacg    600

gactgtttcc ggaagcaccc cgcggccact tacacaaaat gtggttcggg accttggctg    660

acacccaggt gcttggtaga ctacccatac aggctctggc actacccctg cactgccaac    720

tttaccatct tcaaggttag gatgtatgta gggggcgtgg agcacaggct cgatgctgca    780

tgcaattgga cccgagggga acgttgcaac ttggaggata gggatagatt ggagctcagc    840

ccgctactgc tgtctacaac agagtggcag gtgctgccct gttctttcac caccctaccg    900

gctctgtcca ctggtttaat tcatctccat cagaacatcg tggacgtgca atacctgtac    960

ggtatagggt cggcagttgt ttcctttgca atcaaatgg                           999

<210>2

<211>363

<212>PRT

<213>丙肝病毒E2蛋白(Hepatitis virus C)

<400>2

Glu Thr Arg Val Thr Gly Gly Gln Ile Ala Arg Asn Ala Tyr Ser Leu

1               5                   10                  15

Thr Thr Leu Phe Ser Ser Gly Ser Ala Gln Asn Ile Gln Leu Ile Asn

            20                  25                  30

Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp

        35                  40                  45

Ser Leu Asn Thr Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Thr His Lys Phe

    50                  55                  60

Asn Ala Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Pro Ile Asp

65                  70                  75                  80

Lys Phe Asp Gln Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr Ala Glu Gln Gly Gly

                85                  90                  95

Gln Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Lys Pro Cys Gly

            100                 105                 110

Ile Val Ser Ala Ser Lys Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro

        115                 120                 125

Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Val Pro Thr Tyr

    130                 135                 140

Ser Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu Leu Asn Asn Thr Arg

145                 150                 155                 160

Pro Pro Gln Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Gly Thr Gly

                165                 170                 175

Phe Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Gly Gly

            180                 185                 190

Asn Asn Thr Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Ala

        195                 200                 205

Ala Thr Tyr Thr Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys

    210                 215                 220

Leu Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Ala Asn

225                 230                 235                 240

Phe Thr Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg

                245                 250                 255

Leu Asp Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asn Leu Glu

            260                 265                 270

Asp Arg Asp Arg Leu Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu

        275                 280                 285

Trp Gln Val Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr

    290                 295                 300

Gly Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr

305                 310                 315                 320

Gly Ile Gly Ser Ala Val Val Ser Phe Ala Ile Lys Trp Asp Tyr Ile

                325                 330                 335

Val Ile Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ala Cys Leu

            340                 345                 350

Trp Met Met Leu Leu Ile Ala Gln Ala Glu Ala

        355                 360

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Fc正向引物

<400>3

ccgctcgaga catgcccacc gtgccca                                      27

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Fc反向引物

<400>4

cccaagcttt ttacccggag acaggga                                      27

<210>5

<211>114

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>信号肽序列

<400>5

atgctactag taaatcagtc acaccaaggc ttcaataagg aacacacaag caagatggta     60

agcgctattg ttttatatgt gcttttggcg gcggcggcgc attctgcctt tgcg          114

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>凝血酶酶切位点接头序列

<400>6

ctggtgccgc gcggctct                                                   18

<210>7

<211>223

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人IgG-Fc片段

<400>1

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

1               5                   10                  15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

            20                  25                  30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

        35                  40                  45

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

    50                  55                  60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65                  70                  75                  80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

                85                  90                  95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

            100                 105                 110

Set Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

        115                 120                 125

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

    130                 135                 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145                 150                 155                 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

                165                 170                 175

Asp Gly Pro Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

            180                 185                 190

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

        195                 200                 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

    210                 215                 220

<210>8

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>E2正向引物

<400>8

cgcggatccg agacccgtgt gacagg                                       26

<210>9

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>E2反向引物

<400>9

ccgctcgaga gagccgcgcg gcaccagcca tttgattgca                        40