一种三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥

摘要

本发明为一种三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥，是由三株地衣芽孢杆菌(BACILLUS LICHENIFORMIS)分别经过三级液体发酵达到放罐标准，再将上述的三株地衣芽孢杆菌经发酵所得的发酵液混合加工而成，所述的三株地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌BL-1 CGMCC No.1009菌株、地衣芽孢杆菌BL-8 CGMCC No.3925菌株和地衣芽孢杆菌BL-16 CGMCC No.1379菌株。本发明的有益效果为：本产品的活菌含量高，对小麦、玉米、水稻等多种作物具有很好的促生长增产、防虫防病作用，产品活菌在土壤中繁殖快、适应性强，可有效控制土传病害、虫害发生，提高土壤肥力，提高瓜菜含糖量。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物肥料领域，尤其涉及一种三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥。 

背景技术

随着人们生活水平的提高，农产品的安全性和品质受到前所未有的关注。病虫害生物防治与增产一直是农作物生长所关心的两大问题。近几年来，随着温室、大棚蔬菜种植面积的迅速扩大，霜霉病、枯萎病、根结线虫等病虫害的发生在逐年加重。黄瓜霜霉病是黄瓜生产中一种常发性严重病害，俗称“跑马病”，在适宜发病的环境下，病害发展极快，十几天内就可使植株枯死，一般减产20-50%，严重时整田毁灭，是世界范围内温湿性地区发生的重要病害；根结线虫寄主分布很广，我国各地均有发生。寄主植物较多，如黄瓜、丝瓜、苦瓜、冬瓜、西瓜、甜瓜、番茄、辣椒、茄子等多种作物，轻者减产10%左右，重者减产达60～70%，甚至造成全棚毁种。它不仅直接影响蔬菜作物的生长发育，还可通过根结线虫的危害，导致或加剧镰刀枯萎病的发生，促使植株快速死亡，给防治工作带来诸多困难。目前，防治方法仍是依靠化学农药防治，国内外还没有使用微生物活菌制剂能够有效防治霜霉病、枯萎病、根结线虫。化学农药用量加大，不仅严重污染环境和农产品安全，而且大量杀伤害虫天敌，引起农田生态平衡的恶性循环。 

生长素在植物体内普遍存在，虽含量极微，但它是植物生长所必需的物质，研究表明，合理的应用植物生长物质的生产效果甚至比栽培与育种快得多。玉米素即属于植物细胞分裂素类生长物质。专利查新表明，美国从嫩玉米中提取天然细胞分裂素-玉米素，60000kg嫩玉米中仅含有1g玉米素，产品成本极高、产量极低；在美国玉米素化学合成工艺繁杂，提取困难，化学试剂商店玉米素售价383美元每0.5mg，折合人民币76000元/g，因玉米素价格昂贵无法在农作物生产上使用，大多只有在盆栽上用于细胞分裂素作用机制方面的科学研究。本发明人通过大量筛选研究试验，发现地衣芽孢杆菌CGMCC No.1009能够分泌出植物细胞分裂素-玉米素，并申请了名称为“用于产生植物细胞分裂素的地衣芽孢杆菌及植物生长调节剂”发明专利，专利号 ZL200310114330.5。 

迄今为止，国内外尚未开发出具有防虫、防病、促生长、增产、提高果实品质多种功效的，同时可以保持生态平衡的农业上可以接受的低成本多效微生物菌肥。 

发明内容

本发明的目的是提供一种三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥，在保持生态平衡，降低成本的同时，具有防虫、防病、促生长、增产、提高果实品质的用途。 

本发明的目的是通过以下技术方案来实现： 

一种三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥，由三株地衣芽孢杆菌(BACILLUS LICHENIFORMIS)分别经过三级液体发酵达到放罐标准，再将上述的三株地衣芽孢杆菌经发酵所得的发酵液混合加工而成，所述的三株地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌BL-1 CGMCC No.1009菌株、地衣芽孢杆菌BL-8 CGMCC No. 3925菌株和地衣芽孢杆菌BL-16 CGMCC No.1379菌株。

所述的三株地衣芽孢杆菌的培养过程均包括以下步骤： 

1）首先，将地衣芽孢杆菌接种于斜面培养基中，在培养箱中培养24h，所获斜面菌种在0-4℃的温度下保存，在一年内使用，所述的斜面培养基的配方包括以下重量百分比的原料：葡萄糖1-3%，蛋白胨0.1-0.5%，酵母粉0.3-0.5%，牛肉膏0.3-0.7%，(NH₄)₂HPO₄ 0.3-0.5%，K₂HPO₂ 0.03-0.05%，MgSO₄·7H₂O 0.02-0.05%，NaCl 0.1-0.6%，MnSO4 0.001-0.003%，余量为水；

2）然后，将上一步所得菌种置于摇床的培养基中进行摇瓶培养24-30h，摇床转速为200转/min（rpm），所述的摇床的培养基的配方包括以下重量百分比的原料：葡萄糖2-6%，豆饼粉2-5%，棉饼粉1-3%，蛋白胨0.1-0.5%，酵母粉0.3-0.5%，牛肉膏0.3-0.7%，(NH₄)₂HPO₄ 0.3-0.5%，K₂HPO₂ 0.03-0.05%，MgSO₄·7H₂O 0.02-0.05%，NaCl 0.1-0.6%，MnSO4 0.001-0.003%，余量为水。

所述的三级液体发酵时的培养基的配方包括以下重量百分比的原料：葡萄糖2-6%，豆饼粉2-5%，玉米粉1-3%，棉饼粉1-3%，蛋白胨0.1-0.5%，酵母粉0.3-0.5%，牛肉膏0.3-0.7%，(NH₄)₂HPO₄ 0.3-0.5%，K₂HPO₂ 0.03-0.05%，MgSO₄·7H₂O 0.02-0.05%，NaCl 0.1-0.6%，MnSO4 0.001-0.003%，余量为水。 

所述的三级液体发酵包括以下步骤： 

1）一级液体发酵：将培养基加入小型发酵罐中进行高温灭菌，灭菌温度为121℃，压力为1.0kg/cm²，保压30min，pH值控制在消毒前为7.5，消毒后为6.5，待温度为35℃时往其中接种摇瓶培养后所获得菌液体积的3%，发酵时罐压为0.2kg/cm²，通气量为1:0.8v/v/min，比例符号前面的数字1代表发酵罐的体积，后面的数字代表通入空气的体积，培养24-30h，作为一级种子液；

2) 二级液体发酵:对中型发酵罐、小型发酵罐与中型发酵罐接种管道进行消毒，进气阀内压力为1.2kg/cm²，保压30min，然后冷却，发酵控制条件同上一步，得到二级种子液；

3）三级液体发酵：将二级种子液按1:100的比例压到大型发酵罐中，通气量为1:0.8v/v/min，培养66－72h，当检查无杂菌，95％以上的菌体形成芽孢，即可终止培养。

所述的地衣芽孢杆菌BL-1菌株的培养、三级液体发酵过程中采用的温度为35±1℃，停止发酵，用液相色谱仪（HPLC）检测的玉米素含量≥10ppm作为放罐标准。 

所述的地衣芽孢杆菌BL-8菌株的培养、三级液体发酵过程中采用的温度为37±1℃，停止发酵，用血球计数板方法检测的芽孢含量≥50亿/mL作为放罐标准。 

所述的地衣芽孢杆菌BL-16菌株的培养、三级液体发酵过程中采用的温度为32±1℃，停止发酵，用血球计数板方法检测的芽孢含量≥100亿/mL作为放罐标准。 

所述的三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥，活菌含量≥50亿/mL，玉米素含量≥8μg/mL。 

本发明的有益效果为：微生物农药杀菌剂地衣芽孢杆菌BL-16菌株，对多种作物、蔬菜瓜果、花卉等植物真菌性、细菌性病害具有很好的防治作用（例如：枯萎病、霜霉病、青枯病、软腐病等）；天然植物生长调节剂地衣芽孢杆菌BL-1菌株，含有以植物细胞分裂素-玉米素为主的多种促植物生长物质，具有促进叶绿素形成，增强光合作用，刺激植物细胞分裂，加速植物新陈代谢和蛋白质合成，促使作物早熟丰产，增加瓜菜的含糖量，提高植物抗病抗衰抗寒能力；微生物农药杀虫剂地衣芽孢杆菌BL-8菌株，对多种蔬菜瓜果根结线虫具有很好的防治作用，对白粉虱、棉铃虫、烟青虫、小菜蛾具有很好的趋避作用；本产品的活菌含量高，施入土壤后，活菌生长发育快，适应性强，很快得到繁殖，迅速增加根际土壤的有益微生物菌群，促进植物根系营养快速吸收，提高土壤肥力，增强土壤渗水、保水、透气性，促进根系营养快速吸收，促使瓜果早熟丰产，提高果品质量；本发明对蔬菜瓜果、大田作物、园林花卉等多种植物具有很好的促生长增产、防虫防病作用；产品对人体安全，不污染环境。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。 

实施例1 

本发明实施例所述的一种三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥，由地衣芽孢杆菌BL-1 CGMCC No.1009菌株、地衣芽孢杆菌BL-8 CGMCC No. 3925菌株和地衣芽孢杆菌BL-16 CGMCC No.1379菌株分别经过三级液体发酵达到放罐标准，再将上述的三株地衣芽孢杆菌经发酵所得的发酵液混合加工而成。

所述的三株地衣芽孢杆菌的培养过程均包括以下步骤： 

1）首先，将地衣芽孢杆菌接种于第一培养基中，在培养箱中培养24h，所获斜面菌种在0-4℃的温度下保存，在一年内使用，所述的培养基的配方包括以下重量百分比的原料：葡萄糖2%，蛋白胨0.3%，酵母粉0.4%，牛肉膏0.5%，(NH₄)₂HPO₄ 0.4%，K₂HPO₂ 0.04%，MgSO₄·7H₂O 0.04%，NaCl 0.4%，MnSO₄ 0.002%，余量为水（补足100%）；

2）然后，将上一步所得菌种置于摇床的培养基中进行摇瓶培养24-30h，摇床转速为200rpm，所述的摇床的培养基的配方包括以下重量百分比的原料：葡萄糖3%，豆饼粉3%，棉饼粉2%，蛋白胨0.3%，酵母粉0.4%，牛肉膏0.5%，(NH₄)₂HPO₄ 0.4%，K₂HPO₂ 0.04%，MgSO₄·7H₂O 0.04%，NaCl 0.4%，MnSO₄ 0.002%，余量为水。

所述的三级液体发酵包括以下步骤： 

1）一级液体发酵：将培养基加入500L种子发酵罐中进行高温灭菌，灭菌温度为121℃，压力为1.0kg/cm²，保压30min，pH值控制在消毒前为7.5，消毒后为6.5，待温度为35℃时往其中接种摇瓶培养后所获得菌液体积的3%，发酵时罐压为0.2kg/cm²，通气量为1:0.8v/v/min，比例符号前面的数字1代表发酵罐的体积，后面的数字代表通入空气的体积，培养24h，作为下一步骤的菌种源；

2) 二级液体发酵:对4000L种子发酵罐、500L种子发酵罐与4000L种子发酵罐接种管道进行消毒，进气阀内压力为1.2kg/cm²，保压30min，然后冷却，发酵控制条件同上一步，得到下一步骤的菌种源；

3）三级液体发酵：使用步骤2的菌种液作为菌种源，按1:100的比例压到20000L种子发酵罐中，通气量为1:0.8v/v/min，每小时登记一次罐温、通气量、罐压，在接种后12h开始，每4h取样进行镜检，测定玉米素含量、pH值，总共培养70h，当检查无杂菌，95％以上的菌体形成芽孢，即可终止培养。

所述的三级液体发酵时的培养基的配方包括以下重量百分比的原料：葡萄糖5%，豆饼粉3%，玉米粉2%，棉饼粉2%，蛋白胨0.3%，酵母粉0.5%，牛肉膏0.5%，(NH₄)₂HPO₄ 0.4%，K₂HPO₂ 0.034%，MgSO₄·7H₂O 0.03%，NaCl 0.5%，MnSO4 0.002%，余量为水（补足100%）。 

所述的地衣芽孢杆菌BL-1菌株的培养、三级液体发酵过程中采用的温度为35±1℃，三级液体发酵以镜检测的玉米素含量≥10ppm（10 μg/mL）作为放罐标准。 

所述的地衣芽孢杆菌BL-8菌株的培养、三级液体发酵过程中采用的温度为32±1℃，三级液体发酵以镜检测的芽孢含量≥50亿/mL作为放罐标准。 

所述的地衣芽孢杆菌BL-16菌株的培养、三级液体发酵过程中采用的温度为37±1℃，三级液体发酵以镜检测的芽孢含量≥100亿/mL作为放罐标准。 

所述的三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥，活菌含量≥50亿/mL，玉米素含量≥8μg/mL。 

本发明所述的地衣芽孢杆菌BL-1于2003年9月24日送往中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其建议的分类名称为地衣芽孢杆菌(BACILLUS LICHENIFORMIS)，其登记入册编号为CGMCC No.1009，该菌种特性：细胞杆状，革兰氏阳性，大小为 0.8×1.5-3.5μm , 产生近中生的椭圆状芽孢，孢囊稍膨大。细胞内无聚-β-羚基丁酸盐 ( PHB ）颖拉．在肉汁培养基上的菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，24 h后菌落直径为 3 mm。产生乙酰甲基甲醉（ V-P应阳性），pH5.4。接触酶阳性。卵磷脂阵阳性，还原硝酸盐。在 7 % NaCl和 pH5.7 中生长，营兼性厌氧生活。从葡萄糖、木糖和甘露酵产酸，但不从阿拉伯糖产酸。石蕊牛奶呈还原胨化反应，分解淀粉和酪素，并消耗柠稼酸盐；所述的地衣芽孢杆菌BL-8于2010年6月17日送往中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其建议的分类名称为地衣芽孢杆菌(BACILLUS LICHENIFORMIS)，其登记入册编号为CGMCC No.3925，该菌种特性：同所述的地衣芽孢杆菌BL-1；所述的地衣芽孢杆菌BL-16于2010年5月27日送往中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其建议的分类名称为地衣芽孢杆菌(BACILLUS LICHENIFORMIS)，其登记入册编号为CGMCC No.1379，该菌种特性：同所述的地衣芽孢杆菌BL-1。 

毒性试验： 

试验单位：河北省卫生检测中心

表1 多效微生物菌肥的安全性试验结果

毒性试验表明：地衣芽孢杆菌对人体安全、无害。地衣芽孢杆菌已被列为益生菌，可供食用。

应用例1 

北京市农林科学院植保环保研究所对黄瓜大棚进行了试验。使用实施例1中获得的三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥，将其分别稀释300倍、400倍、500倍后，按每亩施用30kg稀释液的施用量均匀喷洒在黄瓜及叶片上。统计其产量，同时以喷洒清水和使用市面上购来的植物生长调节进剂“云大120” 2000倍作为对照。结果如表2所示：

表2 多效微生物菌肥对黄瓜产量的影响

从表2可以看出，本发明的多效微生物菌肥对黄瓜有很好的促进生长作用，增产幅度最高可达34.8％，表2中数字为4次重复平均值，可在黄瓜定植缓苗后第一次施药，从初花期开始，每隔7天喷施1次，连续喷4次；施药浓度以300倍至400倍为宜。

应用例2 

江苏省农药检定所试验对黄瓜大棚进行了试验。使用实施例1中获得的三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥，将其分别稀释500倍、400倍、300倍后，按每亩施用30kg稀释液的施用量喷洒在黄瓜植株的叶子上，每隔7天喷洒一次，统计其产量，同时以喷洒清水和使用助壮素稀释300倍作为对照。结果如表3所示：

表3 多效微生物菌肥对黄瓜霜霉病和炭疽病抑制效果

从表3可以看出，本发明的多效微生物菌肥稀释300倍液对黄瓜霜霉病和炭疽病具有很好的抑制作用，最好的抑制率可达到64.1%，对白粉病也有同样的抑制效果。

应用例3 

中国农科院郑州果树研究所对金帅苹果进行了试验，使用实施例1中获得的三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥，将其分别稀释400倍、300倍、200倍后，按每亩施用45kg稀释液的施用量喷洒在苹果及叶片上，幼果初期，果实膨大期各喷一次。在幼果初期喷洒前用卡尺测量果实直径、横径并记录，喷洒后用测量果实直径、横径并记录，在果实膨大期（约幼果初期喷洒日2周）进行第二次喷施后再次测量果实直径、横径并记录。结果如表4所示：

表4 多效微生物菌肥对金帅苹果果实增长的影响

从表4可以看出施用各浓度的本发明的菌肥均比对照果实增长快，本发明的菌肥稀释300倍效果最好，直径增长率比对照增长35.86％，稀释400倍次之，稀释200倍增长稍慢。

应用例4 

河北省廊坊市植保植检站对实施例1中获得的三株地衣芽孢杆菌制作的多效微生物菌肥（粉剂）在番茄根结线虫上进行防治试验，共设5个处理，本发明的菌肥20kg/亩、25 kg /亩、30kg/亩、6%奥罗蒎兹微乳剂和1.8%阿维菌素，第一次施药后2个月进行调查并记录结果，然后第二次施药后1个月内再次进行调查并记录结果。结果如表5所示：

表5 多效微生物菌肥防治温室番茄根结线虫病药效调查

从表5可以看出，在第一次施药后2个月本发明的菌肥20kg/亩、25kg/亩、30kg/亩、6%奥罗蒎兹微乳剂和1.8%阿维菌素的防效依次为62.9%、70.3%、77.6%、71%、64%；第二次施药1个月后的防效依次为70.4%、76.9%、84.9%、80.2%、71.2%。第一次施药2个月后，各处理均有线虫病发生，本发明的菌肥（粉剂）30kg/亩和6%奥罗蒎兹微乳剂750克/亩的防效较高，分别为77.6%和71%；第二次施药一个月后，本发明的菌肥（粉剂）30kg/亩制剂量处理的防效达到84.9%，有效抑制了根结线虫的发生及危害。

将本发明的微生物菌肥（水剂）产品按照与应用例1相同的稀释倍数和施用方法分别在新疆、北京、山东、河南、云南浙江、江苏、山西、内蒙、河北、吉林、黑龙江、广西、海南、福建等地进行了田间试验示范，试验结果表明：该产品对小麦、玉米、水稻、大豆、花生、棉花、苹果、香梨、荔枝、桂圆、芒果、柑橘、葡萄、香蕉、西瓜、甜瓜、番茄、黄瓜、辣椒、茄子、甘蓝、人参、茶叶、烟叶、啤酒花、苜蓿、月季花、海棠花、草坪、银杏树、油松等多种植物均有很好的促生长、防虫、防病、增产作用，同时产品活菌在土壤中繁殖快、适应性强，迅速增加根际土壤的有益微生物菌群，有效控制土传病害、虫害发生。