破伤风毒素受体结合区Hc在大肠杆菌中的高效表达及应用

摘要

本发明涉及一种通过核苷酸序列优化使破伤风毒素受体结合区Hc在大肠杆菌中获得高效可溶性表达的方法。根据国内破伤风梭菌C.Tetani强毒株CMCC64008株的测序结果，对破伤风毒素受体结合区Hc序列进行分析优化，优化后的序列如SEQ ID No.1，其编码的蛋白序列如SEQ ID No.2。合成后的Hc基因经双酶切后连接入表达载体pET32a(+)中，重组Hc在大肠杆菌中获得了可溶性高表达，目的蛋白占碎菌上清总蛋白的约46％。经QFF柱、苯基疏水柱和SP柱三步纯化后，目的蛋白纯度可达95％以上，得率在300mg/L以上。通过本发明的方法制备的重组蛋白具有很好的免疫原性，能够诱导小鼠产生高滴度保护性抗体，抵御高剂量致死毒素的攻击。本发明在破伤风毒素重组亚单位疫苗Hc的大规模高效制备中具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域：

本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及一个破伤风毒素受体结合区Hc基因及其编码蛋白以及作为亚单位疫苗在破伤风预防方面的应用。

技术背景：

破伤风是一种严重危害人民生命健康的疾病，它是由革兰氏阳性、厌氧的梭状芽胞杆菌——破伤风杆菌侵入人体伤口、生长繁殖、产生破伤风毒素引起的一种急性特异性感染，破伤风毒素入侵神经系统可导致人全身性肌肉痉挛，进而全身性衰竭或窒息死亡。一切开放性损伤，均有发生破伤风的可能。破伤风毒素的毒性非常强烈，仅次于肉毒毒素，约100ng的破伤风毒素便可以致人死亡。破伤风在广大贫困落后的第三世界国家和地区非常严重。据估计，世界上每年约有100万病例发生，死亡率在50％左右。在发展中国家，新生儿破伤风死亡率高达90％。寻找高效、安全的破伤风预防和治疗药物是各国致力的方向。

破伤风毒素全长1315个氨基酸，分子量为150kD，共由A、B、C三部分组成，每部分分子量均为50kD。C片段是重链的C端，具有结合神经细胞的作用。B片段是重链的N端，具有导入作用。A片段是轻链，有蛋白酶活性，可抑制神经传递物质的释放，具有麻痹作用。传统的类毒素疫苗是破伤风毒素经甲醛脱毒、铝佐剂吸附精制而成的，虽然其免疫效果较好，但仍存在一些问题：接种类毒素后有一定的副反应发生；破伤风梭菌可形成芽孢形式，毒性高，生产疫苗有一定危险性；甲醛处理类毒素容易造成污染；化学处理后的类毒素可能发生毒性逆转；而且重要的是免疫期短，随着年龄的增长，对破伤风免疫力下降，儿童需要4～6年加强免疫，成人需要每10年加强一次免疫。因此，现有的类毒素疫苗还需进一步改进和发展，而开发新型的基因工程疫苗是方向之一。实验已证实用完整的毒素分子进行免疫并不是必需的。破伤风天然C片段(Hc)保留了完整毒素与神经节苷脂结合等许多性质，免疫效价与毒素相当，无毒性，过敏原性低，是将来发展亚单位疫苗和基因工程疫苗的候选者，已被用于研究亚单位疫苗、细菌和病毒载体疫苗、粘膜疫苗等很多方面。

用大肠杆菌表达抗破伤风毒素的亚单位疫苗具有重要的意义，其工艺简单，重组的Hc蛋白不用担心被完整毒素所污染，其安全性较高，但目前表达的破伤风Hc片段普遍存在表达量较低，易形成包涵体，免疫效价较低等缺点，这是因为Hc序列中AT含量丰富且存在大量的大肠杆菌稀有密码子，这在一定程度上限制了它的表达。国内外许多研究者对破伤风Hc段的表达进行了改进，表达量得到了一定的提高，但仍达不到大量生产的需求，且制备得到的Hc免疫原性与传统类毒素疫苗相比也较低。

为了解决这个问题，本研究拟采用序列及载体优化等手段，对国内破伤风强毒株CMCC64008株(GeneBank No：AF154828)的Hc片段序列进行优化，通过在大肠杆菌中的可溶性高表达制备具有天然构象的亚单位疫苗，并对该疫苗的免疫剂量、免疫效价、保护效果等方面进行研究并进一步探索Tet-Hc作为亚单位疫苗可行性，为下一步深入制备破伤风Hc亚单位疫苗奠定基础。

发明内容：

本发明的目的是提供一个经优化后可以在大肠杆菌中进行高效可溶性表达且能够激发机体对破伤风毒素产生免疫保护作用的破伤风毒素受体结合区Hc基因及其编码蛋白在破伤风亚单位疫苗中的应用。

本发明所提供的破伤风毒素受体结合区Hc基因，名称为Tet-Hc，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID No.1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID No.2的DNA序列；

3)与序列表中SEQ ID No.1限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有激发机体对破伤风毒素产生免疫保护作用的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No.1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID No.1由1353个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1353碱基，编码具有序列表中SEQ ID No.2的氨基酸残基序列的蛋白质。

所述破伤风毒素受体结合区Hc基因编码的蛋白Tet-Hc，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID No.2；

2)将序列表中SEQ ID No.2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有激发机体对破伤风毒素产生生免疫保护作用的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO.2由451个氨基酸残基组成。

所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以使非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。

含有本发明基因Tet-Hc的转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

以pET32a为载体，构建的含有破伤风毒素受体结合区Hc基因Tet-Hc和硫氧还蛋白基因Trx的重组原核表达载体为pET32a-Tet-Hc。

本发明还提供了一种表达上述破伤风毒素受体结合区Hc基因编码蛋白Tet-Hc的方法。

本发明所提供的表达上述破伤风毒素受体结合区Hc基因编码蛋白Tet-Hc的方法是将上述含有破伤风毒素受体结合区Hc基因Tet-Hc的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到破伤风毒素受体结合区Hc基因编码蛋白Tet-Hc。

所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。

所述大肠杆菌可为E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)pLysS或E.coliTop10等。

上述重组均可按照常规方法构建。

培养含有破伤风毒素受体结合区基因Tet-Hc的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。其中，培养所述重组大肠杆菌时需加入诱导剂，如IPTG等，所加入IPTG的浓度为0.1-1.0mM，优选为0.2mM，诱导温度为16-37℃，优选为28℃，诱导时间为2-8h，优选为6h。

本发明提供了一种破伤风毒素受体结合区Hc基因编码蛋白Tet-Hc的纯化方法，可通过QFF柱、苯基疏水柱和SP柱三步纯化获得较高纯度的无标签蛋白。

本发明的破伤风受体结合区Hc基因所编码的蛋白可用于制备破伤风毒素亚单位疫苗。

需要的时候，以破伤风毒素受体结合区Hc基因编码蛋白制备的破伤风亚单位疫苗还可以融入颗粒白细胞-巨噬细胞集落刺激剂因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)、TGF-β4等一种或多种细胞因子的基因或蛋白质作为分子免疫佐剂。

本发明的疫苗可以制成注射液、干粉针剂或喷雾剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

上述亚单位疫苗的用量可采用药学领域中亚单位疫苗的常规剂量，如1-10μg，并可根据实际情况调整。

本发明提供了一种通过核苷酸序列优化使破伤风毒素重组疫苗Hc在大肠杆菌中获得高效可溶性表达的方法。根据国内破伤风梭菌C.Tetani强毒株CMCC64008株的测序结果(GeneBank No：AF154828)，对451Aa的破伤风毒素Hc序列进行分析优化，采用大肠杆菌常用密码子替换稀有密码子，并使优化后序列的AT含量由72.57％降低为52.47％，优化后的序列如SEQ ID No.1，其编码的蛋白序列如SEQ ID No.2。在Hc序列的两端分别加入EcoRI和XhoI酶切位点，进行全基因合成。合成后的基因经双酶切后连接入表达载体pET32a(+)中，重组Hc在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性高表达，目的蛋白占碎菌上清总蛋白的约46％，并且能够与破伤风马抗毒素发生特异性的结合。经QFF柱、苯基疏水柱和SP柱三步纯化后，目的蛋白纯度可达95％以上，得率在300mg/L以上。通过本发明的方法制备的重组蛋白具有很好的免疫原性，能够诱导小鼠产生高滴度保护性抗体，抵御高剂量致死毒素的攻击。本发明在破伤风毒素重组亚单位Hc的大规模高效制备中具有广阔的应用前景。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为破伤风毒素受体结合区Hc蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的可溶性表达的SDS-PAGE蛋白电泳图及western-blot鉴定图。其中M为蛋白分子量标准；1为表达Hc的BL21(DE3)碎菌上清；2为空载体碎菌上清。

图2为经QFF柱、苯基疏水柱和SP柱三步纯化后得到的Hc的SDS-PAGE蛋白电泳图。

图3为不同剂量的Hc蛋白免疫BALB/c小鼠后检测血清中的抗体滴度。

图4为不同程度稀释的Hc免疫后血清对Tet-Hc和神经节苷酯GT1b结合的抑制作用。

具体实施方式：

实施例一、破伤风毒素亚单位疫苗Hc的序列优化、

根据国内破伤风梭菌C.Tetani强毒株64008株的测序结果(GeneBank序列号：AF154828)，对451Aa的Tet-Hc序列进行分析优化(优化前后序列比较如下)，采用大肠杆菌常用密码子替换稀有密码子，并使优化后序列的AT含量由72.57％降低为52.47％。在Tet-Hc序列的两端分别加入EcoRI和XhoI酶切位点，并在起始密码子前加入TAA终止密码子以终止载体pET32a(+)上Trx蛋白的表达，进行全基因合成。

Hc序列优化前后比较：

优化前AAAAATCTGGATTGTTGGGTTGATAATGAAGAAGATATAGATGTTATATTAAAAAAGAGT

优化后AAAAACCTTGATTGTTGGGTCGACAACGAAGAAGACATCGATGTTATCCTGAAAAAGTCT

优化前ACAATTTTAAATTTAGATATTAATAATGATATTATATCAGATATATCTGGGTTTAATTCA

优化后ACCATTCTGAACTTGGACATCAACAACGATATTATCTCCGACATCTCTGGTTTCAACTCC

优化前TCTGTAATAACATATCCAGATGCTCAATTGGTGCCCGGAATAAATGGCAAAGCAATACAT

优化后TCTGTTATCACATATCCAGATGCTCAATTGGTGCCGGGCATCAACGGCAAAGCTATCCAC

优化前TTAGTAAACAATGAATCTTCTGAAGTTATAGTGCATAAAGCTATGGATATTGAATATAAT

优化后CTGGTTAACAACGAATCTTCTGAAGTTATCGTGCACAAGGCCATGGACATCGAATACAAC

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优化后GACATGTTCAACAACTTCACCGTTAGCTTCTGGCTGCGCGTTCCGAAAGTTTCTGCTTCC

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优化后CACCTGGAACAGTACGACACTAACGAGTACTCCATCATCAGCTCTATGAAGAAATACTCC

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优化后CTGTCCATCGGCTCTGGTTGGTCTGTTTCCCTGAAGGGTAACAACCTGATCTGGACTCTG

优化前AAAGATTCCGCGGGAGAAGTTAGACAAATAACTTTTAGGGATTTATCTGATAAATTTAAT

优化后AAAGACTCCGCGGGCGAAGTTCGTCAGATCACTTTCCGCGACCTGTCTGACAAGTTCAAC

优化前GCTTATTTAGCAAATAAATGGGTTTTTATAACTATTACTAATGATAGATTATCTTCTGCT

优化后GCGTACCTGGCTAACAAATGGGTTTTCATCACTATCACTAACGATCGTCTGTCTTCTGCT

优化前AATTTGTATATAAATGGAGTACTTATGGGAAGTGCAGAAATTACTGGTTTAGGAGCTATT

优化后AACCTGTACATCAACGGCGTTCTGATGGGCTCCGCTGAAATCACTGGTCTGGGCGCTATC

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优化后CGTGAGGACAACAACATCACTCTTAAGCTGGACCGTTGCAACAACAACAACCAGTACGTA

优化前TCTATTGATAAATTTAGGATATTTTGCAAAGCATTAAATCCAAAAGAGATTGAAAAATTA

优化后TCCATCGACAAGTTCCGTATCTTCTGCAAAGCACTGAACCCGAAAGAGATCGAAAAACTG

优化前TACACAAGTTATTTATCTATAACCTTTTTAAGAGACTTCTGGGGAAACCCTTTACGATAT

优化后TATACCAGCTACCTGTCTATCACCTTCCTGCGTGACTTCTGGGGTAACCCGCTGCGTTAC

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优化后GACACCGAATATTACCTGATCCCGGTAGCTTACAGCTCTAAAGACGTTCAGCTGAAAAAC

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优化后CTAAGAGTAGGTTACAACGCTCCGGGTATCCCGCTGTACAAAAAAATGGAAGCTGTTAAA

优化前TTGCGTGATTTAAAAACCTATTCTGTACAACTTAAATTATATGATGATAAAGATGCATCT

优化后CTGCGTGACCTGAAAACCTACTCTGTTCAGCTGAAACTGTACGACGACAAAGATGCTTCT

优化前TTAGGATTAGTAGGTACCCATAATGGTCAAATAGGCAACGATCCAAATAGGGATATATTA

优化后CTGGGTCTGGTTGGCACCCACAACGGTCAGATCGGTAACGACCCGAACCGTGACATCCTG

优化前ATTGCAAGCAACTGGTACTTTAATCATTTAAAAGATAAAACTTTAACATGTGATTGGTAC

优化后ATCGCTTCTAACTGGTACTTCAACCACCTGAAAGACAAAACCCTGACCTGCGACTGGTAC

优化前TTTGTACCTACAGATGAAGGATGGACAAATGAT

优化后TTCGTTCCGACCGATGAAGGTTGGACCAACGAC

实施例二、破伤风毒素亚单位疫苗Hc表达载体构建

将优化合成后的Tet-Hc基因用EcoRI和XhoI双酶切后，连接入同样用EcoRI和XhoI双酶切后的表达载体pET32a(+)上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，37℃培养过夜。次日挑取单克隆于5mL LB(Amp+)培养基中，37℃，220rpm培养12h，提取质粒，EcoRI和XhoI双酶切鉴定目的基因的插入，并送测序。测序正确的质粒命名为pET32a-Tet-Hc。实施例三、破伤风毒素重组亚单位疫苗Hc的大肠杆菌表达及western-blot鉴定

正确连接入Tet-Hc基因的pET32a(+)载体，转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，挑取单克隆于5mL LB(Amp+)液体培养基中，37℃，220rpm培养至OD600nm≌0.6时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，28℃，220rpm继续培养6h。5,000g，4℃离心收集菌体，用PBS重悬后超声碎菌。12,000g，4℃离心取上清，行SDS-PAGE电泳，以空载体表达产物为对照，鉴定大小为50KD的Hc蛋白的表达。

Western-blot分析Tet-Hc与鼠抗破伤风单克隆抗体的特异性结合。将含有Tet-Hc蛋白的超声碎菌上清及空载体碎菌上清行SDS-PAGE蛋白电泳后，蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用含3％BSA的PBS室温封闭1h后，加入1∶1000稀释的小鼠抗破伤风单克隆抗体，37℃反应1h。将膜用PBST洗涤4遍后，加入1∶5000稀释的辣根酶标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应1h后PBST洗涤4遍，采用化学发光法显色、压片、曝光。

从图1的实验结果可以看到，与空载体对照相比，转化有pET32a-tet-Hc质粒的菌株在50KD左右有明显的条带，western-bolt结果证实该蛋白可与鼠抗破伤风单克隆抗体发生特异性的结合，说明该条带即为Hc目的条带。经薄层扫描分析目的蛋白约占碎菌上清总蛋白的46％，说明Tet-Hc蛋白在大肠杆菌中得到了高效可溶性表达。

实施例四、破伤风毒素亚单位疫苗Hc的大肠杆菌发酵及纯化

表达Hc蛋白的种子液1L，转接入30L发酵罐中，培养至OD600nm≌0.6时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，28℃，300rpm继续培养6h。10,000g，4℃离心收集菌体，用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)重悬后匀浆碎菌。20,000g，4℃离心收集上清。上清液过QFF柱进行阴离子交换，用20mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)平衡后，用含0-0.5M NaCl的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱。含有目的蛋白的洗脱液加入终浓度为0.5M的(NH₄)₂SO₄后，过苯基疏水柱进行下一步纯化。目的蛋白用含浓度0.5-0M的(NH₄)₂SO₄的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱。含有目的蛋白的洗脱液用脱盐柱置换缓冲液为20mM NaAc(pH4.0)后，过SP柱进行阳离子交换，目的蛋白用含0-0.5M NaCl的20mM NaAc(pH 4.0)缓冲液进行梯度洗脱。经过三步纯化后，无标签的目的蛋白Hc得到了很好的纯化，纯度可达95％以上(图2)，得率在300mg/L以上，目的蛋白最终保存在PBS缓冲液中。

实施例五、Tet-Hc的免疫原性研究

不同剂量的Hc蛋白1μg、5μg和10μg/只，免疫6-8周龄Balb/c小鼠，每两周免疫一次，共免疫三次，第一次采用福氏完全佐剂，第二第三次采用福氏不完全佐剂，每次免疫后两周、下一次免疫前取血检测血清中的抗体滴度；抗体滴度的测定采用ELISA的方法，破伤风类毒素1μg/mL，100μL/孔包被96孔酶联板，4℃包被过夜。PBST洗涤4次，5min/次。将抗血清用PBST从1∶100依次倍比稀释后，加入酶联板中，37℃反应1h，同时设PBS免疫后的血清为对照。PBST洗涤4次，5min/次。加入HRP-抗小鼠鼠二抗，37℃反应30-40min。加入TMB显色液，50μL/孔，显色后用2M H₂SO₄终止，酶标仪450nm/测定光吸收值。以加入阴性对照血清孔的显色值为对照，以OD450nm大于0.1且高于阴性孔2倍为阳性稀释滴度。从实验结果可以看到，Hc组的抗体滴度基本在1∶200,000以上，均高于文献报道。而抗原的免疫剂量与抗体滴度基本无关，1μg的Hc便可诱导小鼠产生较高的抗体滴度。

实施例六、免疫后血清的体外生物学活性研究

神经节苷酯GT1b是破伤风毒素通过Hc结构域与神经细胞结合的受体之一，我们通过竞争ELISA的方法检测了含有中和性抗体的Hc免疫小鼠后的血清对Tet-Hc和GT1b结合的抑制作用。将GT1b用甲醇稀释至终浓度为2μg/mL后4℃包被96孔酶联板过夜。将Hc免疫后的小鼠血清用PBST做不同程度的稀释后与等体积的2μg/mL的Tet-Hc在37℃混合孵育30min，加入包被有GT1b且洗涤过的96孔板，37℃反应1h，以PBST与Tet-Hc混合孔作为对照。PBST洗涤4次后，加入1∶100稀释的人抗破伤风多抗血清，100μL/孔，37℃反应1h。PBST洗涤4次，加入1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG二抗，37℃反应40min后，加入TMB显色，并用2M H₂SO₄终止，OD450nm读取吸光值。按以下公式计算抑制率：抑制率＝(1-试验孔OD450nm/Hc对照孔OD450nm)×100％

从图4的实验结果可以看出不同程度稀释的免疫血清均能不同程度地抑制Tet-Hc与受体神经节苷酯GT1b的结合，说明Tet-Hc免疫后的小鼠血清中含有具有体外生物学活性的中和性抗体。随着血清稀释倍数的增大，中和抗体含量逐渐减少，抑制作用逐渐减弱。

实施例七、Hc蛋白作为亚单位疫苗对小鼠的保护效果

三次免疫后进行破伤风毒素攻击实验，将2×10³LD₅₀剂量的破伤风毒素溶于0.5mL的硼酸盐缓冲液中，腹腔注射进行攻毒，观察Hc蛋白作为亚单位疫苗对小鼠的保护效果。从表一的实验结果可以看出不同剂量的Hc免疫小鼠3次后，均可以完全保护小鼠抵御2×10³LD₅₀剂量的破伤风毒素的攻击，说明Tet-Hc作为亚单位疫苗在体内可以诱发小鼠产生大量的中和性抗体，具有很好地预防效果。

表1不同剂量的Hc亚单位疫苗免疫BALB/c小鼠后对小鼠的体内保护效果

SEQ ID No.1

<110>军事医学科学院微生物流行病研究所

<120>破伤风毒素受体结合区Hc在大肠杆菌中的高效表达及应用

<160>1

<170>PatentIn Version 3.5

<210>1

<211>1353

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>gene

<222>(1)...(1353)

<223>

<400>1

aaaaaccttg attgttgggt cgacaacgaa gaagacatcg atgttatcct gaaaaagtct      60

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ttcgttccga ccgatgaagg ttggaccaac gac                                 1353

SEQ ID No.2

<110>军事医学科学院微生物流行病研究所

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<160>1

<170>PatentIn Version 3.5

<210>1

<211>451

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>mat_peptide

<222>(1)...(451)

<223>

<400>2

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IASNWYFNHL KDKTLTCDWY FVPTDEGWTN D                                   451