优化型十拷贝rolGLP-1在大肠杆菌中的高效表达及其应用研究

摘要

目前，全球糖尿病患者有近3亿，随着人们生活节奏和生活方式的变化，糖尿病正在逐渐蔓延且发病人群向年轻化发展，糖尿病已成为威胁人类健康的重要慢性流行疾病，目前市场急需标本兼治的糖尿病治疗药物。
　　促胰岛素(Incretin)又称胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)，能通过胰岛β细胞表面的特异受体显著增强葡萄糖诱导的胰岛素分泌，有效降低糖尿病患者血糖水平，促进胰岛β细胞胰岛素基因转录和分泌，促进胰岛β细胞再生，抑制胰岛β细胞凋亡，改善和恢复胰岛细胞功能;防止糖尿病各种并发症，抑制胰升血糖素的分泌和糖尿病患者胃的排空，消除其饥饿感，降低血脂，预防冠心病;GLP-1的促胰岛素作用依赖于葡萄糖的浓度，用其治疗糖尿病不会发生低血糖，被认为是一种“治标治本”的糖尿病治疗多肽，对2型糖尿病的预防和治疗具有重要意义。
　　人体内胰高血糖素样肽以有活性的GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)酰胺形式存在，但是其N端第8位的丙氨酸极易被二肽酶(DPPⅣ)切割变成无活性的短肽GLP-1(9-37)或GLP-1(9-36)，半衰期仅数分钟，成为GLP-1进入实际应用的主要瓶颈。因此，开发更稳定的GLP-1类似肽，延长其体内有效作用时间成为近年来的热门课题。
　　本实验室前期通过点突变天然GLP-1，克隆了抗DPP-Ⅳ和胰蛋白酶降解的重组口服长效GLP-Ⅰ类似肽(recombinant oval long-acting GLP-1，rolGLP-1)。动物实验证明，GLP-M蛋白(10 tandem repeated rolGLP-1)可显著降低糖尿病大鼠血糖水平，改善了由于高血糖引起的异常体征，对2型糖尿病具有良好的治疗效果。由于GLP-M中各拷贝rolGLP-1之间通过酶切连接，导致两个相邻rolGLP-1之间多出三个氨基酸（脯氨酸-异亮氨酸-精氨酸），并且为了便于蛋白纯化，GLP-M的C端设计了纯化标签(6×His)，于是在GLP-1的完整序列外添加了一些冗余氨基酸，虽然短期看不出冗余氨基酸的副作用，但是不能保证长期使用的安全性，而且影响新药审批。为此，我们委托北京擎科生物科技有限公司(Tsingke Biological Technology Co.，Ltd，Beijing)合成了十拷贝rolGLP-1全基因，利用分子克隆和定点突变技术构建表达优化促胰岛素(Optimized rolGLP-1， Opt-rolGLP-1）的大肠杆菌工程菌株，能保证各拷贝之间的无缝连接(无任何多余的氨基酸）。
　　大肠杆菌工程菌株F,.coli BL21(DE3)/Opt-rolGLP-1经IPTG诱导后，SDS-PAGE和Western Blotting结果证明实现了Opt-rolGLP-1在大肠杆菌的高效分泌表达，对其诱导表达条件进行优化，结果表明Opt-rolGLP-1的最佳表达条件为IPTG终浓度为1mM，25℃下培养8h。诱导后菌体经过超声破碎，采用阴离子交换层析和凝胶过滤层析，成功纯化出纯度高达98％的Opt-rolGLP-1，满足动物实验要求。
　　Opt-rolGLP-1中每个拷贝rolGL,P-1 C端的最后一个氨基酸恰好是精氨酸（胰蛋白酶识别位点），体外酶切实验证明，Opt-rolGLP-1可被胰蛋白酶识别并切割成单拷贝rolGLP-1。
　　通过对C57BL/6J小鼠进行高脂高糖饮食合并腹腔注射小剂量(mg/kg)链脲佐菌素，两次成功构造2型糖尿病小鼠模型，证明此造模方法成熟稳定。糖尿病小鼠经过灌胃Opt-rolGLP-1和单拷贝rolGLP-1或皮下注射单拷贝rolGLP-1治疗后，小鼠饮食饮水量有所下降，因高血糖导致的体重下降现象也被遏止，而且小鼠的糖化血红蛋白、胆固醇、甘油三酯含量明显下降，高胰岛素血症和口服糖耐量都得到有效改善。此外Opt-rolGLP-1和rolGLP-1能上调糖尿病小鼠肝脏GLUT2、INSR、GCK mRNA的表达水平，同时下调肝脏PGC-1αmRNA的表达量，这可能是Opt-rolGLP-1和rolGLP-1治疗糖尿病的重要分子机制之一。
　　本研究亦考察了Opt-rolGLP-1对正常昆明小鼠饮食饮水及体重的影响，结果发现Opt-rolGLP-1可以降低正常昆明小鼠的摄食摄水量，延缓小鼠体重的增长，证明其保持了天然GLP-1抑制食欲，延迟胃排空的活性。
　　本研究为口服多肽（蛋白）药物的开发提供了良好的实验依据和理论支持，同时也为Opt-rolGLP-1后期的临床实验和临床应用奠定基础。

目录

声明

摘要

第一章 引言

第一节 糖尿病的研究进展

1．1．1 糖尿病的简介

1．1．2 糖尿病的分类

1．1．3 1型糖尿病及其治疗进展

1．1．4 2型糖尿病及其治疗进展

1．1．5 妊娠糖尿病及特殊类型糖尿病

第二节 GLP-1的研究进展

1．2．1 胰高血糖素样肽-1(GLP-1)概述

1．2．2 GLP-1受体(GLP-1 receptor，GLP-1R)

1．2．3 GLP-1的生理功能

1．2．4 GLP-1的长效类似物

第三节 重组蛋白表达系统的研究进展

1．3．1 原核表达系统

1．3．2 真核表达系统

第四节 肝脏中糖代谢相关基因的研究进展

1．4．1 葡糖糖转运蛋白2在糖代谢中的作用

1．4．2 过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α在糖代谢中的作用

1．4．3 胰岛素受体在糖代谢中的作用

1．4．4 葡糖糖激酶在糖代谢中的作用

第五节 本研究的目的和意义

第二章 pET22b(+)-Opt-rolGLP-1表达载体的构建和诱导表达

第一节 材料和方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

第二节 实验结果

2．2．1 表达载体pET22b Opt-rolGLP-1的构建

2．2．2 Opt-rolGLP-1在大肠杆菌中的诱导表达与鉴定

第三节 讨论

第四节 小结

第三章 Opt-rolGLP-1的纯化、体外酶切鉴定及降糖活性检测

第一节 材料和方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

第二节 实验结果

3．2．1 通过两步层析法获得高纯度Opt-rolGLP-1

3．2．2 Opt-rolGLP-1在体外可被胰蛋白酶切割成rolGLP-1

3．2．3 Opt-rolGLP-1对2型糖尿病模型小鼠的治疗作用

3．2．4 Opt-rolGLP-1可改善糖尿病小鼠口服葡萄糖耐量

第三节 讨论

第四节 小结

第四章 Opt-rolGLP-1对2型糖尿病小鼠的治疗作用及其机制分析

第一节 材料和方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验方法

第二节 实验结果

4．2．1 成功构建2型糖尿病小鼠模型

4．2．2 Opt-rolGLP-1及rolGLP-1对2型糖尿病小鼠的治疗作用

4．2．3 灌胃Opt-rolGLP-1对正常小鼠饮食饮水和体重的影响

4．2．4 Opt-rolGLP-1和rolGLP-1治疗对小鼠肝脏糖代谢相关基因表达的影响

第三节 讨论

第四节 小结

第五章 结论与展望

第一节 结论

第二节 展望

创新点

附录

参考文献

致谢

个人简历