松褐天牛样本的保存方法及其体内松材线虫的快速检测方法

摘要

本发明公开了松褐天牛样本的保存方法及其体内松材线虫的快速检测方法。本发明将捕捉到的松褐天牛样本置于75％的酒精或-70℃冰箱中保存，最大限度地保存了松褐天牛携带的松材线虫的数量，本发明创建了上述保存状态的松褐天牛中松材线虫DNA模板制备技术，直接将松褐天牛成虫的中后胸气管组织进行冻融、裂解、离心后用于PCR扩增，扩增效率达到100％，加快了检测的速度，提高检测的准确度，达到了简易、快速、准确的检测目的。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及携带松材线虫的松褐天牛样本的保存技术，及松褐天牛样本体内松材线虫的快速检测方法。

背景技术

松褐天牛(松墨天牛)松材线虫病是重要的检疫性病害。从1982年在中国南京中山陵发现松材线虫病以来，松材线虫病已经蔓延到江苏、山东、安徽、浙江、福建、湖北、湖南、广东、广西、云南、贵州、四川、香港、澳门、和台湾等省市和地区等地，全国发生面积达8.7万hm²，累计枯死松树3500多万株，疫区疫木不仅不能正常利用，而且影响其它农副产品和林产品的流通，造成直接经济损失25亿元，间接经济损失达250亿元(陈凤毛等，2005)，生态环境、外贸出口和社会经济发展受到严重影响，已被我国列入对内、对外的检疫对象。

中国约有8.5亿亩(5710万公顷)针叶树木资源，其中作为第一大树种的松树资源约5亿亩(3330万公顷)，总蓄积量达57亿立方米。松材线虫病作为一种毁灭性的病害，严重威胁着中国众多名胜古迹和风景旅游区的安全。同时，松材线虫病正成为一项技术壁垒，严重影响进出口贸易。

松褐天牛是我国松材线虫的最主要媒介昆虫(徐福元，1994))，松褐天牛主要分布在河北省南部的大部分省区，包括河北、河南、陕西、山东、江苏、浙江、江西、湖南、广东、广西、福建、陕西、台湾、四川、贵州、云南、西藏等省区(成新跃等，2005)。松褐天牛的寄主植物包括松属、冷杉属(Abies Mill.)、云杉属(Picea Dietr)、铁杉属(Tsuga)、黄杉属(Pseudotsuga Carr.)、落叶松属(Larix Mill.)和雪松属(CedrusTrew.)，最适宜的为松属植物(宋红敏等，2006)。

松褐天牛(松墨天牛)羽化时松材线虫三龄幼虫向蛹室聚集并蜕皮成分散型4龄幼虫(Warren等，1993；Maehara等，1996；Necibi等，1998)。4龄幼虫是一种不取食的扩散型幼虫，从而在不适环境中生存(Ishibashi等，1977；Kondo等，1978)。在松褐天牛从蛹发育成成虫一周期间，大量4龄幼虫通过松褐天牛第一腹节的气门进入其呼吸系统。天牛羽化飞出后，4龄分散型幼虫沿气门逸出，爬行至天牛腹部末端，再离开天牛(Enda，1977)。松材线虫4龄幼虫通过天牛产卵或取食伤口侵入健康松树，再蜕皮变成成虫(Mamiya等，1972；Morimoto等，1972)。松材线虫在松树内繁殖，几周内感病松树则停止流胶(Hashimoto等，1974；Mamiya 1983；Fukuda，1997)。1～2个月后感病松树即枯萎死亡。当携带1000～10000条松材线虫的松褐天牛集中在一棵健康的松树上取食就可传播足够的线虫使松树发病，当携带线虫的数量在1000条以下时不会引起松树当年发病(Togashi，1985)。

松材线虫病疫情监测是松材线虫病防治工作的首要环节，只有在及时发现疫情，并查明其发生危害情况的基础上。才能制定出科学合理的防治方案和作业设计，有效控制疫情(蒋丽雅等，2006)。目前，对于松材线虫病疫情的监测主要从病树和松褐天牛两个方面进行。以病木为对象疫情监测主要靠人工地面普查，任务繁重，地形林分情况复杂，加之取样分离难度较大，发生初期往往不能及时发现，一旦发现，疫情已经扩散了。同时林间存在潜伏侵染现象，很难从松树角度对其进行监测(杨宝君等，2002；张治宇等，2003；Futai，2003)。对于疑似疫点，松褐天牛密度低，枯死松树少，松树上采样分离困难，利用引诱剂引诱松褐天牛来检测松材线虫，可做到及早发现，为防治争取时间。

利用松褐天牛成虫来监测松材线虫病，最重要的是及时，快速检测到松褐天牛体内携带的松材线虫。目前采用的线虫检测方法是，将运到检测点的松褐天牛成虫剪碎后，浸泡在水中24小时，将线虫分离出来后，用下列相继建立起来的各种方法进行鉴定：松材线虫的形态学鉴定方法、松材线虫蛋白质电泳方法、松材线虫酶联免疫吸附法(ELISA)和松材线虫蛋白质印记法(Westenblots)、松材线虫DNA杂交技术、松材线虫RAPD技术和松材线虫PCR鉴定方法。

但是现有检测方法存在以下缺陷：

首先，在标本保存方面，现有技术运用松褐天牛监测林间松材线虫的发生，往往需要检测大量的样本，目前所运用的松褐天牛样本的保存方法，是把松褐天牛养在装有新鲜松枝的昆虫箱中，这样，松褐天牛在补充营养的过程中，松材线虫就会离开松褐天牛虫体，这样会使检测到的松材线虫数量大大减少，或检测不到，而影响监测结果的准确性。

其次，现有的检测分析技术主要存在以下缺陷：

1、松褐天牛体内松材线虫的分离结果受温度影响较大，尤其是越冬后的松褐天牛羽化时，因为温度比较低，在低温的情况下，可能分离不出线虫，从而影响检测结果。

2、松材线虫病主要是根据其病原--松材线虫雌成虫的形态特征，进行鉴定(冯志新等，2001)。而该线虫形态微小(长1mm左右，宽30μm左右)，需要在显微镜下，由专业人员进行鉴定。而松褐天牛中松材线虫以4龄幼虫形式存在，培养出松材线虫成虫需要一定的时间。这些往往导致疑似疫点得不到及时确诊，延误了最佳防治时期。

3、松材线虫形态学鉴定方法简便易行，是现行线虫种类鉴定的常规方法(Ryss A.，2005)。松材线虫的鉴定主要依靠成虫的形态特征。由于松材线虫组的变异伞滑刃线虫(B.abruptus Giblin-Davis，Mundo-Ocampo，Baldwin，Norden&Batra，1993)、锥尾伞滑刃线虫(B.conicaudatus)、伪伞滑刃线虫(B.fraudulentus R-ühm，1956(J.B.Goodey，1960))、科丽姆伞滑刃线虫(B.kolymensisKorentchenko，1980)和拟松材线虫(B.mucronatus(Braasch，2001；Kanzaki&Futai，2003))都具有和松材线虫相似的形态，而且Wingfield et al(1983)在胶枞上分离到的松材线虫雌成虫尾端成尖形，Fukushige et al(1985)要观察到松材线虫有尾尖突这种不是十分稳定的形态特征给鉴定带来了困难。

4、蛋白质电泳分析是较早应用于线虫分类学研究的一项分子技术。20世纪80年代后，不少学者对松材线虫和拟松材线虫株系进行了同工酶差异的研究。同工酶技术要求分析的样本数量较大(不少于3000条)，才能获得清晰的电泳图谱，且蛋白质的表达与环境以及线虫的生长发育阶段有关。到目前为止，还没有一种同工酶被公认为可以明确地区分松材线虫与拟松材线虫。

5、许多学者利用DNA杂交技术鉴定松材线虫，Abad et al(1991)、Tares et al(1992)分别用异源探针和同源探针杂交对松材线虫进行分类鉴定，Tares等(1994)从日本松材线虫中分离到了种特异性卫星DNA探针Mspl，用这个探针可以直接对点在滤网上的单条挤碎的线虫进行鉴定，能快速准确的鉴定松材线虫，但这种技术的缺点是技术难度较大，费用高，且具有放射性危害。

6、RAPD技术是Williams于1990年建立的以10个寡聚核苷酸为随机引物的分子标记技术。它快速、简便、灵敏且无需放射性同位素标记。Braasch et al(1995)、Zhang，et al(1998)、汪来发等(2001)和张路平等(2002)采用RAPD-PCR技术对松材线虫和拟松材线虫种间和种内差异以及它们的遗传多样性进行了研究。尽管RAPD技术所含信息量大，但因为其图谱比较复杂，重复性和可比性差，使得RAPD技术在鉴定松材线虫上存在一定的局限性。

7、PCR技术的应用，突破了DNA分子鉴定所受DNA量的限制，大大提高了检测的灵敏度。Hoyer et al(1998)建立了区分5种线虫的ITS-PCR-RFLP技术。Iwahori et al(2000)利用该技术不仅成功地检测了松材线虫和拟松材线虫，而且仅用单条活线虫建立了快速、灵敏的松材线虫诊断方法。张立海(2001)建立的PCR-SSCP技术，Cao等(2005)、王明旭等(2005)、张卫东等(2005)分别利用实时PCR检测鉴定了松材线虫。从我国目前情况来看，特异性引物PCR方法(尤其是SCAR标记检测方法)与实时定量PCR方法检测时间短，检测精度高，能够满足快速检验检疫的要求，并已经在生产上开始大规模应用(汤坚等，2008)。但是现有的PCR技术的应用技术，都需要将线虫从木头或媒介昆虫中分离出来之后，进行鉴定。

8、直接检测出松褐天牛的松材线虫是人们一直在研究的课题。王新荣等(2009)利用一对PCR引物，将活的松褐天牛携带的松材线虫检测出来。捕捉松褐天牛成虫的方法是在松林间挂诱捕器，诱捕松褐天牛成虫后运送到实验室进行检测。但如前所述，在将松褐天牛样本从疑似疫点运送到实验室的途中，松褐天牛会发生死亡，现有的检测技术只能检测活松褐天牛上带的活松材线虫，死的样本不符合检测要求；或者在运送的途中松材线虫离开了松褐天牛，影响检测结果的准确性。

发明内容

本发明的一个目的是克服现有松材线虫检测技术中标本保存技术的不足，提供一种松褐天牛(松墨天牛)样本的保存方法，解决用于松材线虫检测的松褐天牛样本所遇到的运输或保存中活松褐天牛中松材线虫数量丢失，检测结果不能准确反应松褐天牛在林间携带松材线虫实际数量的问题。

本发明的另一个目的是克服现有松褐天牛体内松材线虫检测技术的不足，有效、灵敏、准确、简便地从松褐天牛体内检测松材线虫，克服传统检测方法中线虫分离、培养时间长，大样品松褐天牛体内的松材线虫难以高效保存等技术问题，把分子生物学技术运用到松褐天牛中松材线虫检测中去，加快检测的速度，提高检测的准确度。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现：

提供一种松褐天牛样本的保存方法，是将捕捉到的松褐天牛样本放到75％的酒精或-70℃冰箱中保存。

本发明同时提供了一种松褐天牛样本体内松材线虫的快速检测方法，将按照上述方法保存的松褐天牛样本进行以下步骤的检测：

(1)制备PCR引物：通过基因合成公司合成一对特异性的PCR扩增引物，该引物引自王新荣(2009)(Xinrong Wang Xiaowei Zhu HuanhuaHuang et al.A PCR-based Method for Detect ing the Pine WoodNematodes-Bursaphelenchus xylophilus from Monochamus alternatus.林业科学2009(45)7：70-74)：

P155：5’-CTACGTGCTGTTGTTGAGTTGGC-3’；

P538：5’-TGGTGCCTAACATTGCGCGA-3’  。

PCR扩增引物可置于-20℃冰箱中保存。

(2)捕捉松褐天牛采用上述方法进行保存；

(3)2mg松褐天牛中松材线虫DNA模版的制备：将2mg松褐天牛中后胸气管组织，放入灭菌的1.5ml的离心管中，液氮中做稍许研磨，后加入50μl～88μl WLB液(2.5mmol·L^-1二硫苏糖醇(DTT)，1.125％(质量百分比)吐温-20(Tween 20)，0.025％(质量百分比)明胶(Gelatin)，125mmol·L^-1 KCl，25mmol·L^-1 Tris-HCl(pH 8.0)，3.75mmol·L^-1 MgCl₂)，然后在水浴中完成温度循环：95℃15min，65℃2min，重复一次，加入8μl～10μl蛋白酶K(20mg·mL^-1)后于65℃1h、95℃15min裂解，裂解后的DNA提取液，经15，294g，3min离心后，吸取2μl做PCR扩增模板。

(4)制备PCR扩增技术体系

PCR扩增反应体系如下：10×PCR buffer 2.5μl(不含Mg²⁺)，dNTP(2.5mmol·L^-1)2μl，Mg²⁺(25mmol·L^-1)2.5μl～3.5μl，引物P1(P155)10μM和P2(P538)10μM各1μl，Taq DNA聚合酶5U·uL^-1 0.125μl，模板DNA 2μl，灭菌双蒸水补充至总体积25μl。

(5)进行PCR扩增

PCR反应条件如下：94℃预变性3min；94℃变性45s，48℃～58℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环后，最后72℃延伸10min。在4℃冰箱中保存。

(6)常规琼脂糖凝胶电泳检测

配制1.0～1.2％琼脂糖凝胶，待凝胶冷至约60℃时，加入GoldView，使GoldView终浓度为0.5μg/ml。取5μl PCR扩增产物与适量DNA载样缓冲液(含0.2％溴酚兰，0.5g/ml蔗糖)混匀上样，用Bio-Rad公司PowerPac300型稳压电源，在0.5×TBE缓冲液中以5v/cm电压电泳约30min。紫外灯下观察，用凝胶图像分析系统照相。

本发明针对现有松材线虫检测技术的不足，包括松褐天牛样品的保存中所遇到的运输或保存后松褐天牛死亡不能应用现有技术进行检测、或者活的松褐天牛体内松材线虫数量丢失导致检测结果不能准确反应松褐天牛在林间携带松材线虫实际数量等问题，克服传统检测方法中线虫分离、培养时间长、大样品松褐天牛体内的松材线虫难以高效保存等技术难题，提供简便易行的样本保存方法，结合有效而又简便的松褐天牛体内松材线虫DNA模版制备技术、灵敏的松材线虫特异性PCR扩增引物、高效PCR扩增体系和适合的PCR扩增反应条件，把分子生物学技术成功运用到松褐天牛中松材线虫检测中，加快检测的速度，提高检测的准确度，尽快确定新发生疫点，为松材线虫病的防控做出贡献。本发明突出的有益效果归纳如下：

(1)提供了一种新的松褐天牛样本保存技术。本发明将捕捉到的松褐天牛样本放到75％的酒精或-70℃冰箱中保存。75％的酒精或-70℃冰箱可以随时同时杀死松褐天牛及其携带的松材线虫，最大限度地保存了松褐天牛携带的松材线虫的数量，使随后的PCR检测结果更符合实际。而现有技术的保存技术是将松褐天牛成虫，饲养在养虫笼中，松褐天牛成虫携带的松材线虫有可能离开松褐天牛，影响检测结果的准确性。

(2)本发明创建了上述保存状态的松褐天牛中松材线虫DNA模板制备技术。保存的松褐天牛体内松材线虫DNA模板的制备，采用的是直接将松褐天牛成虫的中后胸气管组织进行冻融、裂解、离心后，用于PCR扩增，扩增效率达到100％。该技术无须先将松材线虫从天牛体中分离出来，提高了松褐天牛体内松材线虫检测效率。

(3)本发明创建了利用PCR技术，从保存的死亡松褐天牛中直接扩增出松材线虫的特异性片段的技术，将松褐天牛样本保存在适当的保存液中，然后进行松褐天牛中松材线虫PCR扩增，可以随时保存松褐天牛样本中松材线虫的状态，利用分子生物学技术，加快检测的速度，提高检测的准确度，从松褐天牛体内松材线虫DNA模板的制备开始，仅需5个小时就得到结果，达到了快速检测的目的。以往的检测方法无法利用PCR技术检测死松褐天牛身上的死线虫，也缺乏适当的松褐天牛保存方法，保证松褐天牛体内松材线虫检测结果与实际相符。

附图说明

图1松材线虫PCR特异扩增结果

图2 50μlWLB+8μl蛋白酶K(20mg·ml^-1)裂解液组合对2mg松褐天牛组织(加单条松材线虫)裂解后的PCR扩增结果

图3 88μlWLB+10μl蛋白酶K(20mg·ml^-1)裂解液组合对2mg松褐天牛组织(加单条松材线虫)裂解后的PCR扩增结果

图4不同退火温度下单条松材线虫活虫的PCR扩增结果

图5单条松材线虫活虫的PCR扩增结果

图6-70℃保存的携带松材线虫的松褐天牛组织PCR扩增结果

图7 75％酒精保存的携带松材线虫的松褐天牛气管组织PCR扩增结果

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。

实施例1

从广州市南湖游乐园，采得松褐天牛样本，保存5天后进行鉴定。得到了预期结果，完成了检测任务，检测结果见附图6和附图7。具体步骤如下：

(1)制备PCR引物：

比采样时间提前一周，通过北京赛百盛生物工程公司合成一对特异性的PCR扩增引物：

P155：5’-CTACGTGCTGTTGTTGAGTTGGC-3’；

P538：5’-TGGTGCCTAACATTGCGCGA-3’。

PCR扩增引物置于-20℃冰箱中保存。

松材线虫PCR特异扩增结果见附图1所示，其中，M代表DNAMarkDL2000；1代表松材线虫基因组DNA；2代表拟松材线虫基因组DNA；3代表松材线虫和松褐天牛基因组DNA混合物；4代表松褐天牛基因组DNA。

(2)从广州市南湖游乐园，采得松褐天牛样本，将捕捉到的松褐天牛样本，放到75％的酒精或-70℃冰箱中保存，优选5天内进行本发明检测。

(3)2mg松褐天牛中松材线虫DNA模板的制备：

将保存的松褐天牛中后胸的2mg气管组织，放入灭菌的1.5ml的离心管中，液氮中做稍许研磨后加入50μl～88μl WLB液(2.5mmol·L^-1 DTT，1.125％ Tween 20，0.025％Gelatin，125mmol·L^-1 KCl，25mmol·L^-1Tris-HCl(pH 8.0)，3.75mmol·L^-1 MgCl₂)，然后在水浴中完成温度循环：95℃15min，65℃2min，重复一次；加入8μl～10μl蛋白酶K(20mg·mL^-1)后进行65℃1h、95℃15min的裂解；裂解后的DNA提取液，经15294g、3min离心后，吸取2μl做PCR扩增模板。

88μlWLB+10μl蛋白酶K(20mg·ml^-1)裂解液组合对2mg松褐天牛组织(加单条松材线虫)裂解后的PCR扩增结果见附图3所示，其中，M：DNA Marker DL2000；泳道1～3：单条松材线虫；泳道4～6：2mg松褐天牛组织(加单条松材线虫)；泳道7：灭菌去离子水对照；泳道8：松材线虫基因组DNA。

本发明优选上述50μlWLB+8μl体系。50μlWLB+8μl蛋白酶K(20mg·ml^-1)裂解液组合对2mg松褐天牛组织(加单条松材线虫)裂解后的PCR扩增结果见附图2所示，其中M：DNA Marker DL2000；泳道1～3：单条松材线虫；泳道4～6：2mg松褐天牛组织(加单条松材线虫)；泳道7：灭菌去离子水对照；泳道8：松材线虫基因组DNA。

(4)制备PCR扩增技术体系

PCR扩增反应体系如下：10×PCR buffer 2.5μl(Mg²⁺free)，dNTP(2.5mmol·L^-1)2μl，Mg²⁺(25mmol·L^-1)3μl，引物P1(10μM)和P2(10μM)各1μl，Taq DNA聚合酶5U·uL^-10.125μl，模板DNA 2μl，灭菌双蒸水补充至总体积25μl。

(5)PCR扩增

PCR反应条件如下：94℃预变性3min；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环后，最后72℃延伸10min。在4℃冰箱中保存。

不同退火温度下单条松材线虫活虫的PCR扩增结果见附图4所示，图中泳道M：DL 2000 DNA marker；泳道1～7：退火温度分别为48.0℃、49.0℃、50.0℃、52.4℃、54.8℃、56.0℃、58.0℃的PCR扩增产物；泳道8：去离子水对照。在这7个测试的温度中，都能扩增出清晰的目的条带，见附图5所示单条松材线虫活虫的PCR扩增结果，其中泳道M：DL2000DNA marker；泳道1～6，单条松材线虫活虫的PCR扩增产物；泳道7：去离子水对照。

(6)、琼脂糖凝胶电泳检测结果。

配制1.0～1.2％琼脂糖凝胶(取1.0～1.2％的范围值中的任一点值均可)，待凝胶冷至约60℃时，加入GoldView，使GoldView终浓度为0.5μg/ml。取5μl上述步骤(5)的PCR扩增产物与适量DNA载样缓冲液(含0.2％溴酚兰，0.5g/ml蔗糖)混匀上样，用Bio-Rad公司PowerPac300型稳压电源，在0.5×TBE缓冲液中以5v/cm电压电泳约30min。紫外灯下观察，用凝胶图像分析系统照相。采用以上通用电泳方法，进行检测。可以看到，利用本发明方法建立的PCR检测技术体系，可以检测出保存松褐天牛样本体内松材线虫见附图6和附图7。说明采用本发明方法进行保存松褐天牛样本体内松材线虫的PCR特异性扩增时，可以提高检测的效率和精度。

附图6为-70℃保存的携带松材线虫的松褐天牛组织PCR扩增检测结果，泳道M：DL2000 DNA marker；泳道1～4：携带松材线虫的松褐天牛PCR扩增产物；泳道5：不携带松材线虫的松褐天牛PCR扩增产物；泳道6：松材线虫基因组DNA PCR扩增产物。

附图7为75％酒精保存的携带松材线虫的松褐天牛气管组织PCR扩增检测结果，泳道M：DL2000 DNA marker；泳道1～4：携带松材线虫的松褐天牛PCR扩增产物；泳道5：不携带松材线虫的松褐天牛PCR扩增产物。

SEQUENCE LISTING

<110>华南农业大学

<120>松褐天牛样本的保存方法及其体内松材线虫的快速检测方法

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工引物序列P155

<400>1

ctacgtgctg ttgttgagtt ggc                                23

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工引物序列P538

<400>2

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