南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的实时荧光RT-PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的实时荧光RT-PCR检测方法，本发明根据南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒的RNA，设计特异性的扩增引物和荧光探针，并借助扩增引物和荧光探针对待鉴定病毒的RNA模板进行RT-Realt time PCR反应，通过实时对RT-Real time PCR产物的荧光检测，实现对宿主是否被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染的快速检测。

说明书

技术领域

本发明涉及病毒物种检测技术，具体涉及南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的快速检测技术。

背景技术

南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus，ArMV)、菜豆黄花叶病毒(Bean yellow mosaic virus，BYMV)和百合无症病毒(Lily symptomless virus，LSV)三种病毒是侵染百合和唐菖蒲的主要病原物，给种植者带来较大的经济损失。南芥菜花叶病毒寄主范围广泛，可以侵染约174属215种植物，自然侵染并危害多种花卉、瓜类、豆类和果树，引起花叶、黄化褪绿、矮化、皱缩甚至坏死等症状，为我国规定的进境植物检疫性有害生物。BYMV病毒寄主广泛，主要寄主为唐菖蒲等观赏植物和豆科植物。受BYMV侵染的唐菖蒲幼苗生长势减弱，叶片出现白色碎斑，花杂色，导致切花质量下降，种球产量减少，而受BYMV侵染的蚕豆，种传率4％～17％，田间发病率可高达67％～100％，造成59％～96％的产量损失。百合受LSV的侵染率高达73％，其单独侵染时一股无明显症状，在自然条件下常与其它病毒复合侵染，导致百合叶片严重花叶和整株矮化，影响百合的产量和商业价值。

南芥菜花叶病毒、百合无症病毒和菜豆黄花叶病毒检测可采用常规的酶联免疫吸附检测方法(ELISA)检测，但这种检测方法灵敏度低，存在偏差；特别是当唐菖蒲和百合处于休眠状态时，种球中病毒浓度较低，采用常规的酶联免疫吸附检测方法(ELISA)则不能检出。邓丛良等根据ArMV不同分离物外壳蛋白基因的保守序列，设计特异性检测引物和探针，建立了检测ArMV的实时RT-PCR检测方法，例如中国专利CN1952649A，有效的解决了酶联免疫吸附检测方法(ELISA)灵敏度低的技术缺陷。

工作人员利用实时RT-PCR检测技术对侵染百合和唐菖蒲的三种主要病原物(南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒)检测时，需要做三次检测实验，速度慢，因此需要改进。

发明内容

本发明所要解决的是南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的检测速度慢的技术问题。

解决上述问题采用如下技术方案：南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒是否侵染宿主的实时荧光RT-PCR检测方法，包括如下步骤：

a、从寄主上抽提出待检测病毒的总RNA；

b、将总RNA稀释成RNA溶液；

c、以RNA溶液作为模板，进行RT-Real time PCR反应；在RT-Real time PCR反应体系中包括扩增引物、荧光探针；其中扩增引物共三组，分别为引物ArMV、引物BYMV和引物LSV，分别具有如下序列：

上游引物ArMV-F：5′-TTTATGCGATCTCGGGACCTA-3′，

下游引物ArMV-R：5′-TTGCACAACCACTGGCATCT-3′，

上游引物BYMV-F：5′-GGAGCAGGTGACATACCCTTTAA-3′，

下游引物BYMV-R：5′-TCCGCAACTTCCGAGAAATG-3′，

上游引物LSV-F： 5′-GCAGCATTGAGTTTGAGAATGG-3′，

下游引物LSV-R： 5′-GTCCAGCGTGCTTCTTCATG-3′，

引物ArMV、引物BYMV和引物LSV分别根据南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒的高度保守衣壳蛋白基因序列设计，并且引物间不互作，

其中荧光探针共三种，分别为探针ArMV-P、探针BYMV-P和探针LSV-P；其中

探针ArMV-P是5′端5-羧基荧光素修饰、3′端5-羧基四甲基罗丹明修饰的序列：5′-FAM-TGCCCCAAGTGGAGAAACTGCA-TAMRA-3′，当探针与靶序列配对时，FAM荧光基团发射的荧光因与3′端的TAMRA淬灭剂接近而被淬灭，在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得FAM荧光基团与淬灭剂TAMRA分离，发射荧光，

探针BYMV-P是5′端六氯-6-甲基荧光素修饰、3′端5-羧基四甲基罗丹明修饰的序列：5′-HEX-TGCAAAGCCAACATTCCGCCAAATA-TAMRA-3′，当探针与靶序列配对时，HEX荧光基团发射的荧光因与3′端的TAMRA淬灭剂接近而被淬灭，在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得HEX荧光基团与淬灭剂TAMRA分离，发射荧光，

探针LSV-P是5′端5-羧基-X-罗丹明修饰、3′端暗淬灭剂修饰的序列：5′-ROX-CCGTCGACTCCATCGCTGCG-ECLIPSE-3′，当探针与靶序列配对时，ROX荧光基团发射的荧光因与3′端的ECLIPSE淬灭剂接近而被淬灭，在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得FAM荧光基团与暗粹灭剂ECLIPSE分离，发射荧光；

d、对RT-Real time PCR产物进行实时荧光阳性检测；

e、根据实时荧光阳性检测结果，判断寄主是否被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染，阳性表示寄主已经被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染，反之阴性表示寄主没有被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染。

进一步的，步骤d还包括采用空白对照对RT-PCR反应稳定性检测的步骤；反应结果为阴性则说明RT-Real time PCR反应稳定正常，反应结果为阳性则说明RT-Real time PCR反应不稳定、可能受到污染，需要重新检测。

进一步的，步骤d还包括采用阴性对照对RT-Real time PCR反应稳定性检测的步骤；反应结果为阴性则说明RT-Real time PCR反应稳定正常，反应结果为阳性则说明RT-Real time PCR反应不稳定、可能受到污染，需要重新检测。

进一步的，所述RT-Real time PCR反应中，扩增循环次数为40次。

进一步的，b步骤中，RNA溶液浓度大于等于总RNA浓度的10^-2倍。

本发明的有益效果：本发明提供的多重RT-Real time PCR检测方法能实现对寄主(百合、唐菖蒲)是否被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒侵染的快速检测。在RT-RealtimePCR体系中加入荧光基团，在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，它是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时段的表达差异，快速高效，而且具有很高的敏感性和特异性。这种多重检测方法能实现侵染百合和唐菖蒲的三种病毒的一次性同步检测，检测程序简便。

具体实施方式

本发明采用多重RT-Real time PCR检测技术实现对多种病毒的检测。根据南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒的RNA，设计特异性的扩增引物和荧光探针，并借助扩增引物和荧光探针对待鉴定病毒的RNA模板进行RT-Real time PCR反应，通过对RT-Realtime PCR产物的检测，实现对待鉴定病毒是否包含南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒三种病毒的快速检测。

本发明技术方案的基本内容包括：一、建立南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒的多重实时RT-Real time PCR检测方法；二、设计了特异性的扩增引物和荧光探针；

三、RT-Real time PCR稳定性监控。

一、南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒的多重RT-Real time PCR检测方法

反应体系：总体积为10μL反应体系。其中10×One Step RNA PCR Buffer 1μL，25mmol/LMgCl₂ 2μL，10mmol/L dNTP Mixture 1μL，40U/μL RNase Inhibitor 0.2μL，5U AMVReverse Transcriptase XL 0.2μL，5U AMV-Optimized Taq 0.2μL，10μmol/L ArMV、BYMV和LSV的上游引物和下游引物各为0.4μL，5μmol/L ArMV、BYMV和LSV探针各为0.4μL，ArMV、BYMV和LSV的RNA模板各为0.2μL，RNase Free dH₂O 1.2μL。

反应程序：50℃反转录30min；95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火与延伸40s，40个循环。

二、设计了特异性的扩增引物和荧光探针根据ArMV、BYMV和LSV高度保守的衣壳蛋白基因序列，设计检测探针和引物。

南芥菜花叶病毒序列长度65bp，其引物和荧光探针序列为：

上游引物ArMV-F：5′-TTTATGCGATCTCGGGACCTA-3′；

下游引物ArMV-R：5′-TTGCACAACCACTGGCATCT-3′；

探针ArMV-P：5′-FAM-TGCCCCAAGTGGAGAAACTGCA-TAMRA-3′。

BYMV序列长度90bp，其引物和荧光探针序列为：

上游引物BYMV-F：5′-GGAGCAGGTGACATACCCTTTAA-3′；

下游引物BYMV-R：5′-TCCGCAACTTCCGAGAAATG-3′；

探针BYMV-P：5′-HEX-TGCAAAGCCAACATTCCGCCAAATA-TAMRA-3′。

LSV序列长度72bp，其引物和探针序列为：

上游引物LSV-F：5′-GCAGCATTGAGTTTGAGAATGG-3′；

下游引物LSV-R：5′-GTCCAGCGTGCTTCTTCATG-3′；

探针LSV-P：5′-ROX-CCGTCGACTCCATCGCTGCG-ECLIPSE-3′。

三、RT-Real time PCR稳定性监控

以待检测病毒抽提出的总RNA为模板，并设置空白对照和阴性对照，验证多重RT-Realtime PCR方法的稳定性。

实施例1

采用多重RT-Real time PCR对宿主A(唐菖蒲)是否被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒侵染的检测

对宿主A(唐菖蒲)进行检测，具体包括如下步骤：

步骤a、从宿主A(唐菖蒲)中抽提出总RNA；除去影响RT-Real time PCR反应的多糖、酚类等物质；

步骤b、将总RNA稀释成10^-2倍的RNA溶液；

步骤c、以RNA溶液作为模板，进行实时RT-Real time PCR反应；

Real time RT-PCR反应体系：总体积为10μL反应体系。其中10×One Step RNA PCR Buffer1μL，25mmol/L MgCl₂ 2μL，10mmol/L dNTP Mixture 1μL，40U/μL RNase Inhibitor 0.2μL，5 U AMV Reverse Transcriptase XL 0.2μL，5U AMV-Optimized Taq 0.2μL，10μmol/L引物ArMV、引物BYMV和引物LSV的上游引物和下游引物各为0.4μL，5μmol/L探针ArMV、探针BYMV和探针LSV各为0.4μL，ArMV、BYMV和LSV的RNA模板各为0.2μL，RNase Free dH₂O 1.2μL。

RT-Real timePCR反应程序：50℃反转录30min；95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火与延伸40s，40个循环。

引物ArMV、引物BYMV和引物LSV是分别根据南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒的高度保守衣壳蛋白基因序列设计，并且引物间不互作的三组扩增引物，三组扩增引物分别具有如下序列：

上游引物ArMV-F：5′-TTTATGCGATCTCGGGACCTA-3′，

下游引物ArMV-R：5′-TTGCACAACCACTGGCATCT-3′，

上游引物BYMV-F：5′-GGAGCAGGTGACATACCCTTTAA-3′，

下游引物BYMV-R：5′-TCCGCAACTTCCGAGAAATG-3′，

上游引物LSV-F： 5′-GCAGCATTGAGTTTGAGAATGG-3′，

下游引物LSV-R： 5′-GTCCAGCGTGCTTCTTCATG-3′，

探针ArMV-P、探针BYMV-P和探针LSV-P是分别根据南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒高度保守的衣壳蛋白基因序列设计的三种荧光探针，其分别具有如下序列：

探针ArMV-P：5′-FAM-TGCCCCAAGTGGAGAAACTGCA-TAMRA-3′

探针BYMV-P：5′-HEX-TGCAAAGCCAACATTCCGCCAAATA-TAMRA-3′

探针LSV-P： 5′-ROX-CCGTCGACTCCATCGCTGCG-ECLIPSE-3′；

步骤d、实时对RT-PCR产物进行荧光阳性检测、稳定性检测；

步骤e、判断宿主A(唐菖蒲)是否被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染。空白对照、阴性对照显示均显示阴性，阳性对照为阳性结果，表明RT-Real time PCR反应稳定，检测结果可以采用。待测样品检测结果显示阳性，故宿主A(唐菖蒲)已经被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染。

对比例1

采用DAS-ELISA检测方法对宿主A(唐菖蒲)是否被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒侵染的检测

采用DAS-ELISA检测方法、分三次分别对宿主A(唐菖蒲)进行南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒侵染检测，最终检测结果为宿主A(唐菖蒲)同时被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒侵染，检测结果与实施例1检测结果相同，但DAS-ELISA检测方法繁琐复杂。

实施例2

采用多重RT-Real time PCR对宿主B(东方百合)是否被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒侵染的检测

本检测步骤与实施例1检测方法基本相同，不同之处在于步骤a中的宿主不同。

最终，空白对照、阴性对照显示均显示阴性，阳性对照为阳性，待测样品检测结果显示阳性，结果表明，该宿主B(东方百合)已经被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染。

对比例2

采用DAS-ELISA方法检测对宿主B(东方百合)是否被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒侵染的检测

采用DAS-ELISA方法、分三次分别对宿主B(东方百合)进行南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒侵染检测，最终检测结果为宿主B(东方百合)被百合无症病毒侵染，检测结果与实施例2检测结果相同。

实施例3

采用多重RT-Real time PCR对宿主C(亚洲百合)是否被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒侵染的检测

本检测步骤与实施例1检测方法基本相同，不同之处在于步骤a中的宿主不同。

最终，空白对照、阴性对照显示均显示阴性，阳性对照为阳性，待测样品检测结果为阳性，结果表明，该宿主C(亚洲百合)已经被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染。

对比例3

采用DAS-ELISA方法检测，对宿主C(亚洲百合)进行南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒侵染检测

采用DAS-ELISA方法、分三次分别对宿主C(亚洲百合)是否被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒侵染的检测，最终检测结果为宿主C(亚洲百合)被百合无症病毒侵染，检测结果与实施例3检测结果相同，但DAS-ELISA方法繁琐复杂。

实施例4采用多重RT-Real time PCR对宿主D(东方百合)是否被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒侵染的检测

本检测步骤与实施例1检测方法基本相同，不同之处在于步骤a中的宿主不同。

最终，空白对照、阴性对照显示均显示阴性，阳性对照为阳性，待测样品检测结果显示阳性，结果表明，该宿主D(东方百合)已经被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染。

对比例4

采用DAS-ELISA方法检测对宿主D(东方百合)是否被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒侵染的检测

采用DAS-ELISA方法、分三次分别对宿主D(东方百合)进行南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒侵染检测，最终检测结果为宿主D(东方百合)被南芥菜花叶病毒侵染，检测结果与实施例4检测结果相同，但DAS-ELISA方法繁琐复杂。

实施例5

采用多重RT-Real time PCR对宿主E(唐菖蒲)是否被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒侵染的检测

本检测步骤与实施例1检测方法基本相同，不同之处在于步骤a中的宿主不同。

最终，空白对照、阴性对照显示均显示阴性，阳性对照为阳性，待测样品检测结果为阳性，结果表明，该宿主E(唐菖蒲)已经被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染。

对比例5

采用DAS-ELISA方法检测对宿主E(唐菖蒲)是否被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒侵染的检测

采用DAS-ELISA方法、分三次分别对宿主E(唐菖蒲)进行南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒侵染检测，最终检测结果为宿主E(唐菖蒲)被菜豆黄花叶病毒侵染，检测结果与实施例4检测结果相同，但DAS-ELISA方法繁琐复杂。

实施例6

采用多重Real time RT-PCR对宿主F(唐菖蒲)是否被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒侵染的检测

本检测步骤与实施例1检测方法基本相同，不同之处在于：步骤a中总RNA从宿主F(唐菖蒲)、已知病毒ToRSV、已知病毒TRSV、已知病毒LMoV和已知病毒CMV中抽取的。

最终，空白对照、阴性对照显示均显示阴性，阳性对照为阳性，待测样品检测结果显示阳性，结果表明，RNA模板包括病毒南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒，即该宿主F(唐菖蒲)被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒或百合无症病毒侵染。

对比例6

采用DAS-ELISA方法检测对宿主F(唐菖蒲)是否被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒侵染的检测

采用DAS-ELISA方法、分三次分别对宿主F(唐菖蒲)进行南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒侵染检测，最终检测结果为宿主F(唐菖蒲)被南芥菜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒和百合无症病毒侵染，检测结果与实施例5检测结果相同，表明本发明的检测方法具有特异性，病毒ToRSV、TRSV、LMoV和CMV对监测结果无影响，检测灵敏度高。