一种植物超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活力检测方法

摘要

本发明公开了一种植物超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活力检测方法，包括样品的液氮研磨、采用一种缓冲液同时提取三种酶、以及酶活力测定等步骤。该方法采用一种缓冲液即可同时提取植物中的SOD、CAT和POD三种酶，可达到简单、快速检测植物中的SOD、CAT和POD酶活力的目的，简化操作，省时省力，减少样品和试剂用量等，有利于实现批量操作，并且检测结果与传统方法无明显差异；此外，本发明方法在酶液提取之前采用液氮研磨法对样品进行研磨，研磨速度快，细胞破碎效果好，提取效率高。

说明书

技术领域

本发明属于植物超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活力检测方法技术领域，特别涉及一种植物超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活力检测方法。

背景技术

植物在生理代谢过程中伴随着部分电子逃逸，产生具有毒害作用的高能量活性氧，其中包括O₂^-、H₂O₂、单线态氧、羟自由基等。植物细胞的叶绿体、线粒体和质膜等是活性氧产生的主要场所。这些活性氧的积累会使植物细胞受到氧胁迫。为了减轻活性氧对细胞的破坏，维持体内活性氧的动态平衡，植物在进化过程中逐渐形成一套抗氧化酶促系统，包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）。这三种酶的作用分别是SOD催化O₂^-歧化反应生成H₂O₂，CAT分解H₂O₂，POD清除O₂^-、H₂O₂和其他过氧化物，与植物的生理代谢和抗逆性有密切关系。植物在生长发育过程中会受到各种不良环境的影响，包括生物胁迫和非生物胁迫。处于逆境下的植物往往会产生大量活性氧，从而也引起抗氧化酶促系统中的酶产生量发生变化以清除过多的活性氧、减少植物受到的氧胁迫。SOD、CAT和POD酶活力的变化能反映出植物所受到的胁迫状况及植物抗逆能力的强弱。因此，上述三种酶是植物生理研究中的重要研究对象，其酶活力的检测是其重要环节。

酶活力（enzymeactivity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。

上述三种酶活力的传统检测方法分别是：

1）SOD酶活力的检测方法：

先用冰浴研磨法和0.05mol/L、pH7.8磷酸缓冲液制备粗酶液，然后用硝基四唑淡蓝法测其酶活力；

取1g植物叶片等组织于预冷的研钵中，加入预冷的0.05mol/L、pH7.8磷酸缓冲液，研磨成浆，定容后低温离心，上清液为SOD粗酶液；

硝基四唑淡蓝法测定SOD酶活力：酶促反应体系包含0.05mol/L、pH7.8磷酸缓冲液、0.013mol/L甲硫氨基酸溶液、75μmol/L硝基四唑淡蓝溶液、10μmol/LEDTA-Na₂、2μmol/L核黄素和0.01-1mL酶液；以不加酶液的反应体系为对照反应体系；将上述加酶液的反应体系装于指形管（或其它透光性好的容器）中并混合均匀，然后置于4000Lx日光灯下反应20min；将上述不加酶液的对照反应体系装于另一指形管中作为对照管，混合均匀后置于暗处放置相同时间。反应结束后以不照光的对照管作为空白，在波长560nm下分别测定各管的吸光度。以抑制硝基四唑淡蓝光化反原为蓝色的甲腙的50%为一个酶活单位计算SOD活性。

2）CAT酶活力的检测方法：

先用冰浴研磨法和0.2mol/LpH7.0磷酸缓冲液制备粗酶液，然后用紫外吸收法测其酶活力；

取1g植物叶片等组织于预冷的研钵中，加入预冷的0.2mol/LpH7.0磷酸缓冲液，研磨成浆，定容后低温离心，上清液为CAT粗酶液；

紫外吸收法测定CAT酶活力：酶促反应体系包含0.2mol/LpH7.0磷酸缓冲液、0.01mol/LH₂O₂和0.01-1mL酶液；将上述反应体系于波长240nm下测定吸光度的变化量，以每分钟内吸光度减少0.01为一个酶活单位计算CAT酶活性。

3）POD酶活力的检测方法：

先用冰浴研磨法和0.05mol/LpH6.0磷酸缓冲液制备粗酶液，然后用愈创木酚法测POD酶活力；

取1g植物叶片等组织于预冷的研钵中，加入预冷的0.05mol/LpH6.0磷酸缓冲液，研磨成浆，定容后低温离心，上清液为POD粗酶液；

愈创木酚法测定POD酶活力：酶促反应体系包含0.05mol/LpH6.0磷酸缓冲液、0.01mol/LH₂O₂、0.005mol/L愈创木酚溶液和0.01-1mL酶液；将上述反应体系于波长470nm下测定吸光度的变化量，以每分钟吸光度变化0.01为一个酶活单位计算POD酶活性。

SOD、CAT和POD在抗氧化酶促系统中都起着各自重要的作用，共同调节活性氧含量以住维持其动态平衡。因此，植物生理研究中往往需要同时检测上述三种酶的活力来评价某种植物的生理状态、抗氧化性或其它抗逆性能力。上述介绍的传统的检测这三酶活力的方法是分别使用三种不同的磷酸缓冲液进行相应的酶液提取，然后又使用各自的提取缓冲液作为反应缓冲液来进行酶促反应，从而检测其酶活力。因为传统的方法认为上述对应使用的缓冲液是这三种酶各自适合的反应缓冲液，这三种酶在其对应的反应缓冲液里最能发挥其酶活力。而上述传统方法的缺点主要是：冰浴研磨法步骤繁琐，费时费力，批量操作困难；需用不同浓度及pH值的磷酸缓冲液分别提取这三种酶，即三种酶液需要采用三种缓冲液分三次提取，样品需要量较多，工作量较大。

发明内容

本发明的主要目的是针对上述现有技术中检测SOD、CAT和POD三种酶活力时，采用冰浴研磨法步骤繁琐、费时费力、批量操作困难，且需用不同浓度及pH值的磷酸缓冲液对三种酶分别进行提取和检测，样品需要量较多，工作量较大等问题，提供一种植物超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活力检测方法，采用一种缓冲液即可同时提取植物中的SOD、CAT和POD三种酶，可简化操作，省时省力，并减少样品和试剂用量等。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种植物超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活力检测方法，包括下述主要步骤：

（1）、样品研磨：

取新鲜或超低温保存的植物叶片或其它组织，采用液氮研磨法进行研磨；

液氮研磨法，即将样品浸入液氮后用研磨棒研磨；

（2）、酶液提取：

将上述步骤（1）研磨后的样品加入0～4℃预冷的浓度为0.1～0.3mol/L、pH6.5～7.5的磷酸缓冲液进行浸提30min～12h，0～4℃下离心处理，取上清液，即得同时含有SOD、CAT和POD的混合酶液，0～4℃保存备用；

所述离心，是指转速5000～15000g，时间2～10min；

（3）、酶活力测定：

分别采用传统的测定方法对SOD、CAT和POD酶活力进行测定，如：

采用硝基四唑淡蓝法测定SOD酶活力；

采用紫外吸收法测定CAT酶活力；

采用愈创木酚法测定POD酶活力。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过采用一种缓冲液即可同时提取植物中的SOD、CAT和POD三种酶，将传统方法中采用三种缓冲液分三次提取三种酶液的复杂操作，简化为只需一种缓冲液、一次提取操作即可得到包含三种酶的混合酶液，再进而测定其酶活力，可达到简单、快速检测植物中的SOD、CAT和POD酶活力的目的，简化操作，省时省力，减少样品和试剂用量等，有利于实现批量操作，并且检测结果与传统方法无显著差异。

此外，本发明方法在酶液提取之前采用液氮研磨法替代传统的冰浴研磨法对样品进行研磨，研磨速度快，细胞破碎效果好，提取效率高。

附图说明

图1示出了实施例1分别采用液氮研磨法和冰浴研磨法对三种酶提取效率的影响；

图2示出了实施例2分别采用本发明方法同时提取上述三种酶与传统方法采用三种磷酸缓冲液分别提取三种酶对酶活力的影响；

图3示出了实施例3采用本发明方法检测低温对鱼腥草叶片中的SOD、CAT和POD酶活力的影响；

图4示出了实施例4采用本发明方法检测青笋、豇豆、小麦和番茄叶片中的SOD、CAT和POD酶活力差异；

图5示出了实施例5采用本发明方法、但不同浓度磷酸缓冲液提取三种酶对酶活力的影响；

图6示出了实施例6采用本发明方法、但不同pH磷酸缓冲液提取三种酶对酶活力的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。

但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。

下述各实施例中，三种酶活力的测定方法分别采用传统的测定方法，即：

采用硝基四唑淡蓝法测定SOD酶活力；

采用紫外吸收法测定CAT酶活力；

采用愈创木酚法测定POD酶活力。

具体操作分别如下：

硝基四唑淡蓝法测定SOD酶活力：酶促反应体系包含0.05mol/L、pH7.8磷酸缓冲液、0.013mol/L甲硫氨基酸溶液、75μmol/L硝基四唑淡蓝溶液、10μmol/LEDTA-Na₂、2μmol/L核黄素和0.01-1mL酶液；以不加酶液的反应体系为对照反应体系；将上述加酶液的反应体系装于指形管（或其它透光性好的容器）中并混合均匀，然后置于4000Lx；将上述不加酶液的对照反应体系装于另一指形管中作为对照管，混合均匀后置于暗处放置相同时间。反应结束后以不照光的对照管作为空白，在波长560nm下分别测定各管的吸光度。以抑制硝基四唑淡蓝光化反原为蓝色的甲腙的50%为一个酶活单位计算SOD活性。

紫外吸收法测定CAT酶活力：酶促反应体系包含0.2mol/LpH7.0磷酸缓冲液、0.01mol/LH₂O₂和0.01-1mL酶液；将上述反应体系于波长240nm下测定吸光度的变化量，以每分钟内吸光度减少0.01为一个酶活单位计算CAT酶活性。

愈创木酚法测定POD酶活力：酶促反应体系包含0.05mol/LpH6.0磷酸缓冲液、0.01mol/LH₂O₂、0.005mol/L愈创木酚溶液和0.01-1mL酶液；将上述反应体系于波长470nm下测定吸光度的变化量，以每分钟吸光度变化0.01为一个酶活单位计算POD酶活性。

实施例1

本实施例为比较液氮研磨法和冰浴研磨法对SOD、CAT和POD三种酶提取效率的影响。

以检测马铃薯叶片中的SOD、CAT和POD酶活力为例，将新鲜马铃薯叶片切碎后混均，分别采用冰浴研磨法和液氮研磨法研磨，浸提上述三种酶的磷酸缓冲液和酶活力测定均按照传统方法进行，试验设6次重复，具体操作如下：

（1）样品研磨、酶液提取：

A、冰浴研磨法：取1g叶片于预冷的研钵中，加入预冷的0.05mol/L、pH7.8磷酸缓冲液，在冰上研磨匀浆，定容至10mL，浸提30min，于4℃、12000g离心2min，取上清液即SOD酶液；

B、液氮研磨法：取1g叶片于预冷的研钵中，倒入液氮后研磨，然后加入10mL的0.05mol/L、pH7.8磷酸缓冲液浸提30min，于4℃、12000g离心2min，取上清液即SOD酶液；

将上述两种研磨法提取SOD酶过程中使用的磷酸缓冲液换成0.2mol/LpH7.0磷酸缓冲液和0.05mol/LpH6.0磷酸缓冲液，即分别得到CAT酶液和POD酶液；

（2）酶活力测定：

分别采用上述硝基四唑淡蓝法测定SOD酶活力、紫外吸收法测定CAT酶活力和愈创木酚法测定POD酶活力。

用上述两种研磨方法最后检测到的马铃薯叶片中SOD、CAT和POD酶活力如图1所示，图中横坐标为上述三种酶，纵坐标为酶活力。从图中可以看出采用液氮研磨法检测到的酶活力均比冰浴研磨法高，说明液氮研磨法使细胞破碎的效果更好，酶提取效率更高。另外，用液氮研磨法研磨的速度比冰浴研磨法快，而且更省力。

实施例2

本实施例为比较本发明的一种磷酸缓冲液同时提取上述三种酶的方法与传统的三种磷酸缓冲液分别提取上述三种酶的方法对酶活力的影响。

以检测红花叶片中的CAT、POD和SOD酶活力为例，将新鲜红花叶片切碎后混均，分别采用传统的三种磷酸缓冲液分别提取上述三种酶和本发明的一种磷酸缓冲液同时浸提上述三种酶，酶活力测定按照传统方法进行，试验设6次重复，具体操作如下：

（1）样品研磨、酶液提取：

A．传统的三种磷酸缓冲液分别提取上述三种酶：取1g叶片于预冷的研钵中，倒入液氮后研磨，然后加入10mL的0.05mol/L、pH7.8磷酸缓冲液浸提30min，于4℃、12000g离心2min，取上清液即SOD酶液；

将上述提取SOD酶过程中使用的磷酸缓冲液换成0.2mol/LpH7.0磷酸缓冲液和0.05mol/LpH6.0磷酸缓冲液，即分别得到CAT酶液和POD酶液；

B．一种磷酸缓冲液同时浸提上述三种酶：取1g叶片于预冷的研钵中，倒入液氮后研磨，然后加入10mL的0.2mol/L、pH7.0磷酸缓冲液浸提30min，于4℃、12000g离心2min，取上清液即SOD、CAT和POD混合酶液；

（2）酶活力测定：

分别采用上述硝基四唑淡蓝法测定SOD酶活力、紫外吸收法测定CAT酶活力和愈创木酚法测定POD酶活力。

本发明的一种磷酸缓冲液同时提取上述三种酶的方法与传统的三种酶分别提取的方法得到的红花CAT、POD和SOD酶活力如图2所示，图中横坐标为上述三种酶，纵坐标为酶活力。从图上可以看出上述两种方法检测到的上述三种酶的活力没有显著差异，说明本发明方法用于检测植物中的上述三种酶的活力是可行的。

实施例3

本实施例为用本发明的方法检测低温培养对鱼腥草叶片中的SOD、CAT和POD酶活力的影响。试验设6次重复，具体操作如下：

（1）样品研磨、酶液提取：

取分别于10℃（低温）和25℃（对照）培养（栽培）的鱼腥草叶片各1g分别置于预冷的研钵中，倒入液氮后研磨，然后加入10mL的0.2mol/L、pH7.0磷酸缓冲液浸提30min，于4℃、12000g离心2min，取上清液即为上述三种酶的混合酶液；

（2）酶活力测定：

分别采用上述硝基四唑淡蓝法测定SOD酶活力、紫外吸收法测定CAT酶活力和愈创木酚法测定POD酶活力。

用本发明的方法检测到10℃和25℃培养的鱼腥草叶片中的上述三种酶的活力如图3所示，图中横坐标为上述三种酶，纵坐标为酶活力。从图3可以看出用本发明方法检测到低温培养对鱼腥草中SOD、CAT和POD酶活力有显著的影响。

实施例4：

本实施例为用本发明的方法检测青笋、豇豆、小麦和番茄叶片中的SOD、CAT和POD酶活力差异。实验设6次重复，具体操作如下：

（1）样品研磨、酶液提取：

将新鲜的青笋、豇豆、小麦和番茄叶片分别切碎混均，分别取1g置于预冷的研钵中，倒入液氮后研磨，然后加入10mL的0.2mol/L、pH7.0磷酸缓冲液浸提30min，于4℃、12000g离心2min，取上清液即上述三种酶的混合酶液；

（2）酶活力测定：

分别采用上述硝基四唑淡蓝法测定SOD酶活力、紫外吸收法测定CAT酶活力和愈创木酚法测定POD酶活力。

用本发明方法检测到的青笋、豇豆、小麦和番茄叶片中的SOD、CAT和POD酶活力如图4所示，图中横坐标为上述三种酶，纵坐标为酶活力。从图4可以看出用本发明方法能检测到上述四植物中片中的SOD、CAT和POD酶活力有显著差异。

此外，发明人还考察了按照本发明方法、采用不同浓度及不同pH磷酸缓冲液同时提取三种酶时对酶活力的影响，分别见下述实施例5和6：

实施例5

本实施例为比较本发明方法、采用不同浓度磷酸缓冲液同时提取三种酶对酶活力的影响。

以检测红花叶片中的CAT、POD和SOD酶活力为例，将新鲜红花叶片切碎后混均，按照本发明方法，分别采用相同pH（7.0）、但不同浓度（0.05mol/L、0.10mol/L、0.15mol/L、0.20mol/L、0.25mol/L、0.30mol/L、0.35mol/L、0.40mol/L）的磷酸缓冲液，每种缓冲液同时提取上述三种酶，酶活力测定按照传统方法进行，各缓冲液试验分别设6次重复，具体操作如下：

（1）样品研磨、酶液提取：

A．分别采用不同浓度的磷酸缓冲液提取上述三种酶：各取1g叶片于预冷的研钵中，倒入液氮后研磨，然后分别加入10mL不同浓度（分别为0.05mol/L、0.10mol/L、0.15mol/L、0.20mol/L、0.25mol/L、0.30mol/L、0.35mol/L、0.40mol/L）、pH均为7.0的磷酸缓冲液浸提30min，于4℃、12000g离心2min，取上清液即得不同的SOD、CAT和POD混合酶液；

（2）酶活力测定：

分别采用上述硝基四唑淡蓝法测定SOD酶活力、紫外吸收法测定CAT酶活力和愈创木酚法测定POD酶活力。

上述不同浓度缓冲液提取最后检测到的红花叶片中SOD、CAT和POD酶活力如图5所示，图中横坐标为磷酸缓冲液浓度，纵坐标为酶活力。从图上可以看出，缓冲液浓度过低会影响CAT和POD酶活力，过高会影响SOD酶活力，说明即使同样采用本发明方法，但采用不同浓度的缓冲溶液时，检测到的上述三种酶的活力也可能具有显著差异，当pH为7.0时，以浓度为0.10mol/L～0.30mol/L时均能检测到上述三种酶的最佳酶活力。

此外，发明人还考察了当pH分别为6.5和7.5时，不同浓度的缓冲液对同时提取三种酶对酶活力的影响，结果均显示以缓冲液的浓度为0.10mol/L～0.30mol/L较好。

实施例6

本实施例为比较本发明方法、采用不同pH磷酸缓冲液同时提取三种酶对酶活力的影响。

以检测红花叶片中的CAT、POD和SOD酶活力为例，将新鲜红花叶片切碎后混均，按照本发明方法，分别采用相同浓度0.1mol/L、但不同pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）的磷酸缓冲液，每种缓冲液同时提取上述三种酶，酶活力测定按照传统方法进行，各缓冲液试验分别设6次重复，具体操作如下：

（1）样品研磨、酶液提取：

A．分别采用不同pH的磷酸缓冲液提取上述三种酶：各取1g叶片于预冷的研钵中，倒入液氮后研磨，然后分别加入10mL不同pH（分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）、浓度均为0.10mol/L的磷酸缓冲液浸提30min，于4℃、12000g离心2min，取上清液即得不同的SOD、CAT和POD混合酶液；

（2）酶活力测定：

分别采用上述硝基四唑淡蓝法测定SOD酶活力、紫外吸收法测定CAT酶活力和愈创木酚法测定POD酶活力。

上述不同pH缓冲液提取最后检测到的红花叶片中SOD、CAT和POD酶活力如图6所示，图中横坐标为磷酸缓冲液pH值，纵坐标为酶活力。从图上可以看出缓冲溶液的pH值对上述三种酶活力的影响有所不同，说明即使同样采用本发明方法，但采用不同pH的缓冲溶液时，检测到的上述三种酶的活力也可能具有显著差异，当浓度为0.1mol/L时，以pH为6.5～7.5较好，均能检测到上述三种酶的最大酶活力。

此外，发明人还考察了当浓度为0.3mol/L时，不同pH的缓冲液对同时提取三种酶对酶活力的影响，结果均显示以缓冲液的pH为6.5～7.5较好。