一种鉴别牛及其早期胚胎性别的方法

摘要

本发明涉及一种检测牛或牛早期胚胎性别的引物及其应用。利用牛牙釉基因在两个性染色体上的等位基因存在序列长度多态特点，在相应位点上设计了一对引物，所述引物包括SEQ ID NO.1和2所示的核苷酸序列，本发明利用上述引物采用快速PCR方法对牛早期胚胎进行扩增检测，可在雄性胚胎中检测到长约395bp的Y染色体特异产物条带和长约458bp的X染色体特异产物条带，但只能在雌性胚胎中检测到长约458bp的X染色体特异产物条带。本方法只通过一对引物的PCR扩增，在任意胚胎细胞中均能扩增出性别特异PCR产物，不需设计内标引物，即可实现对被检个体的性别鉴定，成本低廉，操作简便且快速、准确，避免了传统双重PCR方法和巢式PCR方法的复杂操作和较复杂扩增条件的摸索。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体的说，涉及一种牛及其早期胚胎性别的鉴定方法。

背景技术

动物的某些生产性状受性别限制或受性别影响，如奶牛只有母牛才表现产奶性状，而肉牛生产中公畜因为生长速度快而具有较高的经济价值，为充分发挥奶牛的繁殖能力和公牛的生长优势，人为控制牛的性别一直是人们追求的目标，因此快速准确地鉴别家畜早期胚胎性别并实施性别控制技术，是提高畜牧业经济效益的重要措施。

以往的PCR性别鉴定均采用持家基因作为内标引物，利用性别特异的Sry基因设计引物进行双重PCR扩增分析，并且多采用巢式PCR(nested-PCR)或基因组预扩增的方法对DNA模板进行富集，操作繁琐，费时费力，易污染，技术难度较大，不便于现场操作。

而单重PCR法由于仅扩增Y染色体特异引物，避免了多重PCR中常染色体引物对Y染色体特异引物扩增的影响，方法简便，但由于反应中没有内标引物作为内部标记，就可能将没有发生反应的样品误判为雌性，从而增加了鉴别结果假阴性的几率。

发明内容

本发明目的在于提供一种可检测牛及其早期胚胎性别的特异PCR扩增引物。

本发明的另一个目的在于提供一种利用上述引物检测牛及其早期胚胎性别的PCR方法。

本发明对牛牙釉基因在X、Y染色体上的等位基因序列(GI：29126030和GI：29126032，序列报道长度分别为6451bp和6264bp)进行了序列比对分析，发现该基因在Y染色体上的等位基因序列存在缺失，针对缺失位点，在其上下游设计了一对引物AML395，其核苷酸序列如表1所示(也见随附的序列表SEQ ID NO.1&2)：

表1引物AML395序列及相关信息

利用所述引物对存在于X、Y染色体的牙釉基因两个等位基因进行扩增检测，可以得到长395bp的Y染色体等位基因特异产物和长458bp的X染色体等位基因特异产物。当同时检测到长度约为395bp的扩增产物和长度约为458bp的产物条带时，表明被检测个体为雄性胚胎；当只检测到长度为458bp的产物条带时，表明被检测个体为雌性胚胎。

本发明通常采用20μL PCR反应体系，其中Taq酶1.5U，dNTP浓度为200μmol/L，引物浓度为180pmol/L，各离子浓度分别为20mmol/L Tris-HCl、20mmol/L KCl、1.5mmol/L MgCl₂和10mmol/L(NH₄)₂SO₄，扩增产物采用GoldViewna^TMI荧光染料(灵敏度比EB高10倍左右)染色观察。

因为不论是雄性胚胎还是雌性胚胎样品都能检测到特异产物，所以不会产生假阳性和假阴性，因此避免了由于使用内标引物带来的复杂双重PCR，降低了检测的技术难度，检测过程更加简便，检测结果也更加灵敏、可靠。

本发明进一步提供一种用于上述PCR扩增的优化PCR反应程序，该反应程序为：94℃3min；然后94℃1S，55℃1S，循环29次；72℃3min。

本发明同时通过改变传统PCR反应的扩增条件，而实现30～40分钟左右完成PCR扩增。

本发明所述的方法不涉及任何专有仪器，只利用现有常规仪器和国产化试剂即可实现检测目的，减少了应用中对专有生产厂商的依赖性，大大降低了鉴别成本，此外，本领域的一般技术人员均可实施本发明。

当然，本领域技术人员很容易将本发明的引物与相关的试剂制备成试剂盒，以方便适用。

本发明方法成本低廉、操作简单、快速、准确、可靠、实用。

附图说明

图1为公牛和母牛血液DNA的PCR扩增产物电泳图，其中，b1-b8道为母牛血液PCR扩增结果，检测到了一条458bp的X染色体特异扩增条带；a1-a4为公牛血液PCR扩增结果，除了检测到一条458bp的X染色体特异扩增条带外，还检测到了一条395bp的Y染色体特异条带，检测结果与预想的性别完全一致；ck为阴性对照，M为MarkerI(以下各图均采用本分子量标记)，从下至上的条带依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp和600bp；

图2为体外培养的已知性别鲁西黄牛耳成纤维细胞的扩增结果，其中1～6道为10个细胞样品的PCR扩增结果；7～12道为5个细胞样品的PCR扩增结果；M为DNA分子量标准；13～18为1个细胞样品的PCR扩增结果；19为阴性对照；泳道1～3、7～9、12、13～15分别为公牛样品，4～6、10、11、16～18分别为母牛样品。所有样品扩增结果均与预期性别一致，并且从单个细胞中均检测到了清晰的性别特异PCR产物条带。

图3为胚胎的性别鉴定结果，其中，1道为空白对照；2～7、10～13道为胚胎样品扩增结果；8、9道为已知性别牛基因组DNA扩增结果；M道为DNA分子量标准。其中3、2是来自于1号胚胎的两个二分胚，4、5是2号胚胎的两个二分胚，6、7是3号胚胎的两个二分胚，10、11是4号胚胎的两个二分胚，12、13是5号胚胎的两个二分胚。检测结果，图示的5枚胚胎，1、4号胚胎为雄性胚胎，2、3、5号胚胎为雌性胚胎，各胚胎的两个二分胚的扩增结果均相同，都呈现出与已知阳性对照一样清晰可辨的特异性扩增产物。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：以牛血液DNA为模板进行PCR扩增

各取公牛和母牛100μL抗凝血于1.5mL高压灭菌PCR管中，加1ml双蒸水，充分混匀。冰浴5～10分钟后12000rpm离心1分钟，弃去上层液体；向血液细胞中加入100μl双蒸水充分吸打混匀，煮沸5～10分钟，然后立即冰浴3～5分钟。以12000rpm离心5分钟，取上清于另一离心管中即可用于PCR检测，或-20℃保存备用。

引物设计

依据GenBank中收录的性染色体上的牙釉基因序列(GI：29126030和GI：29126032，序列报道长度分别为6451bp和6264bp)，设计引物AML395，由上海英俊生物技术有限公司合成，引物序列及相关的信息见表1。

表1引物AML395序列及相关信息

PCR反应体系的建立：

取按上述方法制备的牛血液DNA样品各1μL，采用20μL PCR扩增反应体系，其中Taq酶1.5U，dNTP浓度为200μmol/L，性别特异引物AML395浓度为180pmol/L。各离子浓度分别为20mmol/LTris-HCl、10mmol/L(NH₄)₂SO₄、20mmol/L KCl和1.5mmol/L MgCl₂。

PCR反应条件：94℃3min；然后94℃1S，55℃1S，循环29次；72℃3min。

在120V电压下，采用2％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测分析，电泳时间约为20min，采用GoldViewna^TMI荧光染料(灵敏度比EB高10倍左右)进行染色，凝胶成像结果如图1所示。其中，b1-b8道为母牛血液PCR扩增结果，a1-a4为公牛血液PCR扩增结果，ck为阴性对照，M为Marker I，从下至上的条带依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp和600bp。结果表明公牛血液PCR产物均出现了395bp及458bp两条带，母牛血液PCR结果则仅有458bp条带。阴性对照均不存在上述条带。说明本发明方法可信度高，不存在非特异性扩增。

实施例2：培养细胞的性别鉴定

将体外培养的鲁西黄牛耳成纤维细胞(分别来源于母牛和公牛)，用胰酶消化后在体视显微镜下按照1细胞、5细胞、10细胞梯度，分装于0.2ml PCR管中，然后分别加入PCR反应所用试剂，其中Taq酶1.5U，dNTP浓度为200μmol/L，引物AML395浓度为180pmol/L，各离子浓度分别为20mmol/L Tris-HCl、10mmol/L(NH₄)₂SO₄、20mmol/L KCl和1.5mmol/L MgCl₂，最后用水补足体积至20μL。

PCR扩增程序：94℃3min；(94℃1S，55℃1S)循环29次；72℃3min。全部反应时间为40min。

如实施例1那样进行电泳检测分析，PCR结果如图2所示。其中1～6道为10个细胞样品的PCR扩增结果；7～12道为5个细胞样品的PCR扩增结果；M为DNA分子量标准；13～18为1个细胞样品的PCR扩增结果；19为阴性对照；泳道1～3、7～9、12、13～15分别为公牛样品，4～6、10、11、16～18分别为母牛样品。不同的细胞均获得了与预期性别一致的扩增结果，并且清晰地检测到了各单个细胞的性别特异PCR产物条带，说明了本方法的性别特异性与灵敏度。

实施例3：牛胚胎细胞样品的性别鉴定

将单个牛胚胎移入底部划道的塑料平皿(直径100mm)的切割液滴内，用玻璃切割针在体视显微镜下将胚胎置于浅道上。将胚胎进行二分胚切割。切割完成后，用移液器取出切割样品分别移到不同的灭菌PCR管中，标记好后置于-20℃冷藏待用或直接进行性别鉴定。

向含有待测样品的PCR反应管中分别加入PCR反应所用试剂，其中Taq酶1.5U，dNTP浓度为200μmol/L，AML395浓度为180pmol/L。各离子浓度分别为20mmol/L Tris-HCl、10mmol/L(NH₄)₂SO₄、20mmol/L KCl和1.5mmol/L MgCl₂，最后用水定容至20μL。

PCR扩增程序：94℃3min；(94℃1S，55℃1S)循环29次；72℃3min。全部反应时间为40min。

如实施例1那样进行电泳检测分析，部分胚胎样品PCR扩增产物电泳结果如图3所示。1道为空白对照；2～7、10～13道为胚胎样品扩增结果；8、9道为已知性别牛基因组DNA扩增结果；M道为DNA分子量标准。其中3、2是1号胚胎的两个二分胚，4、5是2号胚胎的两个二分胚，6、7是3号胚胎的两个二分胚，10、11是4号胚胎的两个二分胚，12、13是5号胚胎的两个二分胚。

检测结果表明，在图示的5枚胚胎中，有3枚雌性胚胎和2枚雄性胚胎，并且每个胚胎的两个二分胚的扩增结果均相同，都与已知的血液阳性对照一样呈现出清晰可辨的特异性扩增产物，证明了本方法的可靠性。

序列表

<110>中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120>一种鉴别牛及其早期胚胎性别的方法

<130>

 

<160>2

 

<170>PatentIn version 3.3

 

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>1

ttctcaccag tacccttcct a                                            21

 

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>2

tcagaggcag gtcaggaagc a                                            21