磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶的制备方法

摘要

本发明涉及磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶的制备方法，包括通过Fe3O4磁性壳聚糖复合微球以及磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶894的制备而得。该方法进一步提高其使用效率，降低使用和生产成本，得到使用性稳定、活性回收高、使用周期长的固定化酶，在食品、纺织、饲料上有着广泛的用途。

说明书

背景技术

本发明涉及海洋微生物酶领域，特别是涉及磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶894的制备方法。 

碱性蛋白酶是一类重要的工业用酶，主要来源于嗜碱微生物，可催化蛋白质水解为小肽和氨基酸，广泛应用于洗涤、食品、皮革和丝绸行业，在医药、环保、化工及基础研究中也显示了广阔的应用前景。海洋碱性蛋白酶894是我实验室应用我国海洋微生物代谢产物，通过现代生物工程手段开发出的一种新型海洋酶，研究表明该酶活性高、贮藏稳定，并有良好的配伍性，在食品、纺织、饲料上有着广泛的用途。 

海洋微生物为适应海洋这一生命极限环境，海洋微生物酶表现了比陆源性微生物酶更为独特的酶学性质与生理功能。然而，由于游离酶的成本、高效性与稳定性等存在一定问题，其应用仍然面临诸多困难。因此对于现代工业来说，游离酶在使用中难以满足用户要求，不是一种理想的酶。为了克服其缺点，采用固定化海洋微生物酶技术，不仅能保持原酶的特性，而且将会大大提高酶的稳定性，可以连续长期使用而不易失活，也易与产物的分离，利于酶的重复多次使用及产品的纯化，从而显著降低酶的使用成本，因此具有更为广阔的应用前景。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在不足，为了进一步提高其使用效率，降低使用和生产成本，得到使用性稳定、活性回收高、使用周期长的固定化酶，在长期开发的海洋微生物及其酶的基础上开发提供一种磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶894的制备方法。 

本发明提供的磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶894的制备方法，包括下列步骤： 

①固定化载体磁性壳聚糖微球的制备 

i、Fe₃O₄磁核的制备 

将0.4-1.0，优选0.5mol/L的FeCl₂溶液和0.4-1.0，优选0.5mol/L的FeCl₃溶液混合均匀，其中FeCl₂与FeCl₃溶液的体积比为2∶4至4∶10，优选为3∶5，加入聚 乙二醇4000(PEG4000，其分子量为4000)，待充分溶解后在搅拌状态下快速滴加到5wt％的稀氨水中，并继续用氨水调节溶液pH值至9.0，继续搅拌20-40，优选30min后，超声10-20min，70-90℃，优选80℃水浴熟化20-40min，优选30min，再次超声10-20min使溶液体系均匀细腻，最后在磁铁的吸附下倾去上清液，即含有上述溶液体系容器放置于磁铁的磁场内，重蒸水洗涤至中性，真空冷冻干燥Fe₃O₄磁核。 

ii、磁性壳聚糖复合微球的制备 

壳聚糖溶解在5wt％的乙酸溶液中使得到2.5wt％的壳聚糖乙酸溶液，然后加入步骤①i的Fe₃O₄磁核并混合均匀，其中壳聚糖与Fe₃O₄磁核重量比为1∶1至3∶1，优选1∶1至2∶1，缓慢搅拌下逐滴滴入到乳化剂Span-80(失水山梨醇单油酸酯)和液体石蜡组成的混合体系中，乳化剂与液体石蜡体积比为5∶80，电动搅拌10-25min后迅速滴入10wt％的戊二醛溶液，戊二醛溶液与乳化剂体积比1∶1，继续在1500r/min下搅拌1-3h，优选2h。最后在磁铁的吸附下分离制得的磁性壳聚糖复合微球，并依次用石油醚、丙酮和重蒸水(经过两次蒸馏的离子水，简称重蒸水)反复洗涤，冷冻干燥得磁性壳聚糖复合微球。 

②磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶894的制备 

取步骤①的冻干的磁性壳聚糖复合微球加入pH10.0的磷酸缓冲液(市售或自配制)浸润约20-30h，优选24h，只要缓冲液能使微球浸润即可，充分润湿溶胀后用磁铁吸附磁性壳聚糖复合微球并倾空磷酸缓冲液，于润湿的磁性壳聚糖复合微球中加入pH4.0-12，优选8-12，更优选为10的海洋碱性蛋白酶894溶液，其中海洋碱性蛋白酶894量与载体的比例为0.1-0.5g酶/g载体，优选为0.3g酶/g载体，在温度5-45℃，优选为5-15℃下震荡吸附1-2h，优选1h，4℃静置2h，加入戊二醛使达到终浓度0.025-0.7，优选0.1重量％后在5-45℃，优选5-15℃温度下震荡交联0.5-18h，优选为2h，制备好的磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶894用磁铁吸附收集，倾去未交联的溶液并用蒸馏水充分漂洗，得到的磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶894，低温保存。 

按照本发明提供的磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶894的制备方法中，所述海洋碱性蛋白酶894(或简称酶)是由中国水产科学研究所开发、生产、销售的酶产品，该海洋碱性蛋白酶894属于中温酶，在40-50℃左右达到最高酶活，最适pH在9-10之间，稳定范围为pH5-10，游离酶在室温状态下一个月开始下降，80天后活力只有初始活力的75％，其贮藏半衰期只有192天等特性。其酶894的活性按 下列方法测定。 

海洋碱性蛋白酶894酶活力的测定 

采用Folin-酚法测定，取1mL酶液或0.5g固定化酶加入1mL经预热的pH9.0的1％酪蛋白溶液，混匀后50℃反应10分钟，加入2mL 4mol/L三氯乙酸终止反应，取1mL滤液加入5mL 4mol/L的Na₂CO₃和1mL的Folin试剂，40℃显色20分钟，在752分光光度计波长680nm处比色测定，以先加入三氯乙酸终止反应再加入酪蛋白的酶液作为空白，平行测定三份。以每毫升酶液在一定温度与pH条件下，每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸的酶量为一个活力单位。 

在本发明提供的方法中，固定化载体磁性壳聚糖微球的制备中，所述固定化磁性壳聚糖微球是指因含有磁性金属或金属氧化物(如Fe、Co、Ni及其氧化物)的超细粉末，而具有磁响应性及特殊结构的高分子壳聚糖微球。磁性高分子微球作为酶固定化的载体，与非磁性材料相比，具有很多优点，有良好的应用前景。Fe₃O₄磁核的粒径大多分布在2-10um左右，形状不很规则，且有团聚现象；由Fe₃O₄磁核制备得到的磁性壳聚糖复合微球呈现规则的球形，单分散性好，粒径大小平均为100-200um之间；图1、2中还可以看出磁性壳聚糖复合微球表面有不规则的凸起和凹陷，这种形貌可有效的增大微球比表面积，是固定化酶的优良载体，见图1A和图1B。 

所述壳聚糖为市售产品，相对分子量2.01×10⁵，脱乙酰度≥75％，来源于蟹壳。壳聚糖是一种氨基多糖，具有生物相容、生物降解、无毒、无生理活性、对蛋白质高度亲和等特性，良好的机械性能、化学稳定性、耐热性能以及使酶免受金属离子干扰等特点的酶固定化的载体。磁性壳聚糖微球集合了壳聚糖材料活泼的反应性功能基，还有许多其他优良的特性，如粒径小，表面积大，磁响应性强，生物相容性好等。 

壳聚糖表面功能基团在生化技术应用中非常重要，所以在形成微球或表面膜后也应最大限度的保留这些功能基团。图2是Fe₃O₄磁核(A)、磁性壳聚糖复合微球(B)、壳聚糖(C)的傅立叶红外光谱FTIR图，从这些物质红外光谱的变化，根据他们的特征吸收峰来确定官能团的结构。图2A中可以看到Fe₃O₄磁核在3421.22cm^-1和580.69cm^-1处有红外吸收，特别是580.69cm^-1处的红外吸收是其特征吸收峰，此峰在图2B中也存在，而在图2C中则强度非常小，说明B的磁性壳聚糖复合微球对Fe₃O₄磁核的包覆是成功的；图2C是壳聚糖的红外光谱，在3429.04cm^-1处有红外吸收，这是-OH和-NH₂的伸缩振动峰，2914.82cm^-1处和2880.99cm^-1处是脂肪族C-H的伸缩振动吸收，1599.03cm^-1处和1644.87cm^-1处是N-H和N-C弯曲振动峰，在1084.17cm^-1处和1024.89cm^-1处是伯醇和仲醇O-C伸缩振动峰，在896.94cm^-1处是D-吡喃苷的特 征吸收峰；图2B保留有壳聚糖原有的特征吸收峰以及Fe₃O₄磁核的特征吸收峰，使该复合微球成功的同时拥有了壳聚糖和磁核的功能。 

在制备磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶894中，酶量和载体间比例至关重要，一般为0.1-0.5g酶/g载体，优选为0.3g酶/g载体，随着酶载体比例的升高，制得的固定化酶活力不断提高，但到达最高点后又开始下降，这可能是由于酶量过大时，酶和酶之间的交联部分取代了酶和载体之间的交联，使得固定化的有效交联比例反而下降，以致引起固定化酶活力的下降；而固定化酶的酶活力回收则一直表现出下降的趋势，考虑固定化酶的活力和酶活回收情况，优选为0.2-0.4g酶/g载体，更优选为0.3g酶/g载体。 

在制备固定化酶过程中(吸附交联法)，通过双功能交联剂戊二醛对酶和载体进行交联，交联剂浓度过低，酶和载体之间交联不充分，交联剂浓度过高，又会出现酶分子本身的过度交联使酶失活，一般的戊二醛终浓度为0.025wt％至0.7wt％，优选为0.1wt％。 

交联时间为0.5h～18h，优选为2h，因固定化酶经过2h的交联后活力达到最佳状态，继续延长交联时间获得的固定化酶活力基本保持稳定。 

酶和载体在不同的环境pH条件下有着不同的解离状态，他们和双功能交联剂的交联结合也处于不同的情况下，因此对酶固定化的效果有着不同程度的影响。一般分别在pH4.0～12.0的条件下制备固定化酶，优选为pH10.0左右，固定化酶活力最高。 

制备固定化酶的体系温度，一般为5～45℃，低温下的固定化效果最好，优选为5～15℃，因为低温条件下酶、交联剂戊二醛、载体分子活动和相互反应均较缓和，且酶的活性中心也处于半休眠状态，有利于酶活性的保持以及酶分子和载体分子之间的有效交联，使得固定化酶的效果更好。 

根据本发明提供的磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶894的制备方法中，所得固定化海洋碱性蛋白酶894(简称固定化酶)和游离酶(指未固定化的酶894原料酶)的性质比较 

固定化海洋碱性蛋白酶894与游离酶的最适作用温度和温度稳定性 

体系温度升高到60℃，更为显著的是酶经固定化后可在很宽的温度范围内发挥作用，即使在20℃或80℃高温环境下仍保持50％以上的高活性。固定化酶的温度稳定性相对于游离酶也有显著的增强，游离酶在温度高于50℃时活性开始下降，而固定化酶则可在60℃保温半小时以上仍基本保持酶活不变(见图3，4，5)。海洋碱性 蛋白酶894固定化酶和游离酶的实验结果充分表明固定化对酶活性中心的结构有相当的保护作用。 

固定化海洋碱性蛋白酶894与游离酶的最适作用pH和pH稳定性 

在pH5.0～13.0下分别测定海洋碱性蛋白酶游离酶和固定化酶894的活性，比较它们的最适作用pH和pH稳定性(见图6、7)。结果表明，游离酶894和固定化酶的最适pH都在9-10之间，只是游离酶894的活性在环境pH偏离最适条件时迅速下降，而酶经固定化后则在更宽的pH环境条件下保持高活性。两者的pH稳定性曲线则呈现相似的状态，游离酶894的稳定范围为pH5-10，固定化酶则为pH5-11，固定化酶比游离酶具有更宽的pH耐受范围，但两者在环境pH偏离这个范围后活性都显著下降。实验结果同样说明了固定化对酶稳定性的促进作用。 

固定化海洋碱性蛋白酶894与游离酶的贮藏稳定性和贮藏半衰期 

海洋碱性蛋白酶894的固定化酶和游离酶在室温25℃下保存，每10天测定其活性，比较其贮藏稳定性的变化。结果由图8所示，游离酶在室温状态下一个月后开始下降，80天后活力只有初始活力的75％；而固定化酶在室温状态下贮藏很稳定，80天后活力仍保持在95％以上，贮藏期明显延长。 

按半衰期计算公式：t_1/2＝0.693t/2.303lg(E₀/E)(张树政1984) 

其中：t_1/2固定化酶半衰期；t为贮藏时间；E₀是初始酶活力，E是贮藏时间t后酶活力。固定化海洋碱性蛋白酶894贮藏80d后的残留酶活力为95％，计算得该固定化酶25℃下的贮藏半衰期约为1080天，游离酶在25℃下的贮藏半衰期则只有192天。 

固定化海洋碱性蛋白酶894的操作稳定性和操作半衰期 

在pH9.0，50℃的最适条件下进行固定化海洋碱性蛋白酶894的反复使用，每次使用时间为60min，结束后测定其酶活力，观察操作稳定性。结果如图9所示，固定化酶894的操作稳定性非常好，反复使用10次后其残留酶活力仍可达到95.5％。利用半衰期公式计算其操作半衰期为150次。 

海洋碱性蛋白酶894游离酶和固定化酶的动力学常数 

在50℃、pH9.0，0.05mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲体系下，以不同浓度酪蛋白为底物，测定海洋碱性蛋白酶894及其固定化酶的反应初速度，按常规的Lineweaver-Burk作图法以1/[V₀]对1/[S₀]做图(图10，11)，分别求得反应的Vm和Km值，结果如表1所示。 

表1海洋碱性蛋白酶894及其固定化酶动力学参数的比较 

数据显示，固定化酶的米氏常数Km由游离酶的5.14g/L上升到8.38g/L，相应的最大反应初速度Vm则由游离酶的4.59×10^-4g/L/s降低到1.53×10^-4g/L/s，几乎降低了2倍。海洋碱性蛋白酶894经固定化后和底物的亲和力显著下降，这可能是由于固定化载体对酶活性中心结构造成了空间位阻，酶灵活性下降而底物扩散受阻，导致了酶和底物结合过程的减慢。 

由上述可见，本发明提供的方法进一步提高其使用效率，降低使用和生产成本，得到使用性稳定、活性回收高、使用周期长的固定化酶，在食品、纺织、饲料上有着广泛的用途。 

附图说明

图1Fe₃O₄磁核A和磁性壳聚糖复合微球B的扫描电镜SEM照片图 

图2Fe₃O₄磁核A、磁性壳聚糖复合微球B、壳聚糖C的傅立叶红外光谱FTIR图 

图3体系温度对固定化效果的影响 

图4固定化酶与游离酶的最适作用温度 

图5固定化酶和游离酶的温度稳定性 

图6固定化酶和游离酶的最适作用pH 

图7固定化酶和游离酶的pH稳定性 

图8固定化酶和游离酶的贮藏稳定性 

图9固定化酶的操作稳定性 

图10894游离酶的动力学曲线 

图11894固定化酶的动力学曲线 

具体实施方式

本发明提供的方法用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并非限于下列实施例。 

例1 

将30mL 0.5mol/L的FeCl₂溶液和50mL 0.5mol/L的FeCl₃溶液混合均匀，加入8.0g PEG4000，待充分溶解后在搅拌状态下快速滴加到100mL 5％的稀氨水中，并继续用氨水调节溶液pH值至9.0。继续搅拌30min后，超声10min，80℃水浴熟化30min，再次超声10min使溶液体系均匀细腻。最后在磁铁的吸附下倾去上清液，重蒸水洗 涤至中性，真空冷冻干燥得Fe₃O₄磁核。 

准确称取0.5g壳聚糖，溶解在20mL 5wt％的乙酸溶液中得到2.5wt％的壳聚糖乙酸溶液，在此体系中加入0.5g Fe₃O₄磁核并混合均匀。缓慢搅拌下逐滴滴入到5mL乳化剂Span-80和80mL液体石蜡组成的混合体系中，电动搅拌10min后迅速滴入5mL 10wt％的戊二醛溶液，继续在1500r/min下搅拌2h。最后在磁铁的吸附下分离制得的磁性壳聚糖复合微球，并依次用石油醚、丙酮和重蒸水反复洗涤，冷冻干燥得磁性壳聚糖复合微球。 

取上述冻干的磁性壳聚糖复合微球加入pH10.0的磷酸缓冲液浸润约24h，充分润湿溶胀后用磁铁吸附磁性壳聚糖复合微球并倾空磷酸缓冲液。于润湿的磁性壳聚糖复合微球中加入0.3g酶/g载体，pH10的海洋碱性蛋白酶894溶液，5-15℃温度下震荡吸附1h，4℃静置2h，加入戊二醛使达到0.1重量％终浓度后在5-15℃温度下震荡交联2h。制备好的磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶894用磁铁吸附收集，倾去未交联的溶液并用蒸馏水充分漂洗，得到的磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶低温保存，由Folm-酚法测定酶活力计算酶蛋白固定化率和酶活回收率61.9％。 

例2 

将25mL 0.6mol/L的FeCl₂溶液和40mL 0.6mol/L的FeCl₃溶液混合均匀，加入6.0g PEG4000，待充分溶解后在搅拌状态下快速滴加到120mL 5wt％的稀氨水中，并继续用氨水调节溶液pH值至9.0。继续搅拌25min后，超声15min，70℃水浴熟化40min，再次超声20min使溶液体系均匀细腻。最后在磁铁的吸附下倾去上清液，重蒸水洗涤至中性，真空冷冻干燥得Fe₃O₄磁核。 

准确称取0.5g壳聚糖，溶解在20mL 5wt％的乙酸溶液中得到2.5wt％的壳聚糖乙酸溶液，在此体系中加入上述0.25g Fe₃O₄磁核并混合均匀。缓慢搅拌下逐滴滴入到5mL乳化剂Span-80和80mL液体石蜡组成的混合体系中，电动搅拌15min后迅速滴入5mL 10wt％的戊二醛溶液，继续在1500r/min下搅拌2.5h。最后在磁铁的吸附下分离制得的磁性壳聚糖复合微球，并依次用石油醚、丙酮和重蒸水反复洗涤，冷冻干燥得磁性壳聚糖复合微球。 

取上述冻干的磁性壳聚糖复合微球加入pH10.0的磷酸缓冲液浸润约20h，充分润湿溶胀后用磁铁吸附磁性壳聚糖复合微球并倾空磷酸缓冲液。于润湿的磁性壳聚糖复合微球中加入0.2g酶/g载体，pH10的海洋碱性蛋白酶894溶液，5℃温度下震荡吸附2h，4℃静置2h，加入戊二醛使达到0.3重量％终浓度后在5℃温度下震荡交 联2h。制备好的磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶894用磁铁吸附收集，倾去未交联的溶液并用蒸馏水充分漂洗，得到的磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶低温保存，由Folm-酚法测定酶活力计算酶蛋白固定化率和酶活回收率52.3％。 

例3： 

将40mL 0.4mol/L的FeCl₂溶液和60mL 0.4mol/L的FeCl₃溶液混合均匀，加入10.0g PEG4000，待充分溶解后在搅拌状态下快速滴加到80mL 5wt％的稀氨水中，并继续用氨水调节溶液pH值至9.0。继续搅拌40min后，超声10min，90℃水浴熟化20min，再次超声20min使溶液体系均匀细腻。最后在磁铁的吸附下倾去上清液，重蒸水洗涤至中性，真空冷冻干燥得Fe₃O₄磁核。 

准确称取0.8g壳聚糖，溶解在20mL 5wt％的乙酸溶液中得到2.5wt％的壳聚糖乙酸溶液，在此体系中加入0.5g Fe₃O₄磁核并混合均匀。缓慢搅拌下逐滴滴入到5mL乳化剂Span-80和80mL液体石蜡组成的混合体系中，电动搅拌15min后迅速滴入5mL10wt％的戊二醛溶液，继续在1500r/min下搅拌3h。最后在磁铁的吸附下分离制得的磁性壳聚糖复合微球，并依次用石油醚、丙酮和重蒸水反复洗涤，冷冻干燥得磁性壳聚糖复合微球。 

取上述冻干的磁性壳聚糖复合微球加入pH10.0的磷酸缓冲液浸润约30h，充分润湿溶胀后用磁铁吸附磁性壳聚糖复合微球并倾空磷酸缓冲液。于润湿的磁性壳聚糖复合微球中加入0.5g酶/g载体，pH10的海洋碱性蛋白酶894溶液，15℃温度下震荡吸附2h，4℃静置4h，加入戊二醛使达到0.5重量％终浓度后在15℃温度下震荡交联1h。制备好的磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶894用磁铁吸附收集，倾去未交联的溶液并用蒸馏水充分漂洗，得到的磁性壳聚糖复合微球固定化海洋碱性蛋白酶低温保存，由Folm-酚法测定酶活力计算酶蛋白固定化率和酶活回收率48.9％。