PEG-PCL-PEG的新用途及装载抗原的混合物

摘要

本发明属于生物制剂领域，涉及PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物作为免疫佐剂在制备蛋白多肽疫苗中的应用。上述PEG-PCL-PEG共聚物，其分子量为1500～10000，其中PEG链段的分子量与PCL链段的分子量的比值为0.4～2.6。上述目标抗原为肿瘤生长因子类多肽，且上述复合物还可含有多糖成分。本发明复合物具有安全性好、包封率接近100％、批间差异小、成本低、制备简单、使用方便等优点，具有好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物制品领域，涉及PEG-PCL-PEG共聚物作为免疫佐剂以制备蛋白多肽疫苗的用途。

背景技术

免疫佐剂(immunoadjuvant)又称非特异性免疫增生剂。本身不具抗原性，但同抗原一起或预先注射到机体内能增强免疫原性(见抗原)或改变免疫反应类型。种类很多，目前尚无统一的分类方法，常用的佐剂可分为4类：无机佐剂，如氢氧化铝，明矾等；有机佐剂，微生物及其产物如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、百日咳杆菌、内毒素、细菌提取物(胞壁酰二肽)等；合成佐剂，如人工合成的双链多聚核苷酸(双链多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、异丙肌苷等；油剂，如弗氏佐剂、花生油乳化佐剂、矿物油、植物油等。弗氏佐剂目前在实验动物中最常用，又可分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种。免疫佐剂的生物作用包括：(1)抗原物质混合佐剂注入机体后，改变了抗原的物理性状，可使抗原物质缓慢地释放，延长了抗原的作用时间；(2)佐剂吸附了抗原后，增加了抗原的表面积，使抗原易于被巨噬细胞吞噬；(3)佐剂能刺激吞噬细胞对抗原的处理；(4)佐剂可促进淋巴细胞之间的接触，增强辅助T细胞的作用；(5)可刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞产生抗体，故免疫佐剂的作用可使无免疫原性物质变成有效的免疫原；(6)可提高机体初次和再次免疫应答的抗体滴变；(7)改变抗体的产生类型以及产生迟发型变态反应，并使其增强。

近年来，脂质体在免疫佐剂领域中开始得到应用。作为免疫佐剂，脂质体有着安全性好；毒副作用小；提高抗原稳定性，延长疫苗使用期；能降低被包裹抗原的毒性，增强受体耐受高剂量病原微生物或其毒素攻击的能力等优点。但是不同的疫苗是否都能使用脂质体作为免疫佐剂目前没有定论，不同疫苗所需要的脂质体免疫佐剂的配方还需要反复地寻找和筛选；并且脂质体作为佐剂成本高、包封率低、制备复杂、批间差异大，在实际应用中有较大的困难。本领域目前需要开发新的、优秀的免疫佐剂。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为免疫佐剂的使用提供新的选择。本发明解决技术问题的技术方案是提供PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物作为免疫佐剂的新用途。

其中，上述用途中的PEG-PCL-PEG共聚物，其分子量为1500～10000，其中PEG链段的分子量与PCL链段的分子量的比值为0.4～2.6。

其中，上述用途中的PEG-PCL-PEG共聚物分子量为2000～8000，其中PEG链段的分子量与PCL链段的分子量的比值为0.5～2。

其中，上述用途中的PEG-PCL-PEG共聚物为E₅₅₀-C₂₂₀₀-E₅₅₀、E₇₅₀-C₃₀₀₀-E₇₅₀、E₇₅₀-C₂₅₀₀-E₇₅₀、E₇₅₀-C₇₅₀-E₇₅₀或E₂₀₀₀-C₄₀₀₀-E₂₀₀₀；其中E表示PEG，C表示PCL，下标分别表示相应链段的分子量。

本发明所解决的第二个技术问题是提供了一种PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物作为免疫佐剂装载目标抗原制成的复合物。

其中，上述复合物中的PEG-PCL-PEG共聚物，其分子量为1500～10000，其中PEG链段的分子量与PCL链段的分子量的比值为0.4～2.6。

其中，上述复合物中的PEG-PCL-PEG共聚物分子量为2000～8000，其中PEG链段的分子量与PCL链段的分子量的比值为0.5～2.25。优选的，上述PEG-PCL-PEG共聚物中PCL的相对分子质量与PEG的相对分子质量的比值优选为1.75～2.25。更优选的，上述嵌段共聚物中PCL的相对分子质量与PEG的相对分子质量的比值为2。

其中，上述复合物中的PEG-PCL-PEG共聚物为E₅₅₀-C₂₂₀₀-E₅₅₀、E₇₅₀-C₃₀₀₀-E₇₅₀、E₇₅₀-C₂₅₀₀-E₇₅₀、E₇₅₀-C₇₅₀-E₇₅₀或E₂₀₀₀-C₄₀₀₀-E₂₀₀₀；其中E表示PEG，C表示PCL，下标分别表示相应链段的分子量。

其中，上述复合物为水凝胶，其中的PEG-PCL-PEG共聚物浓度为15wt％～40wt％；较优为20wt％～30wt％；更优选浓度为25wt％。

其中，上述复合物中的目标抗原为肿瘤生长因子类多肽。

其中，上述复合物中的目标抗原为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或其具备抗原性的短肽(tbFGF)。bFGF短肽为缺失部分氨基酸残基但是仍具有同样活性的bFGF短肽(tbFGF)。

进一步的，上述复合物还含有多糖成分。

其中，上述复合物中的多糖为甘露聚糖。其中，上述复合物中的bFGF蛋白或短肽与多糖的重量比例为1∶0.2～5，优选比例为1∶2。

其中，上述复合物中PEG-PCL-PEG的用量则根据实际使用的抗原剂量和注射时的复合物或者疫苗体积确定，以使液态复合物或液态疫苗中的PEG-PCL-PEG浓度为15wt％～40wt％为宜，较优为15wt％～35wt％，最优为25wt％。

根据本发明，在实际使用中，本发明复合物(疫苗)可将目标抗原(如bFGF或短肽)、PEG-PCL-PEG共聚物、多糖溶解于水或生理盐水中后，再冷冻干燥成粉末形成。将此复合物装载于瓶中进行保藏，运输和销售。

在使用前使用时再将水或生理盐水注射入瓶中，配制成均匀溶液，然后进行皮下注射。皮下注射后一段时间内形成凝胶，凝胶缓慢降解，释放其装载的抗原成分。

同时，本发明复合物(或疫苗)可含有两分离的组分，A组分是PEG-PCL-PEG共聚物、多糖等溶解于水或生理盐水中后，再冷冻干燥所得到的粉末；B组分是目标抗原(如bFGF的冻干粉末)。A组分可装于A瓶中；B组分可装于B瓶中。

使用时，可将水或生理盐水分别注射入A瓶和/或B瓶中，形成均匀溶液，水或生理盐水的加入量为以使PEG-PCL-PEG浓度为15wt％～40wt％为宜，较优为15wt％～35wt％，最优为25wt％。再将B瓶和A瓶的均匀混合形成混合溶液，然后将该混合溶液进行皮下注射。皮下注射后一段时间将形成凝胶，凝胶缓慢降解，释放其装载的抗原及多糖成分。

当然，PEG-PCL-PEG共聚物与抗原成分的相对用量主要是满足能够在形成凝胶后有较好的包封率，而这是可以在一个较大的范围内波动的。如使用100ul复合物溶液进行疫苗注射，则其中可有15～35mg PEG-PCL-PEG共聚物，优选25mg；抗原成分(bFGF或其缺失部分氨基酸残基但是仍具备与受体结合活性的bFGF短肽)15～25μg，优选20μg。如果添加多糖成分，则其与抗原成分的重量比为1∶0.2-5，优选比例为1∶2。上述技术方案中使用的其缺失部分氨基酸残基但是仍具备与其活性的bFGF短肽可为N’-KRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVV SIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTY-C’。

本发明所解决的第三个技术问题是提供了由上述的复合物添加药学上所接受的辅助性成分制备而成疫苗。

本发明还提供了制备上述的复合物的方法，其方法在于包括以下步骤：将PECE共聚物溶解于水或生理盐水中，冷却至4℃形成溶液；将所需量的抗原(如碱性成纤维细胞生长因子)和多糖(如甘露聚糖)加入至PECE溶液中形成均匀溶液。

当上述复合物中含有多糖时，制备方法为：将PECE共聚物溶解于水或生理盐水中，冷却至4℃形成溶液；将所需量的抗原(如碱性成纤维细胞生长因子)加入至PECE溶液中形成均匀溶液。

本发明上述复合物及其制备方法中使用的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)可以是其全长蛋白，也可以是其缺失部分氨基酸残基但是仍具备与碱性成纤维细胞生长因子同样的受体结合活性的bFGF短肽(tbFGF)。

根据本发明的再一个方面，本发明装载有bFGF的PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物复合物或装载有bFGF和多糖的PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物复合物可以作为肿瘤的抗血管生成治疗性疫苗和治疗血管生成相关疾病的疫苗，也可再添加药学上可以接受的辅助性成分制备成上述疫苗。

本发明的有益效果为：本发明利用PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物溶液作为免疫佐剂装载目标抗原形成复合物，同时复合物中还可以加入多糖成分。本发明复合物具有安全性好、包封率接近100％、批间差异小、成本低、制备简单、使用方便，能在体内形成凝胶缓慢释放等优点。并且实验证明使用PECE佐剂可以达到作为免疫佐剂研发标准的弗氏佐剂的水平，具有很好的免疫效果，为免疫佐剂的使用提供了新的选择。

附图说明

图1、装载有bFGF(200μg/ml)的PECE水凝胶(25wt％)的SEM照片。

图2、bFGF从bFGF-PECE水凝胶中释放出来的释放曲线。A：bFGF载药量对其释放行为的影响；B：SDS-PAGE实验表明bFGF从BFGF-PECE水凝胶中释放出来后其结构完整，泳道1：标记物；泳道2：标准的bFGF；泳道3：24小时；泳道4：72小时；泳道5：168小时；泳道6：336小时。

图3、皮下免疫NS(生理盐水)、空白PECE水凝胶、纯的bFGF、载有bFGF的PECE水凝胶复合物的各组在免疫后第四周的抗体滴度比较。老鼠是在第0周免疫一次，并在第四周收集血清。生理盐水组的IgG滴度被设为1。

图4、由单独bFGF以及载有bFGF的PECE水凝胶复合物所产生的IgG抗体滴度随着时间的变化曲线。

图5、免疫tbFGF各组小鼠肺重比较。

图6、免疫tbFGF各组小鼠肺转移灶的比较。

图7、本发明PEG-PCL-PEG共聚物的合成反应示意图，其中的X、Y均为正整数。

具体实施方式

以下结合附图通过对具体实施方式的描述以详细说明但不限制本发明。

实施例一PEG-PCL-PEG共聚物的合成和验证

1)PEG-PCL-PEG共聚物的合成

本发明PEG-PCL-PEG共聚物的合成反应路线如图7所示，其中的X、Y均为正整数。根据该合成路线，在装有搅拌器的三口烧瓶中加入一定量的聚乙二醇单甲醚(MPEG)和ε-己内酯(ε-CL)，以辛酸亚锡为催化剂，在130℃、氮气保护的条件下反应6小时，降温至80℃，加入交联剂异氟尔酮二异氰酸酯(IPDI)再继续反应6小时后得到产物，冷却至室温提纯，烘干。此外，适合的二异氰酸酯还包括：甲苯二异氰酸酯、六亚甲基二异氰酸酯(HMDI)、L-lysine ethyl ester diisocyanate(LDI，赖氨酸乙酯二异氰酸酯)、二苯基甲烷-4，4’-二异氰酸酯等。在进行上述反应时可以用上述二异氰酸酯替代IPDI进行偶联反应。

根据上述方法，合成了

E₅₅₀-C₂₂₀₀-E₅₅₀、E₇₅₀-C₃₀₀₀-E₇₅₀、E₇₅₀-C₂₅₀₀-E₇₅₀、E₇₅₀-C₇₅₀-E₇₅₀、E₂₀₀₀-C₄₀₀₀-E₂₀₀₀等系列共聚物(见表1)。

表1合成的PEG-PCL-PEG共聚物

^a根据投料比计算出来的理论值

^b根据核磁共振氢谱测试结果计算出来的数值；

2、PEG-PCL-PEG共聚物的验证

(1)、本发明PEG-PCL-PEG共聚物的表征方法

用傅里叶红外光谱仪(FTIR)(200SXV，Nicolet)，采用KBr压片法对合成的共聚物进行红外光谱分析。¹H-NMR用核磁共振仪(Varian 400，Varian)测量，在400MHZ下，溶剂为CDCl₃，以四甲基硅烷为内标。各种PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物的分子量和PEG与PCL的嵌段比例根据核磁共振氢谱检测来确定。根据上述试验结果可以得出结论：本实施例已经成功地合成了理论值为E₅₅₀-C₂₂₀₀-E₅₅₀、E₇₅₀-C₃₀₀₀-E₇₅₀、E₇₅₀-C₂₅₀₀-E₇₅₀、E₇₅₀-C₇₅₀-E₇₅₀、E₂₀₀₀-C₄₀₀₀-E₂₀₀₀的PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物。

实施例二以PEG-PCL-PEG共聚物(PECE)作为佐剂的疫苗的制备

将PECE共聚物溶解于生理盐水中，然后冷却至4℃形成溶液。将所需量的bFGF或tbFGF加入至PECE溶液中形成均匀溶液即得疫苗，其中PECE共聚物的浓度控制在15wt％～40wt％为宜，较优为15wt％～35wt％，25wt％左右最佳。实际使用时将该溶液行皮下注射，稍后会在皮下成为凝胶。

本实施例制备的疫苗是在100μLPEG-PCL-PEG-bFGF复合物中，含有20μg的bFGF或tbFGF、25mg的PECE共聚物，溶剂为生理盐水，生理盐水的用量为使体系PECE浓度为25％。其使用后形成的凝胶的微观结构见图1。

本实例同时进行了在pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中的释放实验。bFGF从bFGF-PECE水凝胶复合物中释放出来的释放曲线见图2。其中A：bFGF载药量对其释放行为的影响；B：SDS-PAGE实验表明bFGF从bFGF-PECE(E₅₅₀-C₂₂₀₀-E₅₅₀)水凝胶中释放出来后其结构完整，泳道1：标记物：泳道2：标准的bFGF；泳道3：24小时；泳道4：72小时；泳道5：168小时；泳道6：336小时。结果表明其释放行为较好，释放出的bFGF结构完整。

实施例三PEG-PCL-PEG抗原复合物动物免疫实验

材料：重组人bFGF购自R&D公司，纯度大于97％。tbFGF为自行构建载体表达制备的，纯度大于99％(该多肽的序列为：N’-KRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTY-C’，具体序列及制备过程参见中国专利申请200810304731.X，“成纤维生长因子受体介导的血管靶向脂质体载体及制备方法和用途”)。甘露聚糖购自SIGMA公司，产品编号M7504。

本实例的试验组中，使用的动物为6周大小的雌性BALB/c小鼠，每组6只，bFGF的使用量均为20μg。载有bFGF的PECE复合物组是在100μL复合物中，含有20μg的bFGF、40μg的甘露聚糖、25mg的PECE共聚物(E₅₅₀-C₂₂₀₀-E₅₅₀)，溶剂为生理盐水，生理盐水的用量为使体系PECE浓度为25％，其余各组的生理盐水用量参照确定。

处理方法是在第0周进行单独bFGF组和载有bFGF的PECE复合物组免疫后，每隔两周抽血用ELSA法检查其抗体滴度。

皮下免疫NS(生理盐水)、空白PECE共聚物、单独的bFGF、载有bFGF的PECE复合物的各组的抗体滴度比较值见图3。结果表明载有bFGF的PECE复合物组的抗体滴度远远高于单独的bFGF。

由单独bFGF以及载有bFGF的PECE水凝胶复合物所产生的IgG抗体滴度随着时间的变化曲线见图4。结果表明载有bFGF的PECE复合物组各时间段的抗体滴度均远高于单纯的bFGF组。

实施例四PEG-PCL-PEG抗原复合物抗肿瘤作用研究

以下的试验组中，使用的动物老鼠6周大小的雌性C57BL/6J小鼠，每组6只，tbFGF的使用量均为20μg。载有tbFGF的PECE复合物组为在100μL复合物中，含有20μg的tbFGF、40μg的甘露聚糖、25mg的PECE共聚物(E₅₅₀-C₂₂₀₀-E₅₅₀)，溶剂为生理盐水，生理盐水的用量为使体系PECE浓度为25％，其余各组的生理盐水用量参照确定。

处理方法是在第0、2、4周进行tbFGF复合有弗氏佐剂组(FA-tbFGF)和载有tbFGF的PECE复合物组(Hy-tbFGF)免疫后，第5周尾静脉接种3×10⁵LL/2结肠癌细胞。第18天后处死小鼠，称取肺重，计算肺结节数以说明其转移灶的情况。

图5显示各组小鼠的肺重，FA-tbFGF组和Hy-tbFGF组的小鼠肺重明显低于生理盐水组，差异具有显著性(P＜0.01)。图6显示各组小鼠的肺结节数，同样，FA-tbFGF组和Hy-tbFGF组的肺结节数远低于生理盐水组，具有显著性差异(P＜0.01)。结果表明，使用PECE佐剂的tbFGF可以达到使用弗氏佐剂(免疫佐剂金标准)的tbFGF的抗肿瘤水平。

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