一类新的STAT3通路抑制剂和癌干细胞通路抑制剂

摘要

本发明涉及一类新的癌干细胞通路(CSCP)抑制剂的用途；利用此类化合物治疗顽固性、复发性或转移性癌症的方法；通过利用此类化合物以特定施用策略选择性杀死癌细胞的方法；通过抑制Stat3通路靶向癌干细胞的方法；利用新化合物治疗哺乳动物异常Stat3通路活性相关病情或紊乱的方法；以及制备此类化合物及其中间体的方法；相关化合物的药物组合物；和施用这些化合物的具体方法。

说明书

对相关申请的引用

本申请要求分别于2007年9月10日和2007年12月13日递交的美国临时专利申请No.60/971,144和61/013,372的优先权和权益，所述申请的全部内容并入本文作为参考。

发明领域

本发明一般地涉及Stat3通路抑制剂用于治疗病情(conditions)的用途。更具体地，本发明涉及Stat3通路抑制剂用于靶向癌干细胞、以及治疗其他紊乱的用途。甚至更具体地，本发明涉及萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮及相关化合物用于抑制Stat3、靶向癌干细胞、以及治疗恶性疾病的用途。本发明还涉及顽固性、复发性或转移性癌症的治疗，制备相关化合物及其中间体的方法，以及相关化合物的药物组合物。

发明背景

癌干细胞(CSC)

近年来，一种新的肿瘤发生模型得到了广泛认可，其中提出假说，在全部肿瘤物质中仅一小部分负责肿瘤内的致瘤活性，而老的模型或者说克隆遗传模型却假定所有突变的肿瘤细胞均等同地贡献于此致瘤活性。根据新模型，这小部分肿瘤发生细胞是具有干细胞样性能的转化细胞，并称为“癌干细胞”(CSC)。在20世纪90年代，Bonnet和Dick首先在体内证明了急性髓性白血病(AML)中CSC的存在。他们的数据表明，仅小亚群的人AML细胞在移植到免疫缺陷小鼠中时具有转移AML的能力，而其他AML细胞不能够诱发白血病。后来，证明这些CSC具有与原始造血干细胞相同的细胞标志CD34⁺/CD38^-[1]。从那以后，研究人员已经确凿地在多种类型的肿瘤(包括脑、乳腺、皮肤、前列腺等的肿瘤)中发现CSC。

肿瘤发生的CSC模型能够解释为什么为了确立肿瘤移植物，需要将几万或几十万的肿瘤细胞注射到试验动物体内。在人AML中，这些CSC细胞的频率低于万分之一[2]。尽管CSC在一个给定的肿瘤细胞群体中是稀少的，但有增加的证据表明此类细胞存在于几乎所有肿瘤类型中。然而，由于癌细胞系是从特异地适应于组织培养生长的癌细胞亚群中选择的，所以癌细胞系的生物学及功能特性可能经历显著的变化。因此，并非所有的癌细胞系都含有CSC。

癌干细胞与正常干细胞享有许多相似的性状。例如，CSC具有自我更新能力，即产生其他的致瘤性癌干细胞的能力，一般速率比其他分裂肿瘤细胞低，但非有限次数的分裂。CSC还具有分化成多种细胞类型的能力，这就解释了如下组织学现象——许多肿瘤不仅含有多种对宿主器官而言天然的细胞类型，而且肿瘤转移中常常保持异质性。已经证明CSC根本性地负责肿瘤发生、癌症转移和癌症复发。CSC也称为肿瘤起始细胞、癌干细胞样细胞、干细胞样癌细胞、高致瘤性细胞、肿瘤干细胞、实体瘤干细胞或超级恶性细胞。

癌干细胞的存在对于未来的癌症治疗和疗法具有根本性的意义。这些意义表现在疾病鉴定、选择性药物靶向、预防癌症转移和复发、以及开发新的策略对抗癌症方面。

目前癌症治疗的功效在检验的初始阶段往往以肿瘤大小的缩减来衡量，即去掉的肿瘤物质的量。由于CSC构成肿瘤的一个极小部分，且具有与其更为分化的子代显著不同的生物学特征，所以对肿瘤质量的测量可能不一定能够选择出特异地作用于此干细胞的药物。事实上，癌干细胞呈现出放疗(XRT)耐药性，并且还呈化疗剂和靶向药物顽固性[3-5]。正常的体干细胞天然地对化疗剂具有耐药性——他们具有将药物泵出的多种泵(例如MDR)以及DNA修复蛋白质。而且，他们还具有缓慢的细胞更新速率，而化疗剂靶向快速复制的细胞。癌干细胞为正常干细胞的突变对应物，可能也具有类似的机制使之幸免于药物治疗和放射治疗。换言之，传统的化疗法和放疗法杀死分化了的或分化中的细胞，这些细胞构成肿瘤的大部分，不能产生新的高致瘤性癌干细胞。另一方面，产生所述分化了的或分化中的细胞的癌干细胞群可能保持原样并引起疾病复发。传统抗癌疗法的另一危险在于化疗可能导致仅仅留下耐受化疗的癌干细胞，由此使得继发的复发性肿瘤很可能也是化疗耐受的。

由于存活的癌干细胞能够使肿瘤重新建殖故而造成复发，所以在抗癌疗法中纳入抗CSC策略是绝对必要的(见图1)。这就类似于斩草需除根[6]。通过选择性地靶向癌干细胞，可以治疗患有侵袭性不可切除肿瘤和顽固性或复发性癌症的患者，以及防止肿瘤转移和复发。开发靶向癌干细胞的特异性疗法可以改善癌症患者、尤其是转移性癌症受害者的存活和生活质量。开启这股未被利用的潜力的关键在于鉴定和验证对于癌干细胞自我更新和存活具有选择的重要性的通路。不幸的是，虽然在过去已阐述过位于癌症的肿瘤发生或者胚胎干细胞和成体干细胞的自我更新背后的多个通路，但是尚未鉴定和验证用于癌干细胞自我更新和存活的通路。

也有许多鉴定和分离癌干细胞的研究。所用的方法主要是利用CSC外排药物的能力，或是基于癌干细胞相关表面标志的表达。

例如，由于CSC对许多化疗剂具有耐药性，那么CSC几乎普遍地过表达药物外排泵如ABCG2(BCRP-1)[7-11]及其他ATP结合盒(ABC)超家族成员[12，13]，就不足为奇。从而，也采用最初用来富集造血和白血病干细胞的侧群(side population，SP)技术来鉴定和分离CSC[14]。这种技术首先由Goodell等人描述，利用荧光染料如Hoechst 33342的差异性ABC转运蛋白依赖性外排来确定和分离富含CSC的细胞群[10，15]。具体而言，通过用戊脉安(verapamil)阻断药物外排来揭示该SP，此时染料不再能够泵出该SP。

研究人员还集中于寻找使癌干细胞区别于大部分肿瘤的特异性标志。癌干细胞最常表达的表面标志包括CD44、CD133和CD166[16-22]。通过主要基于这些表面标志的差异表达来分选肿瘤细胞，已经导致了迄今描述的高致瘤性CSC的大多数。因此，对于从癌细胞系和大块肿瘤组织中鉴定和分离癌干细胞而言，这些表面标志是被充分验证了的。

Stat3通路

哺乳动物或人癌细胞中有许多不同的遗传缺陷，且有许多已被研究以寻求治愈癌症。例如，已经发现p53肿瘤阻遏蛋白在半数以上的人类癌症中是缺陷型的或者全然无存。STAT(信号转导及转录活化因子)蛋白家族是潜伏的转录因子，响应细胞因子/生长因子而被激活以促进增殖、存活及其他生物过程。其中，Stat3通过由生长因子受体酪氨酸激酶、Janus激酶或Src家族激酶等介导的关键酪氨酸残基磷酸化而激活。这些激酶包括但不限于EGFR、JAK、Abl、KDR、c-Met、Src和Her2[23]。一旦酪氨酸磷酸化，Stat3形成同源二聚体，转位至细胞核，结合靶基因启动子区中的特异性DNA效应元件，诱导基因表达[24]。

在正常细胞中，Stat3激活是瞬时的，受到严密的调控，持续30分钟至数小时。然而，发现Stat3在广泛种类的人类癌症(包括所有主要的癌症以及一些血液肿瘤)中异常激活。Stat3在癌症进展中起多种作用。作为一种有力的转录调控因子，它靶向参与许多重要细胞功能的基因，例如Bcl-xl、c-Myc、细胞周期蛋白D1、Vegf、MMP-2和生存素[25-30]。它也是肿瘤免疫监视和免疫细胞募集的关键负调控因子[31-33]。

通过反义、siRNA、显性失活形式的Stat3和/或阻断酪氨酸激酶，消除Stat3信号传递，在体外和/或体内可以抑制某些癌细胞系或肿瘤[24，26，34，35]。但是尚未经验性地提出Stat3和癌干细胞功能之间的清楚关联。研究人员也尚未发现有效的Stat3通路抑制剂以开发针对已经发现含有癌干细胞的癌症的潜在治疗应用。如早先所说明的那样，最近已经证明癌干细胞(CSC)根本性地负责肿瘤发生、转移和复发，故而在设计靶向已知具有这些细胞的肿瘤的任何治愈性疗法时，不论CSC可能占该肿瘤物质的多小比例，都应将其考虑在内。

在除癌症以外的疾病中，已经在许多自身免疫疾病和炎性疾病中证明了白介素6(IL6)对Stat3的过度激活[36]。最近已经揭示，Stat3通路还通过其在产生TH17T细胞应答中的基本作用而促进病理性免疫反应[37]。另外，已经发现IL6-Stat3通路介导的炎症是动脉粥样硬化、外周血管疾病、冠状动脉疾病、高血压、骨质疏松症、2型糖尿病和痴呆的共同病因。

发明概述

本发明部分地基于本文提供的如下经验性证据，即Stat3在广谱癌症中对癌干细胞(CSC)的存活和自我更新能力均起着关键作用。从而，本发明的第一方面涉及抑制癌干细胞的方法，其中该方法包括通过Stat3通路抑制剂抑制癌干细胞中的至少一些、大多数、或基本上所有(例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％)的Stat3通路活性。该方法抑制CSC自我更新、或杀死CSC。该方法可在体外实施、或体内实施以治疗癌症，尤其是具有CSC和具有异常(例如过度激活)的Stat3通路活性的癌症。这两个标准可通过学院知识(即患者的癌症属于已知具有CSC和异常Stat3通路活性的类型)来满足，或者可例如通过对活检组织进行检验而由个体患者确认。在优选的实施方案中，CSC已知或被确认具有异常Stat3通路活性。

目前已知既具有CSC又具有异常Stat3通路活性的癌症包括但不限于：乳腺癌、头颈部癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、结直肠癌、前列腺癌、黑素瘤、肉瘤、肝癌、脑瘤、多发性骨髓瘤和白血病。还发现这些癌症的转移形式中有许多既具有CSC又具有异常Stat3通路活性，例如转移性乳腺癌。在一个特征中，可实施本发明的方法以治疗选自该组的癌症。在一个实施方案中，可实施本发明的方法以治疗选自如下的癌症：肺癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、肝癌、头颈部癌、胰腺癌、胃癌和前列腺癌。

此外，由于已经证明CSC根本性地负责肿瘤发生、癌症转移和癌症复发，所以可实施本发明的方法以治疗转移性的、化疗或放疗顽固性的、固有地抵抗化疗的、或在初始治疗后在受试者体内复发的癌症。在一个实施方案中，Stat3通路抑制剂是分离的、纯化的或合成的，并且可选自下组：小分子Stat3抑制剂、针对Stat3的RNAi药剂、针对Stat3的反义药剂、肽模拟物Stat3抑制剂和G四联体寡聚脱氧核苷酸Stat3抑制剂。抑制机制可选自：基本上抑制Stat3蛋白的磷酸化、基本上抑制Stat3蛋白的二聚化、基本\上抑制Stat3蛋白的核转位(nuclear translocation)、基本上抑制Stat3蛋白的DNA结合活性、和基本上抑制Stat3蛋白的转录活性。

在一个实施方案中，抑制剂是选自下组的化合物：2-(1-羟乙基)-萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮、2-乙酰基-7-氯-萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮、2-乙酰基-7-氟-萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮、2-乙酰基萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮、2-乙基-萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮、磷酸单-[1-(4，9-二氧代-3a，4，9，9a-四氢-萘并[2，3-b]呋喃-2-基)-乙烯基]酯、磷酸1-(4，9-二氧代-3a，4，9，9a-四氢-萘并[2，3-b]呋喃-2-基)-乙烯基酯二甲酯、其对映异构体、非对映异构体、互变异构体、盐或溶剂化物(下文称作“本发明化合物”)。

第二方面，本发明提供了抑制细胞中的细胞Stat3通路活性的方法。该方法包括向细胞施用有效量的本发明化合物，从而降低细胞中至少不期望的Stat3通路活性，例如降低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一个实施方案中，细胞是CSC，或者是癌细胞。该方法可以诱导细胞死亡或抑制细胞的自我更新。该方法可在体外或体内实施。

第三方面，本发明提供了治疗或预防受试者的异常Stat3通路活性相关紊乱的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的、包含本发明化合物的药物组合物，从而降低至少异常Stat3通路活性。在一个特征中，异常Stat3通路活性可通过磷酸化Stat3的表达或Stat3磷酸化的替代性(surrogate)上游或下游调控因子的表达来鉴定。紊乱可为癌症。在一个实施方案中，癌症已知具有异常Stat3通路活性，并且包括但不限于：乳腺癌、头颈部癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、结直肠癌、前列腺癌、肾细胞癌、黑素瘤、肝细胞癌、宫颈癌、肉瘤、脑瘤、胃癌、多发性骨髓瘤、白血病和淋巴瘤。紊乱还可以是已知与异常Stat3通路活性相关的非癌症病情，并且在一个实施方案中选自：自身免疫性疾病、炎性疾病、炎症性肠道疾病、关节炎、自身免疫性脱髓鞘病、阿尔茨海默病、中风、缺血再灌注损伤和多发性硬化症。

第四方面，本发明提供了治疗患者的方法，并且包括步骤：通过异常Stat3通路活性鉴定患者以及向患者施用治疗有效量的本发明化合物。在一个实施方案中，通过异常Stat3通路活性来鉴定患者的步骤包括检验磷酸化Stat3的表达或Stat3磷酸化的替代性上游或下游调控因子的表达。通过异常Stat3通路活性鉴定患者的步骤可以包括检验取自患者的患病组织或液体，其可以是肿瘤的一部分。

第五方面，本发明提供了治疗患者的方法，包括鉴定诊断患有异常Stat3通路活性相关紊乱的患者以及向患者施用治疗有效量的本发明化合物的步骤。在一个实施方案中，鉴定患者的步骤包括检查至少一种在患者中指示该紊乱的生物标志。

第六方面，本发明提供了试剂盒，其包括至少一种用于诊断异常Stat3通路活性相关紊乱的试剂(其可检查指示紊乱存在的生物标志)，和治疗有效量的本发明化合物。

第七方面，本发明提供了试剂盒，其包括至少一种用于诊断异常Stat3通路活性的试剂，和治疗有效量的本发明化合物。在一个实施方案中，所述试剂检查磷酸化Stat3的表达或Stat3磷酸化的替代性上游或下游调控因子的表达。

第八方面，本发明提供了抑制一种或多种癌干细胞的方法。该方法包括向癌干细胞施用有效量的本发明化合物。该方法可在体外实施或在体内实施以治疗受试者癌症。在一个实施方案中，癌症已知具有CSC，并且包括但不限于：乳腺癌、头颈部癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、结直肠癌、前列腺癌、肝癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤、脑瘤、肉瘤、成神经管细胞瘤和白血病。在一个实施方案中，癌症是转移性的。在另一实施方案中，癌症是化疗或放疗顽固性的。例如，癌症可固有地抵抗化疗。而在另一实施方案中，癌症经初始治疗后在受试者复发。

第九方面，本发明提供了鉴定能够抑制癌干细胞的候选药物的方法，该方法包括筛选抑制Stat3通路活性的候选药物。候选药物在一个实施方案中能够在癌干细胞中诱导细胞死亡，而在另一个实施方案中能够抑制CSC的自我更新。在多个实施方案中，候选药物是小分子Stat3抑制剂、针对Stat3的RNAi药剂、针对Stat3的反义药剂、肽模拟物Stat3抑制剂、或G四联体寡聚脱氧核苷酸Stat3抑制剂。候选药物可以具有选自如下的能力：基本上抑制Stat3蛋白的磷酸化、基本上抑制Stat3蛋白的二聚化、基本上抑制Stat3蛋白的核转位、基本上抑制Stat3蛋白的DNA结合活性、和基本上抑制Stat3蛋白的转录活性。

第十方面，本发明提供了治疗受试者中对标准治疗具顽固性的癌症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的、包含本发明化合物的药物组合物。标准治疗可为例如化疗、放疗和/或手术。在一个实施方案中，癌症固有地抵抗化疗。

第十一方面，本发明提供了治疗或预防受试者癌症复发的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的、包含本发明化合物的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物作为手术后的辅助治疗施用。

第十二方面，本发明提供了治疗或预防受试者癌症转移的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的、包含本发明化合物的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物作为手术后的辅助治疗施用。

第十三方面，本发明提供了选择性地靶向受试者癌细胞以例如治疗恶性疾病的方法，该方法包括向受试者施用包含本发明化合物的药物组合物，使每剂量后受试者血浆中的化合物浓度维持在临界浓度之上不超过24小时，由此选择性地杀死癌细胞而基本上不伤害正常细胞。可选地，根据本发明的方法，在每剂量后化合物血浆浓度在特定时间点(例如12、16、20或24小时)不超过临界浓度。在一个实施方案中，施用药物组合物，使每剂量后受试者血浆中的化合物浓度维持在临界浓度之上(例如，持续地维持)不超过选自下组的持续时间：12、16和20小时。在多个实施方案中，临界浓度为约100μM、约50μM、约30μM、或约20μM。在一个实施方案中，癌细胞是选自下组或其任何亚组的癌症的一部分：肝癌、头颈部癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、肉瘤、多发性骨髓瘤、转移性乳腺癌、白血病、淋巴瘤、食道癌、脑瘤、神经胶质瘤、膀胱癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、胆管癌、骨癌、眼癌(成视网膜细胞瘤)、胆囊癌、垂体癌、直肠癌、涎腺癌、鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、成神经细胞瘤、宫颈癌、白血病、黑素瘤、口腔上皮癌(oral epithermoid)、角质形成细胞癌和皮肤癌。在另一实施方案中，癌细胞是选自下组的癌症的一部分：肺癌、乳腺癌(包括转移类型)、宫颈癌、结直肠癌、肝癌、头颈部癌、胰腺癌、胃癌和前列腺癌。

第十四方面，本发明提供了治疗受试者癌症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的、包含本发明化合物的药物组合物。可应用根据本发明该方面的方法来治疗与就本发明之前各方面描述的癌症类似的癌症。在一个特征中，治疗的受试者是哺乳动物，例如人类。

第十五方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明化合物和可药用的赋形剂、载体或稀释剂，其中本发明化合物为选自下组的化合物：2-(1-羟乙基)-萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮、2-乙酰基-7-氯-萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮、2-乙酰基-7-氟-萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮、2-乙酰基萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮、2-乙基-萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮、磷酸单-[1-(4，9-二氧代-3a，4，9，9a-四氢-萘并[2，3-b]呋喃-2-基)-乙烯基]酯、磷酸1-(4，9-二氧代-3a，4，9，9a-四氢-萘并[2，3-b]呋喃-2-基)-乙烯基酯二甲酯、其可药用盐或溶剂化物。在一个特征中，组合物适合于口服、经鼻、局部、直肠、阴道或胃肠外施用，或静脉内、皮下或肌肉内注射。

第十六方面，本发明还提供了制备一些本发明化合物的方法。该方法通过使通式4-4的化合物

在碱和氧化剂的存在下在溶剂中与酮反应来制备通式4-6的化合物：

其中R₁是H、Cl或F。氧化剂可为例如O₂、Br₂或CBrCl₃。在一个实施方案中，反应在开放式(open air)容器中进行。在一个特征中，该方法的所有步骤在一个罐中、即在同一容器中进行。在多个例示性的实施方案中，溶剂可以是四氢呋喃(THF)、二噁烷、或甲苯，而碱可以是1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、三乙胺或二异丙基乙胺。

在上述方法的一个实施方案中，酮是通式4-3的化合物：

上述方法可进一步包括如下步骤：

使通式4-1的化合物

在有或无溶剂的情况下与溴化物反应以产生通式4-2的化合物：

随后，使通式4-2的化合物在溶剂中在碱的存在下进行反应以产生通式4-3的化合物：

第十七方面，本发明提供了具有式磷酸单-[1-(4，9-二氧代-3a，4，9，9a-四氢-萘并[2，3-b]呋喃-2-基)-乙烯基]酯的化合物。

第十八方面，本发明提供了具有式磷酸1-(4，9-二氧代-3a，4，9，9a-四氢-萘并[2，3-b]呋喃-2-基)-乙烯基酯二甲酯的化合物。

第十九方面，本发明提供了制备化合物磷酸单-[1-(4，9-二氧代-3a，4，9，9a-四氢-萘并[2，3-b]呋喃-2-基)-乙烯基]酯的方法，该方法包括使化合物2-乙酰基萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮与选自下组的溶液反应：双(三甲基甲硅烷基)氨基锂、双(三甲基甲硅烷基)氨基钠和双(三甲基甲硅烷基)氨基钾，接着添加氯磷酸二甲酯溶液。该方法可以进一步包括纯化由反应获得的粗产物：将产物溶解在CH₂Cl₂中，用饱和NH₄CL和水洗涤，用MgSO₂干燥，随后对产物进行柱层析。

第二十方面，本发明提供了制备化合物磷酸1-(4，9-二氧代-3a，4，9，9a-四氢-萘并[2，3-b]呋喃-2-基)-乙烯基酯二甲酯的方法，该方法包括使化合物磷酸单-[1-(4，9-二氧代-3a，4，9，9a-四氢-萘并[2，3-b]呋喃-2-基)-乙烯基]酯与三甲基甲硅烷基溴化物反应。该方法可进一步包括通过半制备性HPLC来纯化由反应获得的粗产物。

本发明的其他方面和实施方案在如下发明详述中阐释，或将会因其变得显而易见。

附图的简短说明

图1图示了癌干细胞特异性癌症疗法和传统癌症疗法之间的差异。

图2显示了癌中的Stat3通路。

图3A显示了Stat3在Hoechst侧群细胞中组成型地激活。

图3B显示了Stat3在CD133⁺细胞中组成型地激活。

图4A和4B显示了癌干细胞中的Stat3敲低(knockdown)诱导凋亡。

图5显示了癌干细胞中的Stat3敲低抑制癌干细胞球体形成。

图6显示了化合物401抑制Stat3的转录激活活性。

图7A显示了化合物401抑制核提取物中Stat3的DNA结合活性。

图7B显示了化合物401、416和418抑制核提取物中Stat3的DNA结合活性。

图8A显示了化合物401抑制异种移植肿瘤组织中Stat3的DNA结合活性。

图8B显示了化合物401抑制异种移植肿瘤组织中Stat3的下游效应子的表达水平。

图9A显示了Hoechst侧群的分选和分析。

图9B显示了Hoechst侧群对化合物401与非侧群一样敏感。

图10A显示了化合物401使Hoechst侧群细胞凋亡。

图10B显示了化合物401使CD133⁺细胞凋亡。

图11显示了化合物401阻断CD44^high球体形成。

图12显示了体内化合物401处理降低异种移植肿瘤细胞的球体形成。

图13显示了化合物401在癌细胞中诱导凋亡。

图14显示了化合物401在人胰腺癌异种移植物模型中呈现出抗肿瘤活性，且与标准化疗行为不同——其消除肿瘤反弹。

图15显示了化合物401在人头颈部癌异种移植模型中呈现出抗肿瘤活性。

图16显示了化合物401在人乳腺癌异种移植模型中呈现出抗肿瘤活性。

图17显示了化合物401在人前列腺癌异种移植模型中呈现出抗肿瘤活性。

图18显示了化合物401在人胃癌异种移植模型中呈现出抗肿瘤活性。

图19显示了化合物401在人肝癌异种移植模型中呈现出抗肿瘤活性。

图20显示了化合物401在ISMS模型中抑制转移。

图21显示了化合物401在大鼠中的药物代谢动力学。

发明详述

如本文所用，单数形式的“一”、“一个”和“该”包括复数引述，除非上下文另有清楚说明。例如，术语“细胞”包括多个细胞，包括其混合物。

如本文所用的术语“分离的”或“纯化的”是指物质实质上或基本上不含在其天然状态下与其正常相伴的成分。纯度和均质性一般可以利用分析化学技术来确定，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱。

如本文所用，术语“癌干细胞”和“CSC”可互换。CSC是哺乳动物的，并且在优选的实施方案中，这些CSC是人类来源的，但它们并非旨在限于此。癌干细胞定义为、并在功能上表征为：源于实体瘤的细胞群，其：(1)具有广泛的增殖能力；2)能够进行不对称细胞分裂，生成一种或多种类型具有减小的增殖或发育潜力的分化子代；和(3)能够进行对称细胞分裂以自我更新或自我维持。其他表征CSC的常见方法包括形态学和检查细胞表面标志、转录谱、和药物反应。CSC在研究文献中也称作肿瘤/癌症起始细胞、癌干细胞样细胞、干细胞样癌细胞、高致瘤细胞、肿瘤干细胞、实体瘤干细胞、药物存活细胞(DSC)、耐药性细胞(DRC)或超级恶性细胞。

如本文所用，术语“自我更新”是指癌干细胞产生新的致瘤性癌干细胞以补充或增加其数量的能力。

如本文所用，术语″癌症″和″癌变的″是指或者描述的是，哺乳动物中一群细胞以失控的细胞生长为特征的生理状况。如本文所用的“癌细胞”和“肿瘤细胞”是指源于肿瘤的总细胞群，既包括构成肿瘤细胞群体的大部分的非肿瘤发生性细胞，又包括肿瘤发生性干细胞(癌干细胞)。癌症的实例包括但不限于：癌(carcinoma)、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症更具体的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、涎腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头颈部癌。

如本文所用的“肿瘤”是指由于过度细胞生长或增值而产生的任何组织块，或良性(非癌变)或恶性的(癌变)，包括癌前病变。

如本文所用的“转移”(metastasis)是指癌症由起源位点扩散或转移到身体其他区域、在新位置上形成类似的癌性病变的过程。“转移性”或“转移”细胞是丧失与邻近细胞的粘附性接触、并借助血流或淋巴由疾病的原发部位迁移而浸润邻近身体结构的细胞。

如本文所用，术语“受试者”是指任何将作为特定治疗的接受者的动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿类动物等。一般，术语“受试者”和“患者”就人类受试者而言在本文可互换使用。

如本文所用的诸如“治疗”或“缓解”等术语既指1)治愈、减缓、减轻所诊断病情(condition)或紊乱的症状，和/或中断其进展的治疗性措施，又指2)防止或减缓所靶向病情或紊乱的发展的防范性或预防性措施。因而，需要治疗的包括已经患有紊乱的那些；易于患有紊乱的那些；以及欲预防紊乱的那些。如果患者显示出如下一种或多种状况，则该受试者被本发明的方法成功地“治疗”：癌细胞数量的减小或完全不存在癌细胞；肿瘤大小的减小；癌细胞向周围器官的浸润、包括癌向软组织和骨的扩散，的抑制或不存在；肿瘤转移的抑制或不存在；肿瘤生长的抑制或不存在；与具体癌症相关的一种或多种症状的减轻；减小的发病率和死亡率；和生活质量的提高。

如本文所用，当用在生物活性的语境中时，术语“抑制”及其语法等同体是指生物活性的下调，这可以减小或消除所靶向的功能，例如蛋白质的生产或分子的磷酸化。在特别的实施方案中，抑制可以指所靶向活性的约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的减小。当用于紊乱或疾病的语境中时，该术语是指成功地防止症状发作、缓解症状或消除疾病、病情或紊乱。

如本文所用的术语″可药用的赋形剂、载体或稀释剂″表示可药用的材料、组合物或媒介物，例如参与将主题药物活性剂由一种器官或身体部分携带或运输至另一器官或身体部分的液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。就与制剂中的其他成分相容且对患者无害这一意义上，各载体必须是″可接受的″。能够作为可药用载体的材料的一些实例包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；黄芪胶粉；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；甘醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；褐藻酸；无热原水；等渗盐水；林格液；乙醇；磷酸盐缓冲液；以及其他在药学制剂中采用的无毒相容物质。润湿剂、乳化剂和润滑剂(例如十二烷基硫酸钠、硬脂酸镁和聚环氧乙烷-聚环氧丙烷共聚物)、以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和香料剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。

本发明的化合物可以形成盐，这也落在本发明的范围内。本文述及本发明的化合物应理解为包括述及其盐，除非另有说明。如本文所采用的术语“盐”，表示与无机和/或有机酸和碱形成的酸加成盐和/或碱加成盐。另外，当本发明的化合物既含有碱性部分(例如但不限于吡啶或咪唑)、又含有酸性部分(例如但不限于羧酸)时，可以形成两性离子(“内盐”)，并包括在如本文所用的术语“盐”中。优选可药用的(即，无毒、生理上可接受的)盐，不过其他盐也是有用的，例如用于制备期间可能采用的分离或纯化步骤中。本发明化合物的盐可以，例如，通过使化合物I、II或III与一定量(例如等量)的酸或碱在介质(例如盐在其中沉淀的介质或在水性介质)中反应并之后冻干而形成。

本文也考虑本发明化合物的溶剂化物。本发明化合物的溶剂化物包括例如水合物。

最近的研究已经揭示了癌干细胞(CSC)的存在，其具有再生肿瘤的独有能力。CSC存在于几乎所有肿瘤类型中，且功能性地与持续的恶性生长、癌症转移、复发和癌症药物耐性关联。CSC与其更为分化的子代看起来具有显著不同的生物学特征。传统癌症药物筛选依赖于肿瘤物质的量的测量，因此它们可能不一定选择出特异性地作用于CSC的药物。事实上，已经证明CSC对标准化疗和放疗具有抵抗性，且在标准抗癌治疗后变得富集，这导致癌症的顽固性和复发。分离这些细胞的方法包括但不限于，通过其外排Hoechst 33342的能力来鉴定，通过这些细胞表达的表面标志如CD133、CD44、CD166等来鉴定，以及通过其肿瘤发生特性来富集。将癌干细胞与肿瘤发生关联起来的支持性证据开启了靶向癌干细胞的巨大治疗良机。

开启这股未被利用的潜力的关键在于鉴定和验证对于CSC自我更新和存活具有选择性重要性的通路。虽然在过去已阐述过位于癌症的肿瘤发生或者胚胎干细胞和成体干细胞的自我更新背后的多个通路，但是尚未鉴定和验证用于癌干细胞自我更新和存活的通路。

本发明提供了Stat3通路活性对于CSC的存活和自我更新均至关重要的证据(实施例1)。本发明还提供了为Stat3通路活性的有效抑制剂的化合物(实施例2)。本发明还提供了这些Stat3抑制剂确实抑制CSC的自我更新并对CSC具有凋亡作用的体外和体内数据(实施例3)。本发明还表明这些化合物能够在体外选择性地杀死广谱的癌细胞(实施例4)，且在体内抑制类似广泛范围的癌症(实施例5)。此外，本发明经验性地确证了Stat3抑制剂对转移性癌症的功效(实施例6)。而且，本发明经验性地确认了这些化合物能够达到期望的PK暴露以在体内选择性地杀死癌细胞(实施例7)。

本文提供的数据，结合CSC研究方面最近的突破，使得本发明可以提供一系列旨在抑制CSC、或者治疗具有CSC的特定癌症或治疗一般癌症的方法。本文还提供了抑制细胞中的Stat3通路活性、或治疗异常Stat3通路活性相关紊乱(癌的及非癌的)的方法。本发明还提供了相关的方法(例如，生产和候选药物筛选)、材料、组合物和试剂盒。

随着发现下调或阻断Stat3通路既抑制CSC的自我更新又抑制其存活(实施例1)，本发明提供了抑制癌干细胞的方法，其中通过Stat3通路抑制剂抑制CSC中的至少一些Stat3通路活性。在一个实施方案中，抑制大多数，即50％以上，的Stat3通路活性。在另一实施方案中，抑制基本上所有的Stat3通路活性。该方法能够阻止CSC自我更新，使其不再能够通过分裂成致瘤性CSC细胞而补充其数量。或者该方法能够在CSC中诱导细胞死亡。

该方法能够用来治疗受试者癌症。已知具有CSC和异常(例如过度激活或组成型激活的)Stat3通路活性的癌症是此类治疗的良好候选者，并且包括但不限于：乳腺癌、头颈部癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、结直肠癌、前列腺癌、肾细胞癌、黑素瘤、肝细胞癌、宫颈癌、肉瘤、脑瘤、胃癌、多发性骨髓瘤、白血病和淋巴瘤。在一实施方案中，该方法用来治疗肝癌、头颈部癌、胰腺癌和/或胃癌。在另一实施方案中，该方法用来治疗多发性骨髓瘤、脑瘤和肉瘤。

此外，由于已经证明CSC根本性地负责肿瘤发生、癌症转移和癌症复发，所以可实施涉及抑制CSC的任何本发明方法以治疗转移性的、化疗或放疗顽固性的、或经初始治疗后在受试者体内复发的癌症。

在一个实施方案中，抑制剂是分离的、纯化的或合成的，并且可选自：小分子Stat3抑制剂、针对Stat3的RNAi药剂、针对Stat3的反义药剂、肽模拟物Stat3抑制剂、和G四联体寡聚脱氧核苷酸Stat3抑制剂。抑制剂也可以从天然产物分离或纯化。

可选择抑制机制以靶向Stat3通路中的任何步骤。例如，抑制剂可基本上抑制Stat3蛋白的磷酸化、基本上抑制Stat3蛋白的二聚化、基本上抑制Stat3蛋白的核转位、基本上抑制Stat3蛋白的DNA结合活性、和/或基本上抑制Stat3蛋白的转录活性。可选地，Stat3通路抑制剂可以抑制Stat3通路中的一个或多个上游或下游组分。

Stat3通路可响应细胞因子(如IL-6)或被一系列酪氨酸激酶(如EGFR、JAK、Abl、KDR、c-Met、Src和Her2)激活。Stat3的下游效应子包括但不限于Bcl-xl、c-Myc、细胞周期蛋白D1、Vegf、MMP-2和生存素(图2)。发现Stat3通路在广泛种类的人类疾病中异常激活，如表1所示。所研究的既有临床样品显示，持久激活的Stat3通路存在于一半以上的乳腺癌和肺癌、肝细胞癌、多发性骨髓瘤中，以及95％以上的头颈部癌中。也已经在许多自身免疫病和炎性疾病中证实激活的Stat3。而且，由于细胞因子如白介素6(IL6)介导的炎症是动脉粥样硬化[38]、外周血管疾病[39，40]、冠状动脉疾病[39，40]、高血压[41]、骨质疏松症[42]、2型糖尿病[39]和痴呆[43]的共同病因，而gp130-Jaks-Stats是IL-6激活的主要通路，所以抑制Stat3通路也可以预防这些疾病。

表1.人类疾病中STAT3通路的激活

在一个实施方案中，根据本发明的Stat3抑制剂是：2-(1-羟乙基)-萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮、2-乙酰基-7-氯-萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮、2-乙酰基-7-氟-萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮、2-乙酰基萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮、2-乙基-萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮、磷酸单-[1-(4，9-二氧代-3a，4，9，9a-四氢-萘并[2，3-b]呋喃-2-基)-乙烯基]酯、磷酸1-(4，9-二氧代-3a，4，9，9a-四氢-萘并[2，3-b]呋喃-2-基)-乙烯基酯二甲酯、其对映异构体、非对映异构体、互变异构体、盐或溶剂化物(“本发明化合物”)(实施例2)。本发明还提供了本发明化合物抑制CSC的自我更新和在CSC中诱导凋亡的体外和体内数据(实施例3)。

由于已经提供了下调Stat3通路抑制CSC的证据，本发明提供了鉴定能够抑制癌干细胞的候选药物的方法。该方法包括筛选抑制Stat3通路活性的候选药物。在多个实施方案中，候选药物是小分子Stat3抑制剂、针对Stat3的RNAi药剂、针对Stat3的反义药剂、肽模拟物Stat3抑制剂、或G四联体寡聚脱氧核苷酸Stat3抑制剂。

在一个实施方案中，候选药物能够在CSC中诱导细胞死亡或至少抑制其自我更新。可靶向通路中的各阶段，以筛选候选药物。例如，该方法的多个实施方案可筛选基本上抑制Stat3蛋白的磷酸化、基本上抑制Stat3蛋白的二聚化、基本上抑制Stat3蛋白的核转位、基本上抑制Stat3蛋白的DNA结合活性、或基本上抑制Stat3蛋白的转录活性的候选药物。

如下文实施例2所示，本发明的化合物可以在体外抑制Stat3转录活性和Stat3DNA结合活性。实施例2还显示，本发明的化合物可以在体内既抑制Stat3下游效应子(例如细胞周期蛋白D1和生存素)的表达，又抑制Stat3DNA结合活性。

从而，另一方面，本发明提供了抑制细胞Stat3通路活性的方法，其中施用有效量的本发明化合物。另一方面，本发明的化合物可用来配制药物组合物以治疗或预防异常Stat3通路活性相关紊乱或病情。在本文中一种紊乱被视为与异常Stat3通路活性“相关”，条件是患有该紊乱(其可为该类紊乱的一个亚型)的患者典型地在其至少一些细胞中具有异常Stat3通路活性(这可以但并不必贡献于该紊乱的病理)。一些已知与异常Stat3通路活性相关的紊乱包括但不限于：自身免疫性疾病、炎性疾病、炎症性肠道疾病、关节炎、自身免疫性脱髓鞘病、阿尔茨海默病、中风、缺血再灌注损伤和多发性硬化症。一些已知与异常Stat3通路活性相关的紊乱是癌症，并且包括但不限于：多种类型的乳腺癌、头颈部癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、结直肠癌、前列腺癌、肾细胞癌、黑素瘤、肝细胞癌、宫颈癌、肉瘤、脑瘤、胃癌、多发性骨髓瘤、白血病和淋巴瘤。

与本发明该方面相关，提供了试剂盒，其包括一种或多种用于诊断异常Stat3通路活性相关紊乱的试剂，和治疗有效量的本发明化合物或其他有效的Stat3通路抑制剂。诊断剂取决于该疑似紊乱可为任何适宜的试剂，并且可以包括抽取血液、获取活检样品、筛选生物分子(例如抗原或抗体)或从样品提取遗传信息所需的试剂。试剂可以包括溶剂、去污剂、抗凝血剂、抗原、抗体、酶、PCR引物等等。

无论患者是否诊断为患有已知牵涉异常Stat3活性的紊乱，医师总是能够开嘱化验单以查看取自患者的活检样品中是否存在异常Stat3活性。因此，提供了试剂盒，其包括：一种或多种诊断异常Stat3通路活性的试剂，和治疗有效量的本发明化合物或其他有效的Stat3通路抑制剂。在一个特征中，异常Stat3通路活性可通过任何适宜的分析手段检查任何此类活性的指标来鉴定，例如检查磷酸化Stat3的表达(水平、持续时间等)或替代性Stat3磷酸化上游或下游调控因子的表达(水平、持续时间等)。与前面描述的试剂盒类似，取决于化验所着眼的异常Stat3通路活性的指标，诊断试剂可为任何适宜的试剂。

如下文实施例3所示，本发明的化合物，至少是Stat3通路抑制剂，杀死癌干细胞。实施例3还证明，本发明的化合物还在体外和体内抑制CSC球体形成，成功抑制CSC自我更新的一个指标。

从而一方面本发明提供了抑制癌干细胞的方法，其中向细胞施用有效量的本发明化合物。已知具有CSC的癌症是此类治疗的良好候选者，并且包括但不限于：多种类型的乳腺癌、头颈部癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、结直肠癌、前列腺癌、肝癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤、脑瘤、肉瘤、成神经管细胞瘤和白血病。

此外，由于已经证明CSC根本性地负责肿瘤发生、癌症转移和癌症复发，所以可实施涉及抑制CSC的任何本发明方法以治疗转移性的、化疗或放疗顽固性的、或经初始治疗后在受试者体内复发的癌症。下文实施例6专门检验了本发明化合物的体内抗转移功效，且数据显示，原发性肿瘤病灶和自发性肝转移的数目显著减少。

在下文实施例4中，显示本发明的化合物不仅在广谱癌细胞中造成凋亡，而且在其细胞毒性方面呈现出选择性，这对于开发低毒性治疗剂至关重要。本文中，选择性细胞毒性是指化合物有些时候在某些条件下杀死癌细胞而基本上不伤害正常细胞的能力。正常细胞通常是指健康的非肿瘤发生细胞。在候选药物中导致选择性细胞毒性的条件是难以预测的，因为这需要有关细胞毒性潜在机制的知识。例如，降低靶向有丝分裂期间微管形成的抗癌药物的毒性，与阻断细胞代谢过程的药物相比，要研究完全不同的因素。造成选择性毒性的适宜条件需要平衡需要药物有足够毒性以有效杀死癌细胞而同时正常细胞又足够耐受的需求。例如，如果应用较低的浓度，则往往意味着需要延长输注以杀死癌细胞。

根据本发明实施例所生成的数据，包括实施例4所示的那些，看来如果患病细胞不持续接触临界浓度的化合物超过一定的持续时间，则本发明的化合物能够实现选择性细胞毒性。在旨在选择性杀死受试者体内癌细胞的方法中，向受试者施用具有本发明化合物的药物组合物，使每剂量后受试者血浆中的化合物浓度维持在临界浓度之上不超过24小时。该方法可用来治疗所有癌症，包括任何本文所述的癌症组别，以及用来治疗Stat3相关紊乱(其例示性清单已在上文提供，故而此处不再重复)。可选地，持续时间可进一步限于每剂量后12、16和20小时。各化合物的临界浓度可以变化不等。在本发明的多个实施方案中，临界浓度约100μM、约50μM、约30μM、或约20μM。

在该方法的一个实施方案中，所治疗的癌症选自下组：肝癌、头颈部癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、肉瘤、多发性骨髓瘤、转移性乳腺癌、转移性前列腺癌、白血病、淋巴瘤、食道癌、脑瘤、神经胶质瘤、膀胱癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、胆管癌、骨癌、眼癌(成视网膜细胞瘤)、胆囊癌、垂体癌、直肠癌、涎腺癌和鼻咽癌。

一方面本发明提供了治疗受试者癌症的方法，其中向受试者施用治疗有效量的、包含本发明化合物的药物组合物。癌症可以是转移性的。受试者可以是哺乳动物，例如人类。

对于任何本文所述的治疗受试者的方法，本发明提供有效剂量范围、剂量频率、和化合物的血浆浓度。在多个实施方案中，药物组合物以如下剂量施用：(a)约1mg/m²至约5,000mg/m²(I.V.)或约1mg/m²至约50,000mg/m²(PO)；(b)约2mg/m²至约3,000mg/m²(I.V.)或约10mg/m²至约50,000mg/m²(PO)。在多个实施方案中，本发明的化合物可每隔一天(Q2D)、每天(QD)或每天两次(BID)施用。在一个实施方案中，药物组合物口服施用，且不超过每天四次(QID)。

在一个特征中，向受试者施用药物组合物，从而受试者血浆中的化合物浓度在每剂量后维持在临界浓度之上不超过24小时(或12、16和20小时)。根据本发明的可选实施方案，化合物血浆浓度在每剂量后的某个时间点(例如12、16、20或24小时)不超过临界浓度，作为避免非选择性毒性的策略。在本发明的多个实施方案中，临界浓度为约100μM、约50μM、约30μM、或约20μM。组合物在某些情况下是分离的、纯化的或合成的。

另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的化合物和可药用的赋形剂、载体或稀释剂。在一个特征中，组合物适合于口服、经鼻、局部、直肠、阴道或胃肠外施用，或静脉内、皮下或肌肉内注射。

本发明的制剂包括适于口服、经鼻、局部(包括口腔和舌下)、直肠、阴道和/或肠胃外施用的那些。制剂可以便利地以单位剂型的形式提供，并且可以通过任何药学领域公知的方法制备。可与载体材料混合以生产单个剂型的活性成分的量将根据待治疗的哺乳动物和具体的施用方式而变。可与载体材料混合以生产单个剂型的活性成分的量一般是产生治疗效果的化合物量。一般而言，在100％里面，该量的范围是例如约1％至约99％活性成分、约5％至约70％、约10％至约30％。

适于口服施用的本发明的治疗性组合物或制剂可以是胶囊剂、扁胶剂、丸剂、片剂、锭剂(应用香基，通常是蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶)、粉剂、颗粒剂的形式，或作为处于水性或非水性液体中的溶液剂或混悬剂，或作为水包油型或油包水型液体乳剂，或作为酏剂或糖浆剂，或作为锭剂(pastilles)(应用惰性基，例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯树胶)，和/或作为漱口剂等，分别含有预定量的本发明化合物作为活性成分。本发明的化合物还可以作为大丸剂、舐剂(electuary)或糊剂施用。

在口服施用的本发明固体剂型(胶囊剂、片剂、丸剂、糖锭剂、粉剂、颗粒剂等)中，本发明的化合物与一种或多种可药用的载体(例如柠檬酸钠或磷酸氢钙)和/或如下任一混合：填充剂或充填剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯树胶；保湿剂，例如甘油；崩解剂，例如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸盐、碳酸钠、和羧基乙酸淀粉钠；溶液迟延剂，例如石蜡；吸收加速剂，例如季铵化合物；润湿剂，例如鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯、和聚环氧乙烷-聚环氧丙烷共聚物；吸收剂，例如高岭土和膨润土；润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、及其混合物；以及着色剂。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可以包含缓冲剂。还可以采用相似类型的固体组合物作为填料，使用赋形剂诸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等，用于软及硬明胶胶囊。

口服施用本发明化合物的液体剂型包括可药用的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除了活性成分，液体剂型还可以含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(特别是棉籽油、落花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢化呋喃醇、聚乙二醇和失水山梨糖的脂肪酸酯、及其混合物。另外，环糊精，例如羟基丙基-β-环糊精，可以用来增溶化合物。

除了惰性稀释剂，口服组合物还可包括辅剂例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂、着色剂、香料和防腐剂。除了一种或多种本发明化合物之外，混悬剂可以含有悬浮剂，例如乙氧基化的异硬脂酸醇、聚氧乙烯山梨醇和失水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂-琼脂和黄芪胶、及其混合物。

用于直肠或阴道施用的本发明药物组合物的制剂可以作为栓剂提供，其可以通过将一种或多种本发明的化合物与一种或多种适宜的无刺激性赋形剂或载体(包括例如可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸盐)混合来制备，且室温时其为固体但体温时为液体，因此会在直肠或阴道中融化并释放本发明的药物活性剂。适于阴道施用的本发明制剂还包括含有本领域已知合适的载体的阴道栓剂、棉塞、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂、或喷雾制剂。

局部或经皮施用本发明组合物的剂型包括粉剂、喷雾剂、膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂和吸入剂。活性化合物可以在无菌条件下与可药用的载体、以及与任何可能需要的防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。

除本发明的化合物之外，膏剂、糊剂、霜剂和凝胶剂还可以含有赋形剂，例如动物及植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅油、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌、或其混合物。

除本发明的化合物之外，粉剂和喷雾剂可含有赋形剂，例如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉，或这些物质的混合物。喷雾剂可额外含有传统的推进剂，例如氯氟烃和挥发性未取代的烃，例如丁烷和丙烷。

眼科制剂，眼膏、粉、溶液等，也考虑落在本发明的范围内。

适于胃肠外施用的本发明药物组合物包含一种或多种本发明的化合物以及一种或多种可药用的无菌等渗水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液、或可以在临用前重构为无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与目的受体的血液等渗的溶质，或悬浮剂或增稠剂。

在一些情况下，为了延长根据本发明的组合物的效应，期望放缓机体自皮下或肌内注射对组合物的吸收。这可以通过应用水溶性差的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。这样，药物的吸收速率取决于其溶解速率，这又可以取决于晶体大小或结晶形式。可选地，胃肠外施用的组合物的延迟吸收可以通过将化合物溶解或悬浮在油载体中实现。用于贮存注射剂的一个策略包括应用聚环氧乙烷-聚环氧丙烷共聚物，其中该载体在室温时为流体，而在体温时固化。

本发明的药物化合物可以单独施用，或组合其他药剂，或组合如本文所述的其他抗癌疗法，以及组合可药用的赋形剂、载体或稀释剂。

在一实施方案中，可药用的赋形剂、载体或稀释剂包括用于静脉内递送的脂质。脂质可为：磷脂、合成卵磷脂、天然卵磷脂、鞘磷脂、神经酰胺、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、胆固醇、硫酸胆固醇、以及半抗原和PEG缀合的脂质。脂质可以是纳米乳液、胶束、乳液、悬浮液、纳米悬浮液、类脂囊泡(noisome)、或脂质体的形式。在一实施方案中，可药用的赋形剂、载体或稀释剂为胶束乳液、悬浮液或纳米颗粒悬浮液的形式，并且其进一步包含静脉内可接受的、用于静脉内递送的蛋白质，例如人白蛋白或其衍生物。

在一实施方案中，可药用的赋形剂、载体或稀释剂包含用于口服递送的蜡质材料。蜡质材料可以是单-、双-、或三-酸甘油酯，PEG的单-、双-脂肪酸酯，PEG缀合的维生素E(维生素E TPG)，和/或Gelucire。Gelucire可选自Gelucire 44/14、Gelucire 43/01、Gelucire 50/02、Gelucire 50/13、Gelucire 37/02、Gelucire 33/01、Gelucire 46/07、和Gelucire 35/10。在一实施方案中，可药用的赋形剂、载体或稀释剂选自capryol、transcutol hp、labrafil M、labrasol、三醋精、pharmasolv、乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、吐温20和吐温80。在一实施方案中，可药用的赋形剂(例如Gelucire 44/14)与表面活性剂(其可为吐温80或吐温20)混合。这些实施方案的药物组合物可进一步配制用于口服施用。

本发明的化合物可利用可商购的起始材料和有机化学领域技术人员公知的方法来合成。在实施例8-10中，本发明提供了一些本发明化合物的生产方法。

根据本发明的一个或多个实施方案，小分子Stat3抑制剂是指任何对Stat3显示出抑制活性的小分子量药物。与较大分子量的药物(如蛋白质、肽和糖)相比，小分子能够更容易地穿透细胞膜和血脑屏障。这些分子倾向于使工艺开发和生产成本更低。

根据本发明的一个或多个实施方案，RNAi疗法是在疾病治疗中直接应用RNA干涉(RNAi)，使产生不良蛋白质的基因沉默，从而抑制疾病。RNAi是活细胞中天然存在的抑制某些基因活性的过程。其是普遍保守的真核功能，由双链RNA借助于短RNA双链体中间体如小干扰RNA(siRNA)在细胞中触发。通过一系列的加工步骤，siRNA两条链中的一条与蛋白质复合形成RISC(RNA诱导的沉默复合物)。RISC通过Watson-Crick碱基配对识别互补的RNA序列，然后切割之。RNAi还包括shRNA、miRNA等。

根据本发明的一个或多个实施方案，反义疗法是用于遗传紊乱或感染的一种治疗形式。当已知特定基因的遗传序列为特定疾病的病因时，可以合成与该基因产生的信使RNA(mRNA)结合并使之失活的核酸链(DNA、RNA或化学类似物)，从而“关闭”该基因。这是因为mRNA为进行翻译必需是单链。这种合成的核酸称为“反义”寡核苷酸，因为其碱基序列互补于基因的信使RNA(mRNA)，后者称为“有义”序列(这样，有义mRNA区段“5’-AAGGUC-3’”可以被反义mRNA区段“3’-UUCCAG-5’”封闭)。

根据本发明的一个或多个实施方案，肽模拟物是设计用来模拟肽的小蛋白质样链。它们一般源于为改变分子特性而对既有肽进行的修饰。例如，它们可以源于为改变分子的稳定性或生物活性而进行的修饰。这可用于自既有肽开发药物样化合物。这些修饰包括对肽进行非天然的改变(例如改变骨架，和掺入非天然氨基酸)。

根据本发明的一个或多个实施方案，G四联体寡聚脱氧核苷酸抑制剂是催化性DNA分子(DNAzymes)，设计用来抑制蛋白质，而不依赖于其在细胞中的RNA切割活性。

材料和方法

生物学测定

本发明的化合物可根据上文所述的方案进行检查。表2显示了在该方案中描述的化合物列表。

表2

化合物名称                                                              化合物代码

2-(1-羟乙基)-萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮                                 301

2-乙酰基-7-氯-萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮                                416

2-乙酰基-7-氟-萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮                                418

2-乙酰基萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮                                      401

2-乙基-萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮                                       101

磷酸单-[1-(4，9-二氧代-3a，4，9，9a-四氢-萘并[2，3-b]呋喃-2-基)-乙烯

基]酯                                                                   4011

磷酸1-(4，9-二氧代-3a，4，9，9a-四氢-萘并[2，3-b]呋喃-2-基)-乙烯基酯

二甲酯                                                                  4012

细胞培养：HeLa、DU145、H1299、DLD1、SW480、A549、MCF7、LN18、HCT116、HepG2、Paca2、Panc1、LNcap、FaDu、HT29和PC3细胞(ATCC，Manassas，VA)在补充有10％胎牛血清(FBS)(Gemini Bio-Products，West Sacramento，CA)和5％青霉素/链霉素/两性霉素B(Invitrogen)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(Invitrogen，Carlsbad，CA)中维持。

Hoechst侧群：为鉴定和分离侧群(SP)和非SP级分，用胰蛋白酶和EDTA自培养皿中取出SW480细胞，离心沉淀，以磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤，并重悬于37℃含2％FBS和1mM HEPES的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中。然后用Hoechst 33342(Invitrogen)以5μg/mL的浓度标记细胞。标记的细胞单独或与50μM戊脉安(verapamil，Sigma-Aldrich，St.Louis)一起于37℃孵育120分钟。染色后，使细胞悬浮于含2％FBS和1mM HEPES的Hanks平衡盐溶液(HBSS；Invitrogen)中，流经40μm滤网，并维持在4℃直至进行流式细胞术分析。Hoechst染料在350nm激发，并利用450DF10(450/20nm带通滤光片)和675LP(675nm长波通截止滤光片)光学滤光片在两个波长测量其荧光。正向和侧向散射光设门并不严格，仅排除碎片[15]。

以表面标志进行CSC分离：通过主要基于表面标志(例如CD44或CD133)的差异表达来分选肿瘤细胞，已经产生了大多数迄今描述的高致瘤性CSC。CD133基于稍加修改的Ricci-Vitiani等人的方法[20]分离。CD133⁺细胞通过荧光激活细胞分选(FACS)或基于磁纳米颗粒的分离法进行分离。简言之，对于基于FACS的细胞分选，以CD133/1(AC133)-PE标记10⁷细胞/mL；或对于基于磁场的分离，利用生物素选择试剂盒(MiltenyiBiotec)按照生产商的建议以CD133/1(AC133)-生物素(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)标记10⁷细胞/mL。非特异性标记用提供的FcR阻断试剂来阻断，而抗体孵育(1∶11)在冰上于具有2％FBS和1mM EDTA的PBS中进行15分钟。对于Easy分离进行5次洗涤，而在FACS分选前细胞在400×g沉淀5分钟，并重悬至2×10⁷/mL。

CD44^high细胞根据稍加修改的Ponti等人所述的方法[85]通过FACS分离。简言之，经胰蛋白酶消化和37℃生长培养基中30分钟的细胞恢复之后，细胞在400×g沉淀，并于具有2％FBS和1mM EDTA的PBS中重悬至1×10⁶细胞/mL。细胞随之在冰上与1∶100稀释的CD44-FITC(BD Biosicences，SanDiego，CA)孵育15分钟。或者，利用CD24-PE(BD Bioscences，San Diego，CA)(1∶100)进行负选择。洗涤3次之后，细胞重悬至2×10⁶/mL，并流经40μm滤网，之后进行分选。

球体测定试验：一种测量细胞群自我更新能力的可靠方法是在不存在血清或贴壁的情况下被培养为球体的能力。CD44^high FaDu或Hoechst侧群癌干细胞在超低附着板中于癌干细胞培养基(DMEM/F12，B27Neurobasal增补物，20ng/ml EGF，10ng/ml FGF，4μg/ml胰岛素和0.4％BSA)中培养以允许球体形成。一般，10-14天培养后通过显微镜检评估球体形成，并记录具有＞50个细胞的球体。

萤光素酶报告试验：HeLa细胞用Stat3-萤光素酶(Stat3-Luc)报告载体(Panomics，Fremont，CA)和海肾萤光素酶(Promega，Madison，WI)通过Lipofectamine 2000如生产商(Invitrogen)所述进行共转染。转染之后，细胞在含0.5％FBS的培养基中维持24小时。细胞随之用所示的化合物处理30分钟，之后向培养基中添加25ng/ml制瘤素M(OSM)(R&D Systems，Minneapolis，MN)。继OSM添加后6小时，收获细胞，并利用Dual-Glo萤光素酶测定系统如生产商(Promega)所述测量萤火虫和海肾萤光素酶的水平。

凋亡分析：用或未用化合物处理的细胞在处理后5小时收获，进行膜联蛋白-V染色。收集的细胞以PBS洗涤，重悬于含膜联蛋白-V-FITC的缓冲液中，并按照生产商(Roche)的说明染色。膜联蛋白-V阳性细胞通过流式细胞术确定。

STAT3DNA结合测定试验：如生产商(Li-Cor Biosciences，Lincoln，NE)所述进行电泳迁移率变动分析(EMSA)。简言之，利用NucBuster蛋白质提取试剂盒如生产商(EMD Biosciences，San Diego，CA)所述由HeLa细胞制备核提取物。5μg核提取物与所示剂量的所示化合物一起预孵育30分钟，之后再与IR700标记的共有Stat3寡核苷酸一起孵育15分钟。样品随之在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并应用Odyssey红外成像系统(Li-Cor Biosciences)直接扫描。对于酶联免疫吸附试验(ELISA)，5μg核提取物与所示浓度的所示化合物预孵育30分钟，之后添加生物素化的寡聚体(5’-生物素-GATCCTTCTGGGAATTCCTAGATC-3’SEQ ID NO.1)。Stat3-DNA复合物随之被捕获到链亲和素包被的96孔板(Pierce，Rockford，IL)上。结合的复合物随之与Stat3多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)、接着是抗兔HRP缀合的二抗(GE Healthcare，Pittsburgh，PA)进行孵育。结合的抗体随之通过添加TMB底物(Pierce)并在450nm测量吸光值而观察。

细胞生存力确定：对于3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓(MTT)(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)分析，细胞以10,000细胞/孔接种在96孔板中。种板后24小时，以所示剂量向细胞中添加化合物。化合物添加后22小时，向各孔添加MTT(0.5mg/ml终浓度)，并使板在37℃再孵育2小时。然后吸出培养基，并使甲臜产物溶解在100μl异丙醇中。各孔的吸光值利用微板读数器在570nm测量。

免疫荧光：用所示化合物处理所示时间的细胞在4％甲醛或冷甲醇中固定，分别用于检测膜联蛋白V、裂解的胱天蛋白酶3(cleaved caspase 3)或stat3。盖片风干，在PBS中室温重新水合10分钟。样品之后在封闭缓冲液(PBS，5％FBS)中在潮湿箱中室温孵育10分钟。细胞与一抗在4℃孵育过夜。洗涤后，细胞与1∶500稀释的FITC缀合的抗兔抗体室温孵育1小时。用配备有落射荧光和SPOT镶嵌CCD相机的Nikon TE200显微镜捕获图像。多克隆抗裂解的胱天蛋白酶3抗体(1∶100)获自Cell Signaling Technology，Danvers，MA.公司。膜联蛋白-V-FITC获自德国Penzberg的罗氏(Roche)公司。多克隆抗Stat3抗体获自Santa Cruz公司。

通过技术敲低基因：(治疗通路鉴定和验证)技术(BostonBiomedicalInc.，Norwood，MA，USA)提供了能够用来首先转染细菌、进而细菌可以被哺乳动物受试者摄取的质粒。在细菌裂解后，由质粒编码并由细菌加工的dsRNA被释放到哺乳动物细胞的细胞质中，实现所靶向基因的敲低。技术在共同拥有的于2008年6月30日递交的PCT专利申请PCT/US08/68866中描述，其全部内容并入本文作为参考。具体而言，编码针对Stat3的有效siRNA序列的质粒利用如下引物通过PCR克隆购自Origene Technologies(Rockville，MD，USA)的Stat3质粒来构建：

TPIV-Stat3(300bp插入物)

引物：

Stat3TPIV For 5’-GGATCTAGAATCAGCTACAGCAGC(SEQ ID NO.2)

Stat3TPIV Rev 5’-TCCTCTAGAGGGCAATCTCCATTG(SEQ ID NO.3)

对照质粒应用购自Promega(Madison，WI，USA)的pGL2质粒来构建。TPIV-GL2(300bp插入物)

引物：

GL2TPIV For 5’-CCCTCTAGATGGTTCCTGGAAC(SEQ ID NO.4)

GL2TPIV Rev 5’-GCTCTAGAAACCCCTTTTTGG(SEQ ID NO.5)

化学感受态大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)pLYSe细菌(50～100μl)用对照或100ng靶向Stat3的质粒按照生产商(Stratagene)的说明进行转化。然后将单菌落接种到含100μg/ml氨苄青霉素的BHI培养基中，并于37℃生长过夜。第二天，将5ml各过夜培养物1∶40稀释至含100μg/ml氨苄青霉素的新鲜BHI培养基中，并再生长2-4小时(直至OD₆₀₀＝0.5)。各培养物随之用IPTG(1mM终浓度)处理2-4小时，以诱导长双链RNA转录，其会被细菌加工为混合siRNA。在IPTG诱导之后，通过测量OD₆₀₀值来计算各培养物中的细菌总数(8×10⁸细菌/ml培养物具有OD₆₀₀＝1)。然后根据细胞汇合度和在适当反应体积中所需的感染复数(MOI；尝试20∶1至2000∶1的细菌比细胞范围)，计算用于细胞处理的细菌数目。根据经验，应选择反应体积以导致对于1000∶1MOI为3×10⁸/ml。所需体积的细菌培养物随之在2500g 4℃离心10分钟，沉淀用无血清培养基(用于细菌感染细胞时，加上100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG)洗涤一次，并以细菌感染(bactofection)所需的密度重悬于相同的培养基中。

同时分离癌细胞或癌干细胞，在细菌感染前30分钟，将细胞培养基替换为2ml含100μg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG的新鲜无血清培养基。上文制备的细菌随之以期望的MOI添加到细胞中，37℃感染2小时。

感染期过后，细胞用无血清细胞培养基洗涤3次。细胞随之与2ml含有100μg/ml氨苄青霉素和150μg/ml庆大霉素的新鲜完全细胞培养基孵育2小时，以杀死任何残留的胞外细菌。在氨苄青霉素和庆大霉素处理后，细胞与3ml含10μg/ml氧氟沙星的新鲜完全RPMI 1640培养基孵育，以杀死任何胞内细菌。随之收获细胞或在各时间点进行分析，以评估靶基因沉默的程度和产生的表型。

活体评价(in life evaluations)：还对每只动物的健康状态进行了每日检查。每三天检查体重。按照机构的动物管理方法每日供应食物和水。引起＞20％致死率和/或＞20％净体重损失的处理视为有毒性。结果表达为平均肿瘤体积(mm³)±SE。P值＜0.05视为统计学相关。

动物管理：4-5周龄的雄性或雌性无胸腺裸鼠(Charles RiverLaboratories，Wilmington，MA.)在研究开始前适应动物畜舍设施至少一周。所利用的所有实验方法与美国生理学会(American Physiology Society)所给出的指南以及实验动物护理和使用指南(Guide for the Care and Useof Laboratory Animals)相符，并且也得到了波士顿生物医学公司(BostonBiomedical Inc.)研究所动物护理和使用委员会(Institutional Animal Careand Use Committee)的批准。动物4只一组关进木屑铺底的笼中，置于具有控制的温度(68°F-72°F)、光照(12小时光-暗周期)和湿度(45-55％)的房间。实验期间动物自由饮水摄食。

脾内裸鼠模型系统(ISMS模型)：雌性裸鼠麻醉并置于无菌条件，在左侧腹切割以露出脾脏。利用27号针在脾被膜下注射0.1ml PBS中的100万人结肠癌HT29细胞。将脾重置于腹膜腔内，并闭合切口。移植后第二天开始处理直至检查当天。处理策略为每周5天一天一次(5qd/wk)的腹膜内注射。小鼠在垂死时或注射后30天处死。取出脾和肝进行检查，并记录肿瘤病变数。

实施例1

鉴定Stat3作为抗癌干细胞靶标

在CSC中Stat3的敲低可以诱导凋亡。为确定癌干细胞是否表达Stat3，以及Stat3是否组成型激活，我们进行了免疫荧光显微镜检，这不仅允许分析罕见细胞群，而且还提供了有关蛋白质定位的额外信息，以及能够将染色与表型(即凋亡)相关联。在通过FACS自SW480结肠癌细胞分离的NSP和SP细胞中对p-Stat3和Stat3进行了免疫荧光检测后，我们确定了Stat3确实存在于SP细胞中，且在细胞核中适度富集(图3A)。另外，我们还在SP细胞中观察到比NSP细胞增加的p-Stat3染色，提示SP细胞的存活可能更大比重地依赖于Stat3。

还评价了自FaDu人头颈部癌细胞和LN18人成胶质细胞瘤细胞分离的CD133⁺细胞中的Stat3状态。如图3B所示，Stat3在这些细胞中也具有组成型活性。综上所述，这些数据提示Stat3是对于癌干细胞特别重要的靶标。

我们接下来利用检验了在CSC中Stat3敲低的效应。免疫荧光分析揭示，在新鲜分离的CSC(SP)上感染24小时之内(图4A)能够实现Stat3的显著耗竭，并发现用靶向Stat3的质粒处理的大多数细胞在感染24小时之内经历凋亡，而对照质粒并不诱导高于对照未感染细胞的凋亡水平(图4B)。这些数据证明癌干细胞依赖于Stat3用于存活。

在CSC中敲低Stat3抑制CSC球体形成。通过FACS分离CD44^high/CD24^low FaDu或Hoeschst侧群癌干细胞，并在超低附着板中于癌干细胞培养基(DMEM/F12，B27Neurobasal增补物，20ng/mL EGF，10ng/mL FGF，4μg/mL胰岛素和0.4％BSA)中培养以允许球体形成。收集初级球体(primary spheres)，用胰蛋白酶解聚，并在处理之前分配至96孔超低附着板中。以1000的MOI施加细菌两小时，之后添加抗生素混合物(青-链霉素混合物(penstrep)、庆大霉素、氧氟沙星)。10-14天培养后评估球体形成。在添加台盼蓝鉴定死细胞之前(图5，左上图)或之后(图5，左下图)获取代表性的球体图像。相对球体形成示于图5的右图。数据清楚地表明，在癌干细胞中Stat3敲低抑制球体形成，证明Stat3是癌干细胞的关键自我更新因子。

实施例2

鉴定抑制Stat3通路活性的化合物

Stat3转录活性的抑制。利用Stat3-萤光素酶(Stat3-luc)报告分子构建体检验了化合物在细胞中抑制Stat3转录激活活性的能力。转染了Stat3-luc的细胞在减少血清的培养基中培养，之后再添加所示的化合物孵育30分钟。细胞随之用25ng/ml制瘤素M(OSM)刺激6小时，之后检测Stat3-luc报告分子活性。细胞与化合物401孵育抑制了OSM刺激的Stat3报告分子活性(图6，左图)。纳入AG490(一种已知的Jak-Stat通路抑制剂)作为Stat3抑制的阳性对照。依托泊苷纳入作为遗传毒性活性对照，其显示出很小或无Stat3抑制作用。化合物1001为萘而非作为本发明化合物的萘醌，其即便是在高得多的浓度也不抑制OSM刺激的Stat3报告分子活性(图6，右图)。

在Stat3萤光素酶报告分子测定中检验了其他化合物，且结果总结于表3。

表3

  化合物# Stat3-Luc测定中的IC₅₀  401  ～0.25μM  416  ～0.75μM  418  ～0.75μM  301  ～2μM

Stat3DNA结合活性的抑制。应用来自HeLa细胞的核提取物(如通过酪氨酸705残基磷酸化所检测的那样，其含有组成型激活的Stat3)进行Stat3EMSA以监测Stat3DNA结合活性。核提取物与所示化合物孵育，之后再与IR700标记的Stat3共有寡核苷酸孵育。Stat3与寡核苷酸的结合通过凝胶电泳监测，并利用LiCor Odyssey红外扫描仪检测。鉴定到Stat3阻滞的条带，并通过抗Stat3抗体的超级迁移(图7A，左图)和Stat3肽的剂量依赖性抑制进行了确认(图7A，中图)。在孵育标记的探针和化合物401之后观察到Stat3DNA结合的剂量依赖性抑制(图7A，右图)。

在EMSA测定中检验了其他化合物。如图7B所示，化合物401、416和418能够抑制Stat3的DNA结合活性。

异种移植肿瘤组织中Stat3下游效应子的抑制。从在收获前4小时用化合物401或载体对照处理过的异种移植Paca2肿瘤中制备提取物。样品通过western印迹和EMSA分析，以评价Stat3下游效应子表达水平和Stat3DNA结合活性。化合物401处理的样品(T)与对照(V)相比显示出Stat3DNA结合活性下降(图8A)。另外，化合物401处理导致Stat3下游效应子细胞周期蛋白D1和生存素的表达水平下降(图8B)。

实施例3

鉴定靶向癌干细胞的化合物

鉴定使癌干细胞凋亡的化合物。由于已经证明癌干细胞活跃地外排Hoechst，故用Hoechst染色SW480细胞，分选侧群(如图9A所示，左图围起来的区域)以富集癌干细胞。为确认此侧群富集癌干细胞，对照组的SW480细胞首先用戊脉安(verapamil，ABC转运蛋白抑制剂)处理，之后用Hoechst染色。如图9A右图所示，戊脉安处理导致侧群丧失。

在MTT测定中评估了化合物401对Hoechst侧群的IC₅₀，并与对非侧群的IC₅₀进行了比较。结果显示，侧群对化合物401与非侧群一样敏感(图9B，右图)。然而，侧群对多柔比星比非侧群耐药性大得多(图9B，左图)，这与之前的公开一致[7，86]。这些数据提示化合物401杀死癌干细胞。

Hoechst侧群细胞用化合物401处理，并通过膜联蛋白V(凋亡的早期标志)染色来评估细胞死亡模式。结果显示，垂死细胞为膜联蛋白V阳性(图10A)，证明化合物401使癌干细胞凋亡。

可选地，我们进行了CD133(常见的癌干细胞表面标志之一)抗体磁珠沉降以富集癌干细胞。CD133+细胞随之用化合物401处理，接着用抗裂解的胱天蛋白酶3(凋亡标志)的抗体染色。如图10B所示，许多CD133⁺细胞在化合物401处理后变成裂解型胱天蛋白酶3阳性的，证实化合物401使癌干细胞凋亡。

另外，我们检验了若干其他化合物抗癌干细胞的活性。简言之，新鲜分离的CSC(SW480Hoechst SP细胞或CD44^high FaDu细胞)与一定剂量范围(30-0.117μM)的化合物接触48小时，之后通过MTT测定研究细胞生存力。通过对存活细胞百分数进行作图来估算IC₅₀。如表4和表5所示，本发明的化合物能够靶向癌干细胞。

表4

       IC₅₀(μM)  化合物   NSP    SP  401     0.33    0.34  418     0.33    0.34  4011    0.34    0.38  4012    0.81    0.57

表5

         IC₅₀(μM)  化合物  CD44^low  CD44^high  4011    0.42     0.27  4012    0.76     1.05

鉴定在体外抑制CSC球体形成的化合物。癌干细胞的标志之一是其自我更新的能力。一种测量细胞群自我更新能力的可靠方法是其在不存在血清或附着的情况下培养为球体的能力。为比较化合物401与其他靶向及化疗剂的该能力，FACS分离的CD44^high CSC培养为球体72小时，之后用一组治疗剂进行攻击。所检验的药剂中，只有化合物401有效防止球体增殖(图11)。注意，尽管施加的多柔比星和多烯紫杉醇的量大约十倍于其在类似测定中导致细胞死亡的IC₅₀浓度，但球体还是具有耐药性。添加的特罗凯(Tarceva)、索坦(Sutent)和格列卫(Gleevec)大约三倍于其报告的治疗浓度。这证明虽然癌干细胞对传统化疗剂和靶向剂具有耐药性，但化合物401高度有效地抑制其生长。

鉴定在体内抑制CSC球体形成的化合物。六周龄雌性无胸腺nu/nu小鼠获自Charles River Labs(Wilmington，MA)。小鼠在腰窝处皮下注射处于0.2mL无血清DMEM中的6×10⁶FaDu或Paca2癌细胞。在异种移植物大小达到～200mm³后，携带Paca2异种移植肿瘤的动物通过腹膜内施用载体、吉西他滨(120mg/kg，一周两次)或化合物401(20mg/kg)一周，而携带FaDu异种移植肿瘤的动物通过腹膜内每日施用载体、卡铂(30mg/kg)或化合物401(20mg/kg)两周，之后处死。然后分别针对Paca2和FaDu细胞，收集肿瘤。在动物处死并无菌取出肿瘤后制备单细胞悬液。简言之，用无菌解剖刀将肿瘤切成0.1mm³的碎块，之后在1mg/mL胶原酶/HBSS中持续震荡消化15-30分钟。在流经40μm滤网后，将细胞悬液层放在1mL Histopaque上，并在1440×g离心30分钟后收集界面层，而除去RBC、死细胞和细胞碎片。然后计数活细胞，并用来测量其形成球体的能力。细胞以100细胞/孔的密度分配到超低附着96孔板的癌干细胞培养基中(DMEM/F12，B27Neurobasal增补物，20ng/mL EGF，10ng/mL FGF，4μg/mL胰岛素和0.4％BSA)。每三天添加新鲜培养基，并在10-14天培养后测定球体形成。记录具有＞50个细胞的球体。实验结束时，添加台盼蓝以鉴定死细胞。如图12所示，如增加的球体形成所证明的，标准化疗吉西他滨(上图)和卡铂(下图)富集了癌干细胞。相反地，如减少的球体形成所证明的那样，化合物401处理减少了癌干细胞。

实施例4

鉴定选择性杀死广谱癌细胞的化合物

鉴定在体外使广谱癌细胞凋亡的化合物。对铺板在96孔板中并用所示化合物处理的细胞在化合物处理后24小时进行MTT分析，以确定细胞生存力。对多种细胞系计算的IC₅₀值总结于下表6。数据证明，这些化合物对广谱癌细胞具有有力的活性。

表6

另外，DU145细胞首先用DMSO或所示浓度的化合物401处理，然后用膜联蛋白V染色，接着在处理后5小时进行流式细胞术分析。结果显示401处理导致膜联蛋白V染色的剂量依赖性增加(图13)，证明化合物401使这些癌细胞凋亡。

化合物选择性的实例。在导致几乎所有癌细胞死亡的测定条件下，正常细胞保持基本上存活。外周血单核细胞(PBMC)相对地抵抗化合物401，在与化合物401孵育24小时后具有14μM的MTT IC₅₀。此IC₅₀比在多种癌细胞系中所见的IC₅₀高6至116倍，表明与癌细胞相比合理的治疗窗口。

与PMBC方式类似，CD34⁺骨髓造血干细胞在用化合物401处理时不受伤害。如表7所示，CD34⁺骨髓单核细胞与化合物401一起孵育6小时，结果对于骨髓红系(erythroid lineage)和粒系(myeloid lineage)两者的IC₅₀均高于30μM，而DU145前列腺癌细胞和HT29结肠癌细胞在相似条件下具有的IC₅₀低于0.5μM。这些数据提示，根据该体外数据，化合物401具有宽(大于50倍)的治疗窗口。

表7.化合物401对CD34⁺骨髓干细胞相对无毒性

BM＝骨髓

集落形成测定中比较化合物401对CD34⁺骨髓单核细胞、DU145细胞和FaDu细胞的IC₅₀。

实施例5

体内抗肿瘤功效

胰腺癌异种移植模型。Paca-2细胞皮下接种雌性无胸腺裸鼠(4×10⁶细胞/小鼠)。当肿瘤达到大约450mm³时，将动物随机分成2组，每组5只小鼠。小鼠每天用20mg/kg的化合物401或载体对照进行腹膜内治疗。化合物401以5mg/ml配制在1.5％脂质和H₂O中。动物接受总计14个剂量，进行治疗后观察。在整个治疗过程中测量肿瘤，且在治疗后再监测22天。如图14左图所示，化合物401有力地抑制了肿瘤生长。肿瘤生长抑制在第60天计算为64％，并具有统计学显著性(p＜0.001)。更重要的是，在治疗后22天的时间阶段中肿瘤体积保持静态。

在相似的实验中，panc-1人胰腺癌细胞皮下接种雌性无胸腺裸鼠(2×10⁶细胞/小鼠)，并使之形成可触知的肿瘤。当肿瘤达到大约60mm³时，将动物随机分成2组，每组5只小鼠。小鼠用吉西他滨以标准方案(120mg/kg，每三天一次)或用载体对照进行腹膜内(ip)治疗，总计6个剂量的吉西他滨或载体对照。在整个治疗过程中测量肿瘤，且治疗后再监测19天。如图14右图所示，用吉西他滨作为单一疗法治疗抑制了肿瘤生长，第41天肿瘤生长抑制47.5％。治疗终止后，吉西他滨治疗组的肿瘤很快长得超过了对照组。

在化合物401治疗期间或治疗后阶段在异种移植的Paca-2人胰腺癌模型中未观察到肿瘤反弹，这与其癌干细胞靶向作用机制相符。相反，用目前标准的化疗吉西他滨治疗的人胰腺癌异种移植肿瘤最初产生反应，但在继续治疗期间反弹，或者在给药终止后长得超过了对照肿瘤。消除肿瘤反弹使得化合物401有别于标准化疗，这从而提供了显著和根本性地改善癌症治疗的可能性。

头颈部癌异种移植模型。FaDu人头颈部癌细胞皮下接种雌性无胸腺裸鼠(6×10⁶细胞/小鼠)，并使之形成可触知的肿瘤。当肿瘤达到大约100mm³时，动物每天用20mg/kg的化合物401或载体对照进行腹膜内(ip)治疗(连续5天，跟着是2天的施用休息日)。化合物401以5mg/ml配制在2％脂质、0.1％胆固醇和H₂O中。动物接受总计15个剂量的化合物401或载体对照。在整个治疗过程中测量肿瘤。如图15所示，在这种高度攻击性的头颈部癌异种移植模型中，用化合物401作为单一疗法腹膜内施用的动物有力地抑制了肿瘤生长。化合物401的肿瘤生长抑制经计算为75％，p值为0.007。腹膜内施用载体或20mg/kg的化合物401并没有引起显著的体重变化。

乳腺癌异种移植模型。MDA-MB-231人乳腺癌细胞皮下接种雌性无胸腺裸鼠(8×10⁶细胞/小鼠)，并使之形成可触知的肿瘤。当肿瘤达到大约200mm³时，动物每天用200mg/kg的化合物401或载体对照进行口服(po)治疗(连续5天，跟着是2天的施用休息日)。化合物401以20mg/ml配制在8％gelucire和20％维生素E中。动物接受总计15个剂量的化合物401或载体对照。在整个治疗过程中测量肿瘤。如图16所示，用化合物401作为单一疗法以200mg/kg口服施用有力地抑制了肿瘤生长。化合物401的最佳肿瘤生长肿瘤生长抑制经计算为66％，p值为0.0068。口服施用载体或200mg/kg的化合物401并没有引起显著的体重变化。这些数据提示，化合物401能够以在这种人乳腺癌模型中有效的方案安全施用。

前列腺癌异种移植模型。PC3人前列腺癌细胞皮下接种雌性无胸腺裸鼠(8×10⁶细胞/小鼠)，并使之形成可触知的肿瘤。当肿瘤达到大约100mm³时，动物每天用20mg/kg的化合物401或载体对照进行腹膜内(ip)治疗。化合物401以5mg/ml配制在2％脂质、0.1％胆固醇和H₂O中。动物接受总计30个剂量的化合物401或载体对照。在整个治疗过程中测量肿瘤。如图17所示，用化合物401作为单一疗法以20mg/kg腹膜内施用抑制了肿瘤生长。化合物401的最佳肿瘤生长抑制经计算为55％，p值为0.015。ip施用载体或20mg/kg的化合物401并没有引起显著的体重变化。这些数据提示，化合物401能够以在这种人前列腺癌模型中有效的方案安全施用。

胃癌异种移植模型。MKN-45人胃癌细胞皮下接种雌性无胸腺裸鼠(8×10⁶细胞/小鼠)，并使之形成可触知的肿瘤。当肿瘤达到大约180mm³时，动物每天口服(po)施用200mg/kg的化合物401或载体对照。化合物401以20mg/ml配制在8％gelucire和20％维生素E中。动物接受总计20个剂量的化合物401或载体对照。在整个治疗过程中测量肿瘤。如图18所示，用化合物401作为单一疗法以200mg/kg口服施用抑制了肿瘤生长。化合物401的最佳肿瘤生长抑制经计算为70％，p值为0.01。口服施用载体或200mg/kg的化合物401并没有引起显著的体重变化。这些数据提示，化合物401能够以在这种人胃癌模型中有效的方案安全施用。

肝癌异种移植模型。HepG2人肝癌细胞皮下接种雌性无胸腺裸鼠(8×10⁶细胞/小鼠)，并使之形成可触知的肿瘤。在本研究中，当肿瘤达到大约700mm³时开始给药。动物每天用10mg/kg的化合物401或载体对照进行静脉内(iv)治疗。化合物401以2mg/ml配制在1.5％白蛋白中。动物接受总计10个剂量的化合物401或载体对照。在整个治疗过程中测量肿瘤。如图19所示，即使是在肿瘤生长的非常晚期阶段才开始治疗，用化合物401作为单一疗法以10mg/kg静脉内治疗仍有力地抑制了肿瘤生长。化合物401的最佳肿瘤生长抑制经计算为52.3％，p值为0.05。iv施用载体或10mg/kg的化合物401并没有引起显著的体重变化。这些数据提示，化合物401能够以在这种人肝癌模型中有效的方案安全施用。

实施例6

抗转移功效

还检验了化合物401在ISMS模型中抑制转移的能力。脾内裸鼠模型系统(ISMS模型)适于研究结直肠癌的恶性行为，因为此技术能够在肝中产生实验性转移。在此模型中，在裸鼠脾被膜下注射处于0.1ml PBS中的100万HT29细胞。将脾重置于腹膜腔内，并闭合切口。小鼠在垂死时或注射后30天处死。取出脾和肝进行检查，并记录肿瘤病变数(number of tumorlesions)。小鼠分成2组，对照组给予载体(n＝4)，而另一组接受20mg/kg化合物401(n＝4)。在i.s.注射后第2天起至第30天，5天/周腹膜内施用药物。显微镜检估算原发性肿瘤和转移性肝肿瘤的数目。代表性照片示于图20。在载体对照组中，脾脏处有重负荷的原发性肿瘤(图20，上左图)。还观察到大量的自发肝转移(图20，上右图)。化合物401处理显著降低了原发性肿瘤病灶数和自发肝转移数(图20，下图)。

实施例7

药物代谢动力学和毒性谱

在大鼠中进行了化合物401的药物代谢动力学分析。用于药物代谢动力学评价的雌性Sprague Dawley大鼠(9只大鼠/组)通过口服强饲给药。剂量体积为10ml/kg，各组分别给予含对照媒介物(9％Gelucire 44/14和18％维生素E TPGS，于无菌水中)的制品，或者于对照媒介物中的10或30mg/kg/天化合物401。按3只动物/性别/时间点在施用前以及初始施用后大约2、4、6、8、10和24小时采集血样。离心收获血浆，并贮存在设置维持在-75℃±15℃的冰箱中直至分析。本研究的生物分析部分利用经验证的LC/MS/MS方法进行。定量下限(LLOQ)为10.0ng/mL。如图21所示，药物代谢动力学数据显示，化合物401达到并维持不超过7μM的临界浓度不超过8小时。

在这些剂量时在连续施用28天的大鼠中未观察到毒性作用。这包括临床观察、实验室化验、总体的和组织学的结果。总而言之，这些数据证明，对于选择性抗癌活性而言，化合物401能够实现期望的PK暴露。

实施例8

方案1

DBU：1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯；

THF：四氢呋喃；

RT：室温。

制备2-乙酰基-4H，9H-萘并[2，3-b]呋喃-4，9-二酮(通式4-6的化合物，其中R1＝R7＝H且R3＝-CH₃)

向剧烈搅拌的处于冰浴中的18.8g(22ml，0.268mol)3-丁烯-2-酮(方案1中的通式4-1)在200ml戊烷中的溶液中，在30分钟内缓慢加入39.0g(12.54ml，0.244mol)溴在50ml戊烷中的溶液。在冰浴中另外搅拌5分钟之后，蒸发混合物以除去大部分戊烷。将来自步骤1的小量3，4-二溴-2-丁酮残留物(4-2)溶解在400ml THF中，然后在冰浴上冷却。向冰浴中剧烈搅拌的该溶液中，在30分钟内缓慢加入在50ml THF中的37.2g(36.5ml，0.244mol)DBU。生成大量盐沉淀物。该混合物直接用于下一步的反应。向3-溴-3-丁烯-2-酮(4-3)的反应混合物中加入38.5g(0.220mol)2-羟基-1，4-萘醌(4-4)。所得的混合物在室温水浴中剧烈搅拌。然后在30分钟内向该混合物中缓慢加入44.6g(43.8ml，0.293mol)DBU。反应混合物的温度由于反应生成的热而升高，通过向水浴中加冰而控制在低于35℃。在室温开放剧烈搅拌另外3小时后，向混合物中加入1,800ml水。将所得的混合物冷至0℃，然后过滤。过滤的固体相继地用500ml水、500ml 5％碳酸氢钠水溶液、500ml1％醋酸和250ml冰冷丙酮洗涤。洗涤后的固体在200ml甲酸中重结晶，得到12g产物，化合物4-6或3-2(R1＝H，R3＝CH₃，R7＝H)的总产率为22.8％¹H NMR(CDCl₃中)δ2.67(s，3H)，7.61(s，1H-3)，7.79-7.84(m，2H)，8.22-8.28(m，2H)。

实施例9

方案2

制备化合物磷酸单-[1-(4，9-二氧代-3a，4，9，9a-四氢-萘并[2，3-b]呋喃-2-基)-乙烯基]酯

向-78℃的BBI6002(240mg，1mmol)在50THF中的溶液中加入双(三甲基甲硅烷基)氨基锂溶液(1.0M在THF中，1.2mL)。在此温度搅拌1小时之后，反应混合物在0℃搅拌30分钟。然后在-78℃向该混合物中加入氯磷酸二甲酯(217mg，1.5mmol)在5mLTHF中的溶液。搅拌所得混合物，并使之缓慢温至室温。室温搅拌1小时后，蒸发掉溶剂，残留物溶解在CH₂Cl₂中，用饱和NH₄Cl和水洗涤，在MgSO₄上干燥。溶剂蒸发产生粗反应混合物，通过柱层析纯化，得到黄色固体的磷酸1-(4，9-二氧代-3a，4，9，9a-四氢-萘并[2，3-b]呋喃-2-基)-乙烯基酯二甲酯。¹H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.20-8.28(m，2H)，7,78-7.82(m，2H)，7.07(s，1H)，5.78(t，1H，J＝2.8Hz)，5.50(t，1H，J＝2.8Hz)，3.96(s，3H)，3.94(s，3H)；MS m/z 347.20(M-H)。

实施例10

方案3

制备化合物磷酸1-(4，9-二氧代-3a，4，9，9a-四氢-萘并[2，3-b]呋喃-2-基)-乙烯基酯二甲酯

在室温向磷酸1-(4，9-二氧代-3a，4，9，9a-四氢-萘并[2，3-b]呋喃-2-基)-乙烯基酯二甲酯(40mg，0.114mmol)在CH₂Cl₂(2mL)中的溶液中，加入三甲基甲硅烷基溴化物(71mg，0.46mm0l)。反应混合物室温搅拌3小时，然后真空浓缩。残留物通过半制备性HPLC纯化，获得黄色固体的产物磷酸单-[1-(4，9-二氧代-3a，4，9，9a-四氢-萘并[2，3-b]呋喃-2-基)-乙烯基]酯。¹H NMR(400MHz，CDCl3)δ¹H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.98-8.02(m，2H)，7,57-7.62(m，2H)，6.92(s，1H)，5.54(t，1H，J＝2.8Hz)，5.36(t，1H，J＝2.8Hz)；MS m/z 319.20(M-H)。

本文引述的所有参考文献在适用法律允许的程度上整体并入本文作为参考，并在相同的程度上用于所有目的，就如同明确单独地说明将各单个出版物或专利或专利申请全文并入作为参考用于所有目的一样。在并入作为参考的出版物和专利或专利申请与本说明书所含公开内容相悖的程度上，本说明书旨在替换和/或优先于任何这样的矛盾材料。

在本说明书和权利要求书中所用的表达成分、反应条件、分析结果等等数量的数字在所有情况下应理解为受术语“约”修饰。从而，除非有相反说明，本说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数为近似值，其可以根据本发明寻求获得的期望性能而变。各数值参数应按照有效数字和普通舍入方法加以解释，但丝毫、也不应试图限制等同原则对权利要求范围的适用。

可对本发明进行修饰和改变而不偏离其精神和范围，这对本领域技术人员是显而易见的。本文所述的具体实施方案仅仅是作为举例提供，而不意味着以任何方式加以限制。意思是说明书和实施例应视为仅仅是例示性的，而本发明的真正范围和精神由如下权利要求表示。

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