血液中循环黑素瘤细胞的自动化计数和表征

摘要

系统提供了一种对血液中的循环黑素瘤细胞进行计数的系统。该系统以免疫磁性方法富集上皮细胞、对所述细胞进行荧光标记并鉴定和定量循环黑素瘤细胞。外周血液肿瘤载荷中检测到的循环黑素瘤细胞的绝对数量在某种程度上是对存活率、进展时间以及对治疗的响应进行预测的因素。本发明提供了一种对血液样品中的循环黑素瘤细胞进行计数的方法。因此，该技术提供了用于监测患有黑素瘤的患者的疾病进展的工具和装置。

说明书

发明人：Mark Connelly、Chandra Rao和Leon W.M.M Terstappen

相关专利申请的交叉引用

该申请是要求于2007年11月27目提交的美国临时申请61/004,345的优先权的非临时专利申请。将上述专利申请以引用的方式全文并入本文。

背景技术

技术领域

本发明整体涉及基于血液中形态学完整的循环黑素瘤细胞(CMC)的存在对癌患者的疾病进展进行监测和评估。更具体地讲，本发明描述了用于评估患者的循环黑素瘤细胞的方法、试剂和装置。通过建立的用于对大约5至50mL外周血液中1个或2个循环肿瘤细胞进行分离和成像的高敏方法来检测循环黑素瘤细胞。肿瘤细胞数量的水平和肿瘤细胞数量的增加可提供监测患有转移性黑素瘤的患者的手段。

背景技术

晚期黑素瘤的治疗因其异质性组织病理学和在肿瘤进展过程中积累的构成变化而变得复杂。对患有转移性乳癌或结肠直肠癌的患者的循环肿瘤细胞进行计数和表征已显示可提供在临床上重要且可用于监测患者管理的独立的预后信息和预测信息。

循环肿瘤细胞(CTC)已显示是原发癌、可能治愈的疾病阶段以及持续为大多数恶性肿瘤的主要死亡原因的转移性疾病之间的关键环节。临床研究已表明，CTC是转移性乳癌的作用很强的预后性和预测性生物标记物，并且据报道在前列腺癌和结直肠癌领域已有类似发现。这些数据显示，CTC代表了驱动转移性癌的基础生物学，并且表明对这些细胞进一步的细胞和分子分析可揭示对癌细胞转移的分子调控和对治疗的响应的新认识。

对于CTC在癌细胞转移中的作用及其用作药代动力学和药效动力学研究中的生物标记物的扩展的研究已受限于药物研发的临床阶段。通常公认的是，大多数癌患者并非死于原发肿瘤，而是死于癌细胞转移，即由恶性细胞形成的多个扩散的肿瘤集落，这些恶性细胞自己脱离原发肿瘤并在体内移动，通常移至较远部位。最成功的癌治疗策略是在肿瘤仍限于某一器官时进行早期检测并通过手术切除肿瘤。事实证明，对于某些癌来说，尤其是存在合适的诊断性试验(例如用于子宫颈癌的PAP涂片、用于乳癌的乳房X线照相术和用于前列腺癌的血清前列腺特异性抗原(PSA))时，癌症早期检测是可行的。然而，早期检测到的许多癌症在通过外科手术切除之前就已出现微转移。因此，及时准确地确定肿瘤的恶性可能性对于选择正确疗法十分重要。

如果足够早地检测出原发肿瘤，往往可以提供外科手术、放疗或化疗或这些疗法的某种组合来去除肿瘤。遗憾的是，很难检测和消除转移集落，并且通常不可能成功治疗所有这些转移集落。因此，癌细胞转移可视为癌自然发展的确定性事件。此外，转移能力是唯一表征恶性肿瘤的属性。

HER-2/neu的增加会造成对激素治疗响应的降低，并且是预测对激素受体阳性转移性乳癌的响应的重要预后因素。因此，对于与HER-2/neu癌基因产物有关的恶性肿瘤，根据升高水平监测治疗或评估风险的方法(US5,876,712)已有记载。然而，在缓解过程中，或甚至在健康正常人中的基础水平较高，可与见于患者中的浓度重叠，因此需要多次检测和监测以建立依赖于患者的基线和截止水平。

对于前列腺癌，已经证实血清的PSA水平在早期检测方面有用。结合随访体检和活组织检查使用时，PSA检测在得到最佳处理的情况下改善了对早期前列腺癌的检测。

对血液中完整肿瘤细胞的检测直接关联到接受过原发肿瘤切除术的癌患者的复发转移性疾病。遗憾的是，同样的恶性细胞扩散仍然被传统的肿瘤分期程序错过。最近的研究表明，癌患者骨髓内单一恶性肿瘤细胞的存在是转移复发的独立预后因素(Diel IJ、Kaufman M、Goerner R、CostaSD、Kaul S、Bastert G.，Detection of tumor cells in bone marrowof patients with primary breast cancer：a prognostic factor fordistant metastasis.J Clin Oncol，(对原发性乳癌患者骨髓内的肿瘤细胞的检测：远程转移的预后因素，《临床肿瘤学杂志》)，10：1534-1539，1992)。但与血液中散布的上皮肿瘤细胞的检测相比较，这些侵入式技术被认为对于常规或多重临床测定是不可取或不可接受的。

一种替代方法整合了免疫磁性分离技术，在明确检测完整的循环癌细胞时具有更高的灵敏性和特异性。本发明使用了文献所述的这种简单而灵敏的诊断工具(如US6,365,362、US6,551,843、US6,623,982、US6,620,627、US6,645,731、WO 02/077604、WO03/065042和WO03/019141所述)，来提供用于对CTC进行计数的临床前动物模型。

使用该诊断工具，将来自癌患者的血液样品(WO 03/018757)与用针对上皮细胞表面抗原(例如EpCAM)的抗体包被的磁珠一起温育。用抗-EpCAM包被的磁性纳米粒子标记，然后利用磁选仪分离出带磁性标记的细胞。对通过免疫磁性法富集的级分进一步处理，用于下游免疫细胞化学分析或图像细胞计量术，例如，在CellTracks系统(Veridex LLC，NJ)中进行。也可将磁性级分用于下游免疫细胞化学分析、RT-PCR、PCR、FISH、流式细胞术或其他类型的图像细胞计量术。

CellTracks系统利用免疫磁性选择和分离来高度富集和浓缩全血样品中存在的任何上皮细胞。将所捕获的细胞可检测地标以白细胞特异性标记物和一种或多种肿瘤细胞特异性荧光单克隆抗体，以使得能对所捕获的CTC进行鉴别和计数以及与污染性非靶细胞明确地在仪器上或视觉上做区分。这种测定法即使在低肿块的早期阶段也能检测出肿瘤细胞。本发明的实施例并不限于CellTracks系统，而是包括敏感性和特异性相当的任何分离及成像方案。

目前可利用的技术尚未表明为是在评估转移性黑素瘤癌进展中重复监测CMC的一贯可靠的方法。因此，不仅在黑素瘤中而且一般来说在转移性癌中，存在对具有转移可能性的癌细胞进行准确检测的明显需求。此外，需要为给定患者选择最有效的治疗也强化了这种需求。

不能重复监测黑素瘤和其他癌的CMC限制了通过抽血获得的对它们的分析。因此，尚未建立对诸如CMC在肿瘤进展及相关治疗过程中的临时变化之类的疾病进展特征的研究。然而，使用该技术测定CMC会使得能将CMC评估整合进临床前和临床研究中。进一步表征这些细胞的特异性分子标记物将有助于靶向治疗的“配套”诊断性测定的提早发展，从而加速将新的测定方案应用到患者临床试验，并最终用于临床实践。

发明内容

本发明通过结合采用诸如CellTracks系统之类的临床分析工具，提供了一种用于在患有黑素瘤的患者的血液中捕获和检测循环黑素瘤细胞(CMC)的自动化方法，该方法是基于患有转移性癌的患者中循环上皮细胞的绝对数量、改变或这两者的组合。该系统通过用免疫磁性法富集上皮细胞、对所述细胞进行荧光标记、鉴定并定量CMC用以黑素瘤的阳性计数。

附图说明

图1：用于确认所捕获对象为人肿瘤细胞的CellTracks荧光分析图。勾号表示基于复合图像的阳性肿瘤细胞。复合图像源自关于上皮细胞标记物(EC-PE)和核染料(NADYE)的阳性选择。还需要关于白细胞标记物(L-APC)和对照物(CNTL)的阴性选择。

具体实施方式

虽然用于分离、富集和分析血液中CTC的任何有效机制都是合适的，但一种用于采集循环肿瘤细胞的方法将免疫磁性富集技术、免疫荧光标记技术和首次采血后适当的分析平台组合在一起。相关测试已证明该方法具有灵敏性和特异性，可在全血样品中检测这些稀有细胞，以及研究这些细胞在上皮起源的恶性肿瘤中的疾病临床过程中的作用。从全血样品中，可敏感且特异性地检测稀有细胞，以使得这些细胞能够被采集并用于在动物模型中对疾病进展建模。

已显示血液中存在可检测数量的循环肿瘤细胞(CTC)。这提供了一种用于研究癌患者外周循环中上皮起源细胞的重要性的工具(Racila E.、Euhus D.、Weiss A.J.、Rao C.、McConnell J.、Terstappen L.W.M.M.和Uhr J.W.，Terstappen L.W.M.M.and Uhr J.W.，Detection andcharacterization of carcinoma cells in the blood，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(对血液中的恶性肿瘤细胞的检测和表征，《美国科学院院刊》)，95：4589-4594(1998))。该研究证明，这些血源性细胞可能对于癌的病理生理学具有重要作用。该测定法的检测灵敏度为每5ml患者血液1个上皮细胞，整合了免疫磁性样品富集和荧光单克隆抗体染色，随后进行流式细胞计量分析，以快速准确地分析样品。

此前已将CellSearch^TM系统(Veridex LLC，NJ)用于对来自人血样中的循环上皮肿瘤细胞进行分离和计数²。这是一种自动化系统，其利用结合到磁珠上的上皮细胞粘附分子的抗体使上皮细胞富集。接着用荧光核酸染料4，2-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)对分离的细胞染色，以识别有核细胞。随后将回收的细胞用荧光标记的CD45单克隆抗体染色(APC通道)和细胞角蛋白8、18和19抗体染色(PE通道)，以将上皮细胞与白细胞相区分。然后定量有核细胞以作为循环肿瘤细胞。还有一个用于FITC的额外荧光通道，该通道不属于标准CellSearch^TM测定法的一部分，可用于进一步表征肿瘤细胞。

如该例子中显示的，将该测定法进一步配置成图像细胞计量术分析，使得可通过CellTracks系统分析免疫磁性富集的样品。此为基于荧光的显微镜图像分析系统，与流式细胞分析相比较，该系统可以使事件可视化，并可评估形态学特征，以进一步识别对象。

CD146(也称为MUC18、MCAM、Mel-CAM以及S-Endo-1)是一种具有有限的组织分布(包括内皮细胞、平滑肌细胞、滤泡树突状细胞、黑素瘤细胞以及激活的T淋巴细胞的亚群)的跨膜糖蛋白。

Ki-67(也称为通过单克隆抗体Ki-67或MK167鉴定的抗原)是一种细胞增殖标记物，与细胞增殖相关。在分裂间期，可于细胞核内检测到Ki-67抗原，而在有丝分裂中大多数蛋白被重新定位至染色体的表面。Ki-67蛋白存在于细胞周期的所有活跃期(G1、S、G2以及有丝分裂)，但不存在于静止细胞(G0)中。它通常用作测定细胞群生长级分的标记物。

将CellTracksAutoPrep系统和CellTracks分析仪II用于全自动捕获和检测CMC。在CMC测定中，将与黑素瘤细胞粘附分子(CD146)的特异性抗体缀合的磁性颗粒用于捕获来自7.5mL血液的黑素瘤细胞。然后，用核酸染料DAPI和与高分子量黑素瘤相关抗原的特异性PE缀合的单克隆抗体对富集的CMC进行染色。该测定法还包含APC缀合的针对CD45和CD34的单克隆抗体，以分别排除共纯化的白细胞和循环内皮细胞。另外，添加FITC标记的抗Ki67以测定细胞周期(G1、S、G2或M期)中同时处于循环中的CMC比例。将富集并染色的CMC磁性固定于CellTracks筒内，并使用CellTracks分析仪II进行扫描。细胞的单个图像呈给操作者以进行观察，并基于荧光和细胞形态学评判为CMC。当将来自细胞系SK-MEL28的黑素瘤细胞掺入来自健康供体的7.5mL血液时，CMC测定法一致性地回收其中65％的黑素瘤细胞。＞在1至1200个黑素瘤细胞/7.5mL的检测范围内，该测定法为线性的(r² 0.999，斜度0.74，截距6.8)。使用来自健康供体(n＝60)和患有转移性黑素瘤的患者(n＝71)的血液验证该测定法。在来自正常供体的7.5mL血液中，在57/60(95％)中检测到0个CMC。在3/60(5％)正常供体中有1个细胞被染色为CMC，但该细胞通常具有特征性的内皮细胞形态，且为Ki67阴性。在黑素瘤患者中，CMC的范围为0至8000个/7.5mL血液。在39％的患者中检测到一个或多个CMC，在25％的患者中检测到≥2个CMC，在8％的患者中检测到≥5个CMC，在4％的患者中检测到≥10个CMC，以及在3％的患者中检测到≥100个CMC。令人惊讶的是，30-100％(平均84％)的CMC为Ki67阳性，这提示进入血液中的高比例黑素瘤细胞活跃地分化。该自动化CMC测定法是一种用于患有转移性黑素瘤的患者的有用的监测装置，可评估预后，或可作为该难治和恶性疾病的生物标记物、靶标以及可能的治疗方法的评价工具。

实例

循环细胞角蛋白阳性细胞的计数

CellTracks系统指用于对从血液中分离的细胞进行自动计数的自动荧光显微系统。该系统包括集成式计算机控制荧光显微镜和具有可放置一次性样品盒的磁性托架组件的自动镜台。磁性托架被设计成可将样品室内铁磁流体标记的候选肿瘤细胞磁性定位至样品盒的上观测表面以进行显微观察。软件将用细胞角蛋白抗体标记并且具有上皮起源的疑似癌细胞呈给操作者，以进行最终选择。

虽然对于CellTracks系统来说可采用本领域已知的任何方式实现肿瘤细胞分离，但一个实施例采用免疫磁性富集技术从生物样品中分离出肿瘤细胞。加入上皮细胞特异性磁粒并温育20分钟。磁性分离之后，结合到免疫磁连接的抗体上的细胞通过磁力保持在管壁上。然后吸出未结合的样品，并加入等渗溶液重新悬浮样品。将核酸染料、细胞角蛋白(上皮细胞标记物)的单克隆抗体、CD 45(广谱白细胞标记物)的单克隆抗体与样品一起温育。磁性分离之后，再次吸出未结合的级分，然后将已结合的且标记的细胞在0.2mL等渗溶液中重新悬浮。将样品在细胞呈递室内悬浮并置于磁性装置内，磁性装置内的磁场会对有磁性标记的细胞进行取向，以便在CellTracks系统中进行荧光显微检测。细胞在CellTracks系统中被自动鉴别并将候选循环肿瘤细胞呈给操作者按清单进行计数。计数清单包括构成完整细胞的预定形态学标准。

使用7.5mL人全血样品，通过免疫磁性富集来分离细胞角蛋白阳性细胞。加入上皮细胞特异性免疫磁性流体并温育20分钟。磁性分离20分钟之后，结合至免疫磁连接抗体的细胞通过磁力保持在管壁上。然后吸出未结合的样品，并加入等渗溶液以重新悬浮样品。将核酸染料、细胞角蛋白(上皮细胞标记物)的单克隆抗体、CD 45(广谱白细胞标记物)的单克隆抗体与样品一起温育15分钟。磁性分离之后，再次吸出未结合级分，然后将已结合的且标记的细胞在0.2mL等渗溶液中重新悬浮。将样品在细胞呈递室内悬浮并置于磁性装置内，磁性装置内的磁场会对有磁性标记的细胞进行取向，以便在CellTracks系统中进行荧光显微检测。细胞在CellTracks系统中被自动鉴别；该系统将对照细胞计数，而候选循环肿瘤细胞则被呈递给操作者以使用清单进行计数，如图1所示。

尽管上文已经描述和具体例证了本发明的某些优选的实施例，但并不意味着本发明将局限于这些实施例。在不脱离本发明精神的情况下可以对这些实例进行各种修改，后附的权利要求书涵盖了全部改进范围。