二萜单体及从大青中分离制备二萜单体的方法

摘要

本发明公开了4种二萜单体，还同时公开了从大青中分离制备二萜单体的方法，包括以下步骤：1)以大青的茎部作为原料放入乙醇溶液中于回流状态下进行提取，所得的浸提液减压浓缩；2)将所得的浓缩提取液用石油醚萃取，所得萃取液分层后，得位于下层的萃取后水相；3)将萃取后水相用乙酸乙酯萃取，所得萃取液减压浓缩，得二萜粗提物；4)采用逆流色谱方法分离二萜粗提物；5)收集逆流色谱分离的目标组分进行减压浓缩，直至固形物质量分数达到70％以上，再采用冷冻干燥，得到粉末状二萜单体。该二萜单体具有抗肿瘤的特性。

说明书

技术领域

本发明属于轻工技术领域，涉及中药材大青的深加工技术，具体为从大青中分离制备高纯度二萜单体的方法。

背景技术

从历代本草记载及民间治病的经验看，大青属多种植物，其具清热解毒、祛风除湿、活血散瘀、降压、消炎镇痛等功效，常用于治疗感冒高热、风湿性关节炎、跌打损伤、降血压、痈疽、疔疮等疾病。浙江大青中含有多种萜类物质，现有研究表明天然二萜类物质有良好的抗癌、抗炎、抗氧化等作用，可以开发成有益于人们身体健康的药品。

现有关于二萜的分离主要采用柱层析和制备型高效液相色谱，其局限性是分离效果差、制备量少且工作量大。其次，柱层析和制备型高效液相色谱再生使用相对困难，分离得到的二萜类化合物，难以发展成为制备量大的分离技术。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种成本低廉的从大青中分离制备二萜单体的方法，采用该方法能较大批量的获得高纯度的二萜单体。

为了解决上述技术问题，本发明提供4种二萜单体，该4种二萜单体分别为二萜单体(I)、二萜单体(II)、二萜单体(III)和二萜单体(IV)，其结构式分别如下；

本发明还同时提供了一种从大青中分离制备二萜单体的方法，包括以下步骤：

1)、以大青的茎部作为原料，将上述原料放入乙醇溶液中于回流状态下进行提取，所得的浸提液减压浓缩；得浓缩提取液；

2)、将浓缩提取液用等体积的石油醚萃取，所得萃取液分层后，得位于下层的萃取后水相；

3)、将萃取后水相用等体积的乙酸乙酯萃取，所得萃取液减压浓缩，得二萜粗提物；

4)、采用逆流色谱方法分离二萜粗提物；

5)、收集逆流色谱分离的目标组分进行减压浓缩，直至固形物质量分数达到70％以上，再采用冷冻干燥，得到粉末状二萜单体。

作为本发明的从大青中分离制备二萜单体的方法的改进，步骤4)为：

A、配制溶剂系统I和溶剂系统II，溶剂系统I按照石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝5∶5∶3∶6的体积比组成，溶剂系统II按照石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝5∶5∶5∶5的体积比组成；溶剂系统I充分摇匀后静置，分别得溶剂系统I上相和溶剂系统I下相；溶剂系统II充分摇匀后静置，分别得溶剂系统II上相和溶剂系统II下相；

B、将溶剂系统I上相注入逆流色谱仪的色谱柱；

C、将溶剂系统I上相和溶剂系统I下相按照1∶1的体积比混合后作为溶剂，将步骤3)所得的二萜粗提物溶入所述溶剂中，得逆流色谱分离样品溶液；

D、开启逆流色谱仪，选用以下任意一种注入方式：

先注入逆流色谱分离样品溶液，然后注入溶剂系统I的流动相(下相)；或者先注入溶剂系统I的流动相，平衡后再注入逆流色谱分离样品溶液；

接着，用紫外-可见检测器检测逆流色谱流出液，等前两个峰出来后换成溶剂系统II的流动相(下相)梯度洗脱，根据所得的色谱图收集目标组分。

作为本发明的从大青中分离制备二萜单体的方法的进一步改进：逆流色谱仪为高速逆流色谱仪HSCCC或低速逆流色谱仪SRCCC。

作为本发明的从大青中分离制备二萜单体的方法的进一步改进：步骤1)中采用质量分数为70％～80％的乙醇溶液进行提取，共提取3次，每次提取2.5～3.5小时；每次提取时原料与所用乙醇溶液的质量体积比为：1g/5ml。

作为本发明的从大青中分离制备二萜单体的方法的进一步改进：步骤2)的萃取次数为2次，所述步骤3)的萃取次数为2次。

作为本发明的从大青中分离制备二萜单体的方法的进一步改进：步骤1)和步骤3)中的减压浓缩条件为：真空度低于0.09Mpa，温度为50～60℃；步骤5)中的减压浓缩条件为：真空度低于0.05Mpa，温度为40～50℃。

作为本发明的从大青中分离制备二萜单体的方法的进一步改进：步骤5)中的冷冻干燥条件为：真空度低于30Pa，温度为-35～-30℃。

在本发明的分离制备方法中，以逆流色谱仪为分离设备来分离粗提物中的二萜单体，其溶剂系统由常温常压下处于液态的石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水组成，上相做固定相，下相做流动相。

本发明的优点是：分离效果好、效率高，二萜单体产品的纯度达到95％以上，二萜单体制备成本远低于现有技术，是一种经济、高效的从浙江大青中分离制备高纯度二萜单体的方法。

二萜单体(I)、二萜单体(II)、二萜单体(III)和二萜单体(IV)均具有抗肿瘤的特性，它们的用法和用量均为：口服5mg/kg(体重)。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为本发明的工艺流程图。

图2为实施例1的HSCCC-D400分离图谱。

图3为实施例2的HSCCC-D1200分离图谱。

图4为实施例3的HSCCC-D3500分离图谱。

具体实施方式

实施例1、一种从大青中分离制备二萜单体的方法，依次进行以下步骤：

1)、将干燥的浙江大青的茎部粉碎成粉末作为原料，将上述原料放入质量分数(质量浓度)为75％的乙醇溶液中在75℃的回流温度下进行提取，共提取3次，每次提取的条件均如下：原料与所用乙醇溶液的质量体积比为：1g/5ml，提取时间为2.5～3.5小时。

合并3次提取所得的浸提液进行减压浓缩(真空度低于0.09Mpa、温度为50～60℃)，直至乙醇被去除，得浓缩提取液；

2)、将浓缩提取液用等体积的石油醚萃取，萃取次数为2次，合并2次萃取所得的萃取液分层，得位于下层的萃取后水相；

3)、将萃取后水相用等体积的乙酸乙酯萃取，萃取次数为2次，合并2次萃取所得的萃取液减压浓缩(真空度低于0.09Mpa，温度为50～60℃)，得二萜粗提物；经HPLC检测，该二萜粗提物中二萜含量约占30％。

4)、采用逆流色谱方法分离二萜粗提物，具体依次按如下步骤进行：

A、配制溶剂系统I和溶剂系统II。

溶剂系统I由石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝5∶5∶3∶6的体积比组成，即分别量取石油醚250ml、乙酸乙酯250ml、甲醇150ml和水300ml置于1000ml分液漏斗，充分摇匀后静置分层，从而分别得溶剂系统I上相和溶剂系统I下相。

溶剂系统II由石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝5∶5∶5∶5的体积比组成，即分别量取石油醚250ml、乙酸乙酯250ml、甲醇250ml、水250ml置于1000ml分液漏斗，充分摇匀后静置分层，从而分别得溶剂系统II上相和溶剂系统II下相。

B、将溶剂系统I上相400ml以20ml/min的流速注入逆流色谱仪(HSCCC-D400高速逆流色谱仪)的色谱柱；

C、将体积比为1∶1的溶剂系统I上相和溶剂系统I下相(分别为10ml)混合后作为溶剂(20ml)，将步骤3)所得的1.0g二萜粗提物溶入所述溶剂中，得逆流色谱分离样品溶液；

D、开启逆流色谱仪至800转/min，以1.0ml/min的流速泵入逆流色谱分离样品溶液；待进样结束后，再以2.0ml/min的流速注入溶剂系统I的流动相(溶剂系统I下相，400ml)洗脱柱内的二萜组分，用紫外-可见检测器在254nm检测逆流色谱流出液，等前两个峰出来后换成溶剂系统II的流动相(下相，400ml)梯度洗脱，根据所得的色谱图收集目标组分。

即，于220-280ml时，收集所得为二萜单体(I)组分；于300-380ml时，收集所得为二萜单体(II)组分；于500-550ml时，收集所得为二萜单体(III)组分；于580-660ml时，收集所得为二萜单体(IV)组分。

5)、将二萜单体(I)组分、二萜单体(II)组分、二萜单体(III)组分和二萜单体(IV)组分分别进行如下的减压浓缩和冷冻干燥：

先减压浓缩(真空度低于0.05Mpa，温度为40～50℃)，直至固形物浓度达到70％以上，再采用冷冻干燥(真空度低于30Pa，温度为-30～-35℃)；

最后，分别得到二萜单体(I)15.9mg、二萜单体(II)15.5mg、二萜单体(III)24.1mg、二萜单体(IV)19.4mg。

经HPLC法检测，纯度都在95％以上。

二萜单体(I)、二萜单体(II)、二萜单体(III)和二萜单体(IV)的结构式分别对应的为以下式I、式II、式III、式IV。

二萜单体(I)：

reddish needles；m.p.240-243℃；[α]²⁵+78.2°(c 0.05，MeOH)；UVλ_max；254，298，370，430nm；ESIMS obsd m/z 339[M-H]^-；

二萜单体(II)：

reddish needles；m.p.317-319℃；[α]²⁵-50.8°(c 0.05，MeOH)；UVλ_max：201，227，243，297nm；ESIMS obsd m/z 337[M-H]^-；

二萜单体(III)：

reddish needles；m.p.201-204℃；[α]²⁵⁺26.8°(c 0.05，MeOH)；UVλ_max：268，290，334，380nm；ESIMS obsd m/z 341[M-H]^-

二萜单体(IV)：

reddish needles；m.p.290-292℃；[α]²⁵-11.0°(c 0.05，MeOH)；UVλ_max：268，290，330，380nm；ESIMS obsd m/z 343[M-H]^-

实施例2、一种从大青中分离制备二萜单体的方法，依次进行以下步骤：

步骤1)～步骤3)同实施例1。

4)、采用逆流色谱方法分离二萜粗提物，具体依次按如下步骤进行：

A、配制溶剂系统I和溶剂系统II。

溶剂系统I由石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝5∶5∶3∶6的体积比组成，即分别量取石油醚1000ml、乙酸乙酯1000ml、甲醇600ml、水1200ml置于5000ml分液漏斗，充分摇匀后静置分层，从而分别得溶剂系统I上相和溶剂系统I下相。

溶剂系统II由石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝5∶5∶5∶5的体积比组成，即分别量取石油醚1000ml、乙酸乙酯1000ml、甲醇1000ml、水1000ml置于5000ml分液漏斗，充分摇匀后静置分层，从而分别得溶剂系统II上相和溶剂系统II下相。

B、将溶剂系统I上相1200ml以20ml/min的流速注入逆流色谱仪(HSCCC-D1200高速逆流色谱仪)的色谱柱；

C、将体积比为1∶1的溶剂系统I的上相和下相(即分别为25ml)混合后作为溶剂(50ml)，将步骤3)所得的5.0g二萜粗提物溶入所述溶剂中，得逆流色谱分离样品溶液；

D、开启逆流色谱仪至800转/min，以2.0ml/min的流速泵入逆流色谱分离样品溶液；待进样结束后，再以5.0ml/min的流速注入溶剂系统I的流动相I(溶剂系统I下相，1500ml)洗脱柱内的二萜组分，用紫外-可见检测器在254nm检测逆流色谱流出液，等前两个峰出来后换成溶剂系统II的流动相(下相，1500ml)梯度洗脱，根据所得的色谱图收集目标组分。

即，于850-1000ml时，收集所得为二萜单体(I)组分；于1200-1450ml时，收集所得为二萜单体(II)组分；于1850-2250ml时，收集所得为二萜单体(III)组分；于2400-2800ml时，收集所得为二萜单体(IV)组分。

5)、将二萜单体(I)组分、二萜单体(II)组分、二萜单体(III)组分和二萜单体(IV)组分分别进行等同于实施例1的减压浓缩和冷冻干燥：

最后，分别得到二萜单体(I)45.6mg，二萜单体(II)46.6mg，二萜单体(III)80.0mg，二萜单体(IV)70.4mg。

经HPLC法检测，纯度都在95％以上。

二萜单体(I)、二萜单体(II)、二萜单体(III)、二萜单体(IV)的结构式同上。

实施例3、一种从大青中分离制备二萜单体的方法，依次进行以下步骤：

步骤1)～步骤3)同实施例1。

4)、采用逆流色谱方法分离二萜粗提物，具体依次按如下步骤进行：

A、配制溶剂系统I和溶剂系统II。

溶剂系统I由石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝5∶5∶3∶6的体积比组成，即分别量取分别量取石油醚2500ml、乙酸乙酯2500ml、甲醇1500ml、水3000ml置于10000ml分液漏斗，充分摇匀后静置分层，从而分别得溶剂系统I上相和溶剂系统I下相。

溶剂系统II由石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝5∶5∶5∶5的体积比组成，即分别量取石油醚2500ml、乙酸乙酯2500ml、甲醇2500ml、水2500ml置于10000ml分液漏斗，充分摇匀后静置分层，从而分别得溶剂系统II上相和溶剂系统II下相。

B、将溶剂系统I上相3500ml以20ml/min的流速注入逆流色谱仪(HSCCC-D3500高速逆流色谱仪)的色谱柱；

C、将体积比为1∶1的溶剂系统I上相和下相(即分别为100ml)混合后作为溶剂(200ml)，将步骤3)所得的50.0g二萜粗提物溶入所述溶剂中，得逆流色谱分离样品溶液；

D、开启逆流色谱仪至600转/min，以4.0ml/min的流速泵入逆流色谱分离样品溶液；待进样结束后，再以8.0ml/min的流速注入溶剂系统I流动相(溶剂系统I下相，4500ml)洗脱柱内的二萜组分，用紫外-可见检测器在254nm检测逆流色谱流出液，等前两个峰出来后换成溶剂系统II的流动相(溶剂系统II下相，4500ml)梯度洗脱，根据所得的色谱图收集目标组分。

即，于2800-3200ml时，收集所得为二萜单体(I)组分；于3400-4200ml时，收集所得为二萜单体(II)组分；于5500-6400ml时，收集所得为二萜单体(III)组分；于7000-8000时ml，收集所得为二萜单体(IV)组分。

5)、将二萜单体(I)组分、二萜单体(II)组分、二萜单体(III)组分和二萜单体(IV)组分分别进行等同于实施例1的减压浓缩和冷冻干燥：

最后，分别得到二萜单体(I)300.0mg，二萜单体(II)400.0mg，二萜单体(III)356.0mg，二萜单体(IV)545.0mg。

经HPLC检测，纯度都在90％以上。

二萜单体(I)、二萜单体(II)、二萜单体(III)、二萜单体(IV)的结构式同上。

实验1、对二萜单体(III)和二萜单体(IV)进行了抗肿瘤实验：

体外肿瘤细胞增殖抑制试验：取对数生长期肿瘤细胞，调整细胞悬液浓度(50000～100000个/毫升)，每孔100μl细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，接种24h后给药(100μl/孔)，分别设空白对照组、细胞对照组以及6个浓度(1.56，3.12，6.25，12.5，25，50μmol/L)受试药物组。继续培养72h后每孔加入100μl MTT(1mg/ml，以DMEM培养液溶解)，37℃孵育4h，弃去各孔内液体后加入150μl酸化异丙醇(含0.04mol/L HCl)，避光放置30min，酶标仪测定570nm处吸光度，计算受试药物对肿瘤细胞的增殖抑制率，并以孙瑞元教授编写的NDST(New Drug Statistical Treatment)软件计算受试物对肿瘤细胞增殖(72h)的半数抑制浓度(IC₅₀)。具体如表1所示。

表1、HL-60andA549细胞的72小时半致死浓度.(μmol/L)

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。