一种利用发酵法去除棕榈仁粕中抗营养因子的方法

摘要

一种利用发酵法去除棕榈仁粕中抗营养因子的方法，包括：1.发酵菌种的制备：发酵菌种为芽孢杆菌和酵母菌，需要进行一级种子培养和二级种子扩培，培养温度为25-45℃，培养时间为12-48h，转速为120-200r/min，制备成种子液；2.原料与种子培养液的混合：粉碎的棕榈仁粕中加入一定量的水后于121℃灭菌15min，然后与发酵菌种充分混合均匀。3.发酵处理的控制：所述混合物料置于30-60℃的温度下进行发酵，保温5-15天后，得到发酵产物。本发明克服棕榈仁粕含有抗营养因子以及甘露聚糖酶低产和高成本的问题，工艺简单，不产生废弃物，适于规模化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用发酵法制备饲料技术领域，具体涉及一种利用微生物来降解棕榈仁粕中抗营养因子的方法，通过该方法得到一种可作为饲料或饲料配方的产物，属于发酵工程技术领域。

背景技术

棕榈仁粕是棕榈仁通过机械压榨或溶剂萃取榨油后的副产品，其形状、颜色与菜子粕相似，略有巧克力气味。棕榈仁粕视其脱壳程度和加工工艺的不同，品质相差很大。其纤维含量高，粗蛋白含量低，赖氨酸、蛋氨酸以色氨酸均缺乏(主要成分组成见表1)。

表1棕榈仁粕的主要组成成分

棕榈仁粕价格低廉，无霉性和副作用，因其粗脂肪含量较高，在具体使用中可将其归为能量饲料，可按一定的比例替代部分玉米或麸皮，特别适用于反刍动物如牛、羊、马、鹿等的饲料。使用棕榈仁粕替代部分玉米或豆粕等饲料，最直接的表现是：饲料成本大幅降低，但饲养效果不变，从而使饲料企业、畜牧企业的经济效益显著提高，在同行中的竞争力大大增强。

虽然棕榈仁粕已经在规模化运作的欧洲、韩国等地区广为使用，但由于中国用户对棕榈仁粕相对还不熟悉，目前还较少进口使用，这也说明棕榈仁粕在中国具有很大的商业开发价值，至今，国内对棕榈仁粕在饲料中的应用和研究鲜见报道。

有报道显示，影响棕榈仁粕作为饲料使用的原因不仅仅在于其粗纤维含量较高，更主要的是因为棕榈仁粕中含有大量的抗营养因子：β-甘露聚糖。β-甘露聚糖包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘聚糖等。如何采用有效的方法来降解甘露聚糖并使之转为可为动物利用的营养物质，已成为饲料行业一个亟待解决的问题。

目前，主要通过物理、化学和生物学途径来钝化和灭活饲料中的抗营养因子，这些方法都能在一定程度上降低抗营养因子的含量。相比物理和化学法，采用生物技术方法处理原料中的抗营养因子已越来越受到人们的重视，不仅使用效果好，而且成本低，已经成为该领域的研究热点之一。

β-1，4-D-甘露聚糖酶(β-1，4-D-mannanase)是一类能水解含有β-1，4-D-甘露糖为主链的多糖(包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘聚糖等)的内切酶。该酶用途广泛，能分解甘露聚糖，生产能促进双歧杆菌生长、改善肠道菌群结构的低聚糖；可作为工具酶用于天然多糖类结构的分析；可在造纸工业中，与β-木聚糖酶等半纤维素降解酶类协同使用，能除去纸浆中的半纤维素，改善纸质；在纺织工业中用于纤维中半纤维素的降解，能有效去除纺织品所粘附的多余染料；还能在饲料工业中用作酶添加剂，起到消除抗营养因子的作用。

添加酶制剂一方面可以使饲料中的抗营养因子失活，另一方面可以降解多种需要降解的底物(抗营养因子或营养成分)，将饲料中营养物质降解为小分子物质，有利于动物机体吸收，能最大限度地提高饲料的营养价值；通过微生物(细菌和真菌)进行发酵，从而产生降解酶能使抗营养因子钝化或降低。

虽然甘露聚糖酶的应用前景广阔，但目前总的来说，其低产和高成本限制了其应用范围和规模。

发明内容

本发明就是为了解决上述问题，克服棕榈仁粕作为饲料使用含有大量的抗营养因子的问题，以及克服甘露聚糖酶低产和高成本的问题，提供一种利用发酵法去除棕榈仁粕中抗营养因子的方法。本发明提供一种工艺过程简单，不产生大量废弃物的利用微生物固态发酵处理棕榈仁粕的方法，该发明适用于规模化生产。

本发明采用混菌发酵较单菌发酵效果好，其优势在于多个菌种之间可以互相补偿自身的缺陷，进行协同发酵。

本发明采用固态发酵能简化生产工艺，免去液体发酵需要脱水、收集和干燥的麻烦程序，有产量高，过程简易，投资低，能耗少等优点，对营养物质的损失较少，前景十分广阔。

本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：

一种利用发酵法去除棕榈仁粕中抗营养因子的方法，采用微生物混菌固态发酵来降解棕榈仁粕中的抗营养因子，提高棕榈仁粕作为饲料的营养价值的方法，包括以下步骤：

第一步，发酵菌种子液的制备：

发酵菌种为芽孢杆菌和酵母菌的混菌，芽孢杆菌和酵母菌需要进行一级种子培养和二级种子扩培，培养温度为25-45℃，培养时间为12-48h，转速为120-200r/min，制备成发酵菌种子液；

(1)芽孢杆菌种子液的制备

1)一级种子培养：从斜面芽孢杆菌的菌种挑取一环菌体到装有10ml种子培养基的250ml三角瓶中，置于恒温调速摇床中进行菌体培养，转速为170r/min，30-40℃培养24小时；

2)二级种子扩培：吸取5ml一级种子培养液到装有100ml种子培养基的500ml三角瓶中，置于恒温调速摇床中进行菌体培养，转速为150-170r/min，37℃培养24小时，备用；

所述芽孢杆菌优选的培养温度为37℃，培养时间为24h，转速为170r/min；

斜面培养基(g/L)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，pH值7.0-7.2，121℃灭菌20min；

种子培养基(g/L)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，pH值7.0-7.2，121℃灭菌20min；

所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)均为本实验室保藏菌株。

(2)酵母菌种子液的制备

1)一级种子培养：从保藏的斜面酵母菌的菌种挑取一环菌体到装有10ml种子培养基的250ml三角瓶中，置于恒温调速摇床中进行菌体培养，转速为150r/min，30-40℃培养24小时；

2)二级种子扩培：吸取5ml一级种子培养液到装有100ml种子培养基的500ml三角瓶中，置于恒温调速摇床中进行菌体培养，转速为150-170r/min，30℃培养24小时，备用；

所述酵母菌的培养温度为30℃，培养时间为24h，转速为150r/min；

斜面培养基(g/L)：葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂20g，121℃灭菌15min；

种子培养基(g/L)：葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏5g，121℃灭菌15min；

所述酵母菌为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)来源于江南大学生物工程学院。

第二步，原料与芽孢杆菌种子液和酵母菌种子液的混合

原料采用棕榈仁，先将棕榈仁粕粉碎至大小为3-8mm左右，以提高与菌种的接触面积，使发酵过程更加彻底；原料中加入一定量的水后于121℃灭菌15min，分别接入芽孢杆菌种子液和酵母菌种子液，芽孢杆菌种子液和酵母菌种子液的接入量为棕榈仁粕质量的5-20％，充分混合均匀，混合后物料的水分控制在30-70％。

所述棕榈仁粕粉碎至大小为5mm为佳。

所述步骤(2)中：芽孢杆菌种子液和酵母菌种子液的质量比为1∶1。

第三步，发酵处理的控制

将上述混合物料置于30-60℃的温度下进行发酵，pH5-9，保温5-15天后，得到发酵产物。所述混合物料调pH6，置于温度为40℃，发酵时间为10-15天为佳。

通过上述方法，采用微生物发酵来降解棕榈仁粕中的甘露聚糖，得到含水量较高的混合物，该产物可以直接作为饲料饲喂动物，也可以对发酵后的产物进行干燥、粉碎后，得到粒状成品作为饲料产品使用。

棕榈仁粕经过微生物发酵处理后，粗蛋白含量由原来的14％提高到18％，提高了28.5％；通过微生物生长产生的甘露聚糖酶的作用使棕榈仁粕中的还原糖含量达到160mg/g棕榈仁粕，营养物质明显提高。这一产品的推广应用，将大大降低饲料工业对豆粕、鱼粉等饲料原料的依赖性，开辟了新的蛋白饲料资源，将是解决世界上一些国家对传统饲料原料短缺的担忧问题的有效途径，同时产生巨大的经济效益。

本发明是利用棕榈仁粕为固态基质，与发酵菌种充分混合后，通过微生物的生长，有益微生物得到大量的繁殖，产生大量的甘露聚糖酶，能够降解棕榈仁粕中的抗营养因子，同时积累了一些有益代谢产物。甘露聚糖酶是半纤维素酶的一种，能够水解甘露聚糖(包括半乳甘露聚糖，葡萄甘露聚糖和葡萄半乳甘露聚糖)的β-1，4糖苷键，能将广泛存在与豆类籽实中的甘露聚糖降解为甘露低聚糖，不仅消除了甘露聚糖对单胃动物的抗营养作用，同时生成的甘露低聚糖在动物肠道中起着重要的作用，如促进双歧杆菌的增殖，有效抑制病原菌和防止腹泻；减少有毒发酵产物及有害细菌的产生，增强机体免疫力等。

本发明的有益效果：

1、解决棕榈仁粕中含有大量的抗营养因子，影响棕榈仁粕作为饲料使用的问题，使用棕榈仁粕替代部分玉米或豆粕等饲料，降低饲料成本。缓解饲料工业对豆粕、鱼粉等饲料原料的依赖性，开辟了新的蛋白饲料资源，缓解对传统饲料原料短缺的担忧问题的有效途径，同时产生较大的经济效益。

2、本发明采用混菌发酵较单菌发酵效果好，其优势在于多个菌种之间可以互相补偿自身的缺陷，进行协同发酵。

3、本发明采用固态发酵能简化生产工艺，免去液体发酵需要脱水、收集和干燥的麻烦程序，有产量高，过程简易，投资低，能耗少等优点，对营养物质的损失较少，前景十分广阔。

4、本发明生产过程中不产生大量废弃物，不污染环境。

附图说明

以下结合附图和具体实施方式来进一步说明本发明。

图1为本发明的简要操作流程图。

具体实施方式

为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。

实施例1

本发明的简要操作流程图，如图1所示。

1、发酵菌种的制备

(1)芽孢杆菌种子液的制备

1)一级种子培养：从保藏的枯草芽孢杆菌的斜面上挑取一环菌体到装有10ml种子培养基的250ml三角瓶中，置于恒温调速摇床中进行菌体培养，转速为170r/min，37℃培养24小时；

2)二级种子扩培：吸取5ml一级种子培养液到装有100ml种子培养基的500ml三角瓶中，置于恒温调速摇床中进行菌体培养，转速为170r/min，37℃培养24小时，备用；

斜面培养基(g/L)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，pH值7.0-7.2，121℃灭菌20min；

种子培养基(g/L)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，pH值7.0-7.2，121℃灭菌20min；

(2)酵母菌种子液的制备

1)一级种子培养：从保藏的酿酒酵母斜面挑取一环菌体到装有10ml种子培养基的250ml三角瓶中，置于恒温调速摇床中进行菌体培养，转速为150r/min，30℃培养24小时；

2)二级种子扩培：吸取5ml一级种子培养液到装有100ml种子培养基的500ml三角瓶中，置于恒温调速摇床中进行菌体培养，转速为150r/min，30℃培养24小时，备用；

斜面培养基(g/L)：葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂20g，121℃灭菌15min；

种子培养基(g/L)：葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏5g，121℃灭菌15min；

2、原料与芽孢杆菌种子液和酵母菌种子液的混合

原料采用棕榈仁，先将棕榈仁粕粉碎，其大小约为3mm左右，以提高与菌种的接触面积，使发酵过程更加彻底，准备棕榈仁粕原料100g，加入30ml的水并搅拌均匀，121℃灭菌15min。

分别加入芽孢杆菌二级种子培养液10g和酿酒酵母菌二级种子培养液10g，充分混合均匀，制成混合物料。

3、发酵处理的控制

将上述混合物料置于30℃的温度下进行发酵，pH9，保温5天后，得到发酵产物。

实施例2

如图1所示，原料采用棕榈仁，先将棕榈仁粕粉碎，其大小约为8mm左右，准备棕榈仁粕原料100kg，加入30kg的水并搅拌均匀，121℃灭菌15min；分别加入芽孢杆菌二级种子培养液和酿酒酵母菌二级种子培养液各10kg，充分混合均匀，制成混合物料。

将上述混合物料调pH为5，40℃发酵15天，干燥即得成品，其余操作同实施例1。

实施例3

如图1所示，原料采用棕榈仁，先将棕榈仁粕粉碎，其大小约为5mm左右，准备棕榈仁粕原料100kg，加入10kg的水并搅拌均匀，121℃灭菌15min；二级种子扩培时，芽孢杆菌的转速为170r/min，酿酒酵母菌的转速为150r/min，分别加入芽孢杆菌和酿酒酵母菌的二级种子培养液各20kg，充分混合均匀；制成混合物料。

将上述混合物料调pH为6，40℃发酵10天，干燥即得成品，其余操作同实施例1。

实施例4

如图1所示，原料采用棕榈仁，先将棕榈仁粕粉碎，其大小约为5mm左右，准备棕榈仁粕原料100kg，加入50kg的水并搅拌均匀，121℃灭菌15min，二级种子扩培时，芽孢杆菌的转速为170r/min，酿酒酵母菌的转速为170r/min，分别加入芽孢杆菌7kg和酿酒酵母菌的二级种子培养液各10kg，充分混合均匀，制成混合物料。

将上述混合物料调pH为6.0，37℃发酵15天，干燥即得成品，其余操作同实施例1。

实施例5

如图1所示，原料采用棕榈仁，先将棕榈仁粕粉碎，其大小约为5mm左右，准备棕榈仁粕原料100kg，加入50kg的水并搅拌均匀，121℃灭菌15min，二级种子扩培时，芽孢杆菌的转速为160r/min，酿酒酵母菌的转速为160r/min，分别加入芽孢杆菌7kg和酿酒酵母菌的二级种子培养液各10kg，充分混合均匀，制成混合物料。

将上述混合物料调pH为6.5，35℃发酵15天，干燥即得成品，其余操作同实施例1。

实施例6

如图1所示，原料采用棕榈仁，先将棕榈仁粕粉碎，其大小约为5mm左右，准备棕榈仁粕原料100kg，加入70kg的水并搅拌均匀，121℃灭菌15min，二级种子扩培时，芽孢杆菌的转速为150r/min，酿酒酵母菌的转速为150r/min，分别加入芽孢杆菌1kg和酿酒酵母菌的二级种子培养液各1kg，充分混合均匀，制成混合物料。

将上述混合物料调pH为8，30℃发酵15天，干燥即得成品，其余操作同实施例1。

实施例7

原料采用棕榈仁，先将棕榈仁粕粉碎，其大小约为5mm左右，准备棕榈仁粕原料100kg，加入30kg的水并搅拌均匀，121℃灭菌15min，二级种子扩培时，芽孢杆菌的转速为150r/min，加入芽孢杆菌的二级种子培养液10kg，充分混合均匀，制成混合物料。

将上述混合物料调pH为7，30℃发酵15天，干燥即得成品，其余操作同实施例1。

实施例8

原料采用棕榈仁，先将棕榈仁粕粉碎，其大小约为5mm左右，准备棕榈仁粕原料100kg，加入30kg的水并搅拌均匀，121℃灭菌15min，二级种子扩培时，酿酒酵母菌的转速为150r/min，加入酿酒酵母菌的二级种子培养液各20kg，充分混合均匀，制成混合物料。

将上述混合物料调pH为7，30℃发酵15天，干燥即得成品，其余操作同实施例1。

实施例9

酶活力单位定义：在上述反应条件下，每分钟由底物释放出相当于1μmolD-甘露糖的还原糖所需酶量为1个酶活力单位(U)。酶活力的测定：取0.4ml 0.5％(w/v)葡甘露聚糖(用pH7.0，0.01mol/L磷酸钠缓冲液配制)，加入0.1ml适当浓度的酶液，37℃水浴反应15min，用DNS法测定所产生的还原糖。

还原糖含量的测定准确称取2.5g棕榈仁粕发酵样品，放入150ml干净三角瓶中，用50ml80％乙醇，于70℃恒温水浴中保温60min，其间不断摇匀；取一定量上清液，采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)法测定实施例1-3所制备的发酵棕榈仁粕样品中还原糖的含量，分别为110mg/g棕榈仁粕，130mg/g棕榈仁粕和160mg/g棕榈仁粕，其余实施例的结果详见表2。

表2还原糖含量

用凯氏定氮法测定该样品的粗蛋白含量，准确称取样实施例1-8所制备的发酵棕榈仁粕样品中粗蛋白的含量，以及未发酵棕榈仁粕样品粗蛋白的含量。

称取样品0.50-2.00g→于500ml凯氏瓶中→加10g无水K₂SO₄→加0.5gCuSO₄→加20ml H₂SO₄→在通风橱中先以小火加热，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明无黑粒后，将瓶子摇动一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中→继续消化30分钟→直到样液呈绿色状态，停止消化，冷却→加200ml水→连接蒸馏装置→用硼酸作吸收液→在K氏瓶中加波动珠数粒和80ml50％NaOH→立即接好定氮球→加热→至到K氏瓶内残液减少到三分之一时，取出用水冲洗→用0.1N HCl滴定。

其测定结果棕榈仁粕经过微生物发酵处理后，粗蛋白含量由原来的14％提高到18％，提高了28.5％，实施例1-3所制备的发酵棕榈仁粕样品中粗蛋白的含量，参见表3。

表3粗蛋白含量

本发明解决棕榈仁粕中含有大量的抗营养因子，影响棕榈仁粕作为饲料使用的问题，使用棕榈仁粕替代部分玉米或豆粕等饲料，饲料成本大幅降低，但饲养效果不变，从而使饲料企业、畜牧企业的经济效益显著提高，在同行中的竞争力大大增强。

本发明采用混菌发酵较单菌发酵效果好，其优势在于多个菌种之间可以互相补偿自身的缺陷，进行协同发酵。

本发明采用固态发酵能简化生产工艺，免去液体发酵需要脱水、收集和干燥的麻烦程序，有产量高，过程简易，投资低，能耗少等优点，对营养物质的损失较少，前景十分广阔。

本发明生产过程中不产生大量废弃物，不污染环境。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。