三羧酸循环中的四碳酸或其盐在制备2-酮-L-古龙酸中的应用

摘要

本发明涉及三羧酸循环中的四碳酸或其盐的用途，尤其涉及在发酵工程、生物技术领域三羧酸循环中的四碳酸或其盐在制备2-酮-L-古龙酸中的应用。同时本发明还提供了一种用于制备2-酮-L-古龙酸的培养基及利用三羧酸循环中的四碳酸或其盐制备2-酮-L-古龙酸的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及三羧酸循环中的四碳酸或其盐的用途，尤其涉及在发酵工程、生物技术领域三羧酸循环中的四碳酸或其盐在制备2-酮-L-古龙酸中的应用。

背景技术

2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid，简称2-KGA)是制备维生素C(L-抗坏血酸)的重要前体，主要采用“二步发酵法”工艺。

该工艺的制备的过程需要经过两步发酵过程：第一步发酵，以D-山梨醇为底物，经醋酸菌Acetobacter sp.发酵，获得L-山梨糖，第二步发酵，以L-山梨糖为底物，经生酮基古龙酸菌Ketogulonigenium vulgare(俗称小菌)和芽孢杆菌Bacillus sp.(俗称大菌)两种微生物混合发酵，获得2-KGA。第一步发酵与第二步发酵联合起来形成了由山梨醇到2-KGA的“二步发酵法”工艺。

“二步发酵法”工艺的主要特点是在“第二步发酵”过程中，由于芽孢杆菌Bacillus sp.(俗称大菌)的伴生，普通生酮基古龙酸菌Ketogulonigeniumvulgare(俗称小菌)的生长和2-KGA的产率得到很大提高，但大菌没有任何产生2-KGA的能力，其主要作用是辅助小菌生长，小菌是2-KGA的产生菌，大菌对小菌生长和产酸的作用机理仍然没有搞清楚。

本发明通过建立高通量的发酵评价技术平台，对可能辅助小菌生长和产酸的营养物质进行了大规模筛选，首先发现了谷胱甘肽促进小菌产酸的活性，并将这一发现共享给天津大学，天津大学做了后续研究，发现了含巯基化合物对小菌的生长刺激作用，并申请了专利(200910069697.7)。随后，发现了原儿茶酸(3，4-二羟基苯甲酸)具有刺激小菌生长产酸的活性.进一步又发现了琥珀酸、L-苹果酸、延胡索酸等化合物，具有明显促进小菌生长和产酸的功能，其促进作用达到或超越了芽孢杆菌的伴生效果。

分析其中的作用机理发现，它们的结构及其在三羧酸循环中的关系，见附图1及附图2。由此推理，这4种四碳酸化合物对小菌生长产酸的促进效果是为小菌提供了碳源营养。

三羧酸循环中四碳酸(包括琥珀酸、延胡索酸、L-苹果酸、草酰乙酸)是生物体内重要的代谢途径“三羧酸循环”连续相邻的4个中间产物，其中：

(1)琥珀酸，又称1，4-丁二酸，分子式C₄H₆O₄，分子量118，白色结晶或结晶粉末，是一种具有广泛用途的有机化工原料，主要用于制备琥珀酸酐、醇酸树脂、油漆、染料、食品调味剂等，医药工业中可用它生产磺胺药、维生素A、维生素B等抗痉挛剂、松痰剂、利尿剂和止血药物，还可用于生产润滑剂和表面活性剂的原料。在生物体内，琥珀酸是三羧酸循环的重要中间产物，经由α-酮戊二酸脱羧、或者异柠檬酸裂解而来，琥珀酸脱氢可形成延胡索酸。

(2)延胡索酸，又称反丁烯二酸、富马酸，分子式C₄H₆O₄，分子量116，无色晶体，用于生产不饱和聚酯树脂、粘合剂、增塑剂等，是精细化学品的中间体，在医药工业中用于解毒药二巯基丁二酸、反丁烯二酸铁的生产，也可作为一种食品添加剂。在生物体内，延胡索酸是三羧酸循环的重要中间产物，它来自琥珀酸的脱氢，经过水合后产生L-苹果酸。

(3)苹果酸，又称2-羟基丁二酸，分子式C₄H₆O₅，分子量134，由于分子中有一个不对称碳原子，有两种立体异构体。自然界中以D-苹果酸、L-苹果酸和DL-苹果酸三种形式存在。最常见的是L-苹果酸，存在于不成熟的的山楂、苹果和葡萄果实的浆汁中，易被人体吸收。L-苹果酸可用于食品添加剂、化妆品、保健品、饲料添加剂等，也可用于治疗肝病、贫血等多种疾病。在生物体内，L-苹果酸是三羧酸循环的重要中间产物，由延胡索酸水合后产生，经脱氢后形成草酰乙酸。

(4)草酰乙酸，又称2-氧代丁二酸，2-羰基丁二酸，分子式C₄H₄O₅，分子量132，是三羧酸循环的一个中间产物。可以在苹果酸脱氢酶的催化下由苹果酸生成，或在丙酮酸羧化酶的作用下，由丙酮酸与CO2生成，另外，也在转氨酶(EC2.6.1.1)的作用下由天冬氨酸生成，目前主要用于化学试剂。

本发明公开之前，没有任何文献报道三羧酸循环中的4种四碳酸化合物或其盐与小菌生长和产酸之间的关联。

发明内容：

本发明目的在于提供三羧酸循环中四碳酸或其盐的新用途，即在制备2-酮基-L-古龙酸中的应用。

实际上，本发明涉及三羧酸循环中四碳酸或其盐在生物法制备2-酮基-L-古龙酸中的应用。

进一步说，上述的四碳酸可为：琥珀酸、延胡索酸、L-苹果酸、草酰乙酸。

本发明还提供了一种用于发酵法制备2-酮-L-古龙酸的培养基，该培养基包括发酵制备2-酮-L-古龙酸采用的常规培养基，其特征在于：该培养基还包括三羧酸循环中的四碳酸或其盐中的至少一种，所述四碳酸或其盐在培养基中出现的方式，包括直接加入、也包括采用强化培养基原料或制品而间接加入的方式。

上述培养基中，三羧酸循环中的四碳酸或其盐的加入量为50mg/L-20000mg/L(即0.005％-2％)，当添加量低于50mg/L时，对小菌必要的生长支撑作用不足，影响产酸，但添加量高于20000mg/L时，超过了小菌的最大需求，增大了发酵液的渗透压，也同样影响小菌的生长和产酸。

上述常规的培养基一般来讲，具体由下列组分构成：底物，氮源、无机盐、维生素、微量元素，固体培养基需要添加2％的琼脂，液体培养基在必要时加入消泡剂；培养基的灭菌采用过滤除菌或者蒸汽灭菌，蒸汽灭菌时需要把氮源、底物和维生素分开灭菌；其中：

底物：可以是D-山梨醇或(和)L-山梨糖，浓度范围从1％到15％，种子培养基中一般不超过5％，发酵培养基中一般不超过10％。

氮源：可以采用尿素、玉米浆、酵母浸出物、牛肉膏、蛋白胨、其它动植物、或微生物来源的含有复合氨基酸制品、其它化学合成来源的氨基酸或复合氨基酸制品；根据培养基设计的总体情况而全部使用或者部分地使用。一般情况下，尿素0.1％-2.0％；玉米浆(酵母浸出物、牛肉膏、蛋白胨、复合氨基酸等其它有机氮源)0.2％-2％。

无机盐：主要包括磷酸盐和硫酸盐，一般可以是磷酸二氢钾和硫酸铵，其用量为磷酸盐0.02％-0.5％，硫酸盐0.02％-0.5％。

维生素：根据培养基设计的总体情况、特别是玉米浆等有机氮源的质量和产地情况有选择性地补充添加维生素，包括VB₁、VB₂、VB₅、VB₆、VB₁₂、维生素PP、生物素、叶酸、硫辛酸。添加量的范围一般从10μg/L-10mg/L。有些维生素是一类化学结构上具有相同的基本结构的系列衍生物，例如：维生素B6可以是吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺的形式，维生素PP可以是烟酸、烟酰胺的形式，VB₁₂的可以是氰钴胺素、腺苷钴胺素、甲基钴胺素、羟基钴胺素的形式，叶酸可以是四氢叶酸、二氢叶酸、亚叶酸的形式。一些富含这些维生素的天然来源的混合物都可以起到与纯品相同或近似功效，如：酵母膏、酵母粉、果蔬汁等。

微量元素：可以根据培养基设计的总体情况而选择性地添加微量元素，包括铁离子、锌离子、锰离子、铜离子、镍离子、钼离子、钴离子，一般以水溶性盐的形式添加，添加范围从1μg/L-10mg/L。

pH调节剂可以选用碳酸钙、氢氧化钠、碳酸钠、氨水等作为培养基配制时的pH调节剂，用量适量即可。

消泡剂可以选用植物油或其它消泡剂，用量适量即可。

所述培养基的配制步骤为：

1、采用常规原料配制出基本培养基，

2、向其中加入营养强化剂；或者，采用含有营养强化剂的培养基制品，例如玉米浆等，间接配制出该强化培养基；

3、培养基的灭菌采用过滤除菌或者蒸汽灭菌，蒸汽灭菌时需要把氮源、底物和维生素分开灭菌。

上述中，营养强化剂的加入是本发明的重点。营养强化剂加入的时机既可以在发酵开始之前，也可以在发酵开始之后以补料方式加入。

此外，本发明还提供了应用四碳酸或其盐制备2-酮基-L-古龙酸的制备方法，该方法包括如下步骤：

a、培养基的制备：以山梨醇或山梨糖为底物，采用常规原料配制培养基，向培养基中加入至少一种三羧酸循环中的四碳酸或其盐；或直接采用含有至少一种三羧酸循环中的四碳酸或其盐的营养强化制品配制培养基；

b、向培养基中接入普通生酮古龙酸杆菌Ketogulonigenium vulgare；

c、经发酵得到2-酮基-L-古龙酸发酵液；

d、将步骤c所得发酵液分离提纯，制得2-酮-L-古龙酸；

对于上述的方法，在接入普通生酮古龙酸菌时，也可以接入包括醋酸杆菌、芽孢杆菌。

为了更好的阐述本发明的实质，下面将通过应用四种四碳酸促进小菌生长的实验及结果与传统“二步发酵法”的对比实验及结果来说明三羧酸循环中的四碳酸或其盐制备2-酮-L-古龙酸的新应用，同样的，各不同的四碳酸之间混合物、不同四碳酸盐之间混合物及四碳酸与四碳酸盐混合物均可达到同样的效果。

实验1：芽孢杆菌伴生对小菌生长和产酸的影响

1、菌种：小菌和大菌

2、固体培养基(质量体积百分数)：山梨糖2％，玉米浆1％，酵母粉1％，尿素1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸铵0.1％，碳酸钙0.3％，微量元素及维生素各1ml/L，琼脂1.8％，pH7.0。

3、种子基础培养基(质量体积百分数)：山梨糖5％，玉米浆1.2％，尿素1.2％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸铵0.1％，碳酸钙0.3％，微量元素及维生素各1ml/L，pH7.0。

4、发酵基础培养基(质量体积百分数)：山梨糖8％，玉米浆1％，尿素1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸铵0.1％，微量元素母液及维生素母液各1ml/L，pH7.0。

5、培养基常规灭菌，121℃，25min，固体培养基灭菌后制成平板。

6、大菌和小菌分别接种在固体培养基上28℃，培养24-36h。

7、将大菌、小菌分别制成菌悬液，各取1ml分别接入基础种子培养基，同时各取1ml混合接入基础种子培养基，三角瓶装液量25ml/250ml，28℃-30℃、摇床转速180-200rpm，培养18-20h

8、将培养好的液体种子，5％接种量将接入对应的发酵培养基中，三角瓶装液量为25ml/250ml，28℃-30℃、摇床转速180-200rpm，培养48-60h，发酵过程检测残糖、2-KGA含量，pH值，并镜检菌体形态

9、2-KGA检测方法：取2ml发酵液放入试管中，加入7mol/LH₂SO₄溶液2ml，摇匀后，沸水浴25mi n，自来水迅速冷却，分次加入蒸馏水并转移到250ml三角瓶中，蒸馏水总体积共25ml，加入1％的可溶性淀粉2ml，摇匀后用0.05mol/L碘液滴定到蓝色30s不退色为终点，记录所用碘液的体积数。配制不同浓度的标准2-酮基-L-古龙酸溶液，重复上述过程，获得标准曲线，由标准曲线可以计算出发酵液样品的2-KGA的含量(mg/mL)。

10、山梨糖测定：采用还原糖的测定方法-DNS法

11.发酵50h测定结果见表1

表1大菌、小菌及混合菌的菌体生长及产2-KGA的情况

菌株        残糖％    2-KGA mg/ml  转化率％  pH     镜检形态

小菌        5.8       31.1         38.8      8.5    菌体膨大，菌体少

大菌        7.9       0.0          0         8.6    芽孢形成

大小混合菌  0.2％     71.2         89.0      5.6    芽孢形成、小菌形态正

                                                    常，小菌数量较多

由表1的结果可知，小菌独立生长时菌体少，形态膨大异常，菌体数量少，产酸转化率达到38.8％，大菌本身不产酸，转化率为0，而混合菌的转化率高达89.0％，镜检小菌形态正常，菌体数量较大，说明大菌促进了小菌的生长和产酸。

实验2：琥珀酸、延胡索酸、L-苹果酸、草酰乙酸对小菌生长和产酸的影响

1、菌种：小菌和大菌

2、固体培养基：同实验1

3、种子基础培养基配方：同实验1

4、发酵基础培养基配方：同实验1

5、强化种子培养基(质量体积百分数)：种子基础培养基配方分别添加0.1％琥珀酸、0.1％的延胡索酸、0.1％的L-苹果酸，0.1％草酰乙酸形成四种强化种子培养基，三角瓶装液量25ml/250ml。

6、强化发酵培养基(质量体积百分数)：发酵基础培养基分别添加0.1％的琥珀酸、0.1％的延胡索酸、0.1％的L-苹果酸，0.1％草酰乙酸形成四种强化发酵培养基，三角瓶装液量25ml/250ml。

7、培养基常规灭菌，121℃，25min，固体培养基灭菌后制成平板。

8、大菌和小菌分别接种在固体培养基上28℃，培养24-36h。

9、将培养好小菌制成菌悬液，各取1ml分别接入基础种子培养基和四种强化种子培养基中，将大菌制成菌悬液1ml与小菌1ml混合接入基础种子培养基。

10、28℃-30℃、摇床转速180-200rpm，培养18-20h

11、将培养的液体种子，5％接种量分别接入对应的发酵培养基中，三角瓶装液量为25ml/250ml，28℃-30℃、摇床转速180-200rpm，培养48-60h

12、2-KGA检测方法：同实验1

13.结果见表2

表2四碳酸化合物对小菌的生长和产酸的影响

  菌株  小菌  大小混合菌  小菌  小菌  小菌  小菌  特征  无  无  加入琥珀酸  加入延胡索酸  加入L-苹果酸  加入草酰乙酸  2-KGA(mg/ml)30.469.574.267.562.145.9  形态  异常  正常  正常  正常  正常  正常

由表2的结果看出在培养基中加入四碳酸化合物可以明显看出促进小菌产酸，其中琥珀酸的作用最强，超越了芽孢杆菌的作用，其它三种酸也具有一定的促进效果，镜检表明，菌体形态正常，菌体数量多，说明产酸的增加与菌体浓度的增加密切相关。

上述结果说明，三羧酸循环中的四碳酸或其盐在制备2-酮基-L-古龙酸中的应用中，具有突出的作用及功效，通过向培养基中添加这些有机酸或者其羧酸盐，为小菌提供了碳源营养，对小菌生长产酸的促进效果明显，使小菌脱离对伴生菌的依赖、建立独立生长并高效产生2-KGA。

且本发明可以改善“二步发酵法”工艺，同时还可建立新的“一步发酵法”工艺、建立新的细胞转化法制备2-KGA工艺，其具备很高的应用潜力，如：将提高2-KGA的产量、缩短周期，从而提高生产效能、降低制造成本；如：通过放弃伴生菌，将降低原料消耗、节约资源、减少污染物排放。特别是，这些系列新工艺发明的多数部分是对原有工艺环节的缩减。

附图说明

下面结合附图及具体实施方式对本发明作更进一步详细说明：

图1是生物体内的重要代谢途径-三羧酸循环图；

图2是在基础培养基上发酵制备2-KGA的大菌和小菌混合培养菌体形态图(10×100倍)；

图3是在基础培养基上发酵制备2-KGA的小菌单独生长时的菌体形态图(10×100倍)；

图4是在基础培养基上添加琥珀酸后小菌单独生长时菌体形态图(10×100倍)。

具体实施方式

由图1所示可知，琥珀酸、延胡索酸、L-苹果酸、草酰乙酸都是生物体内重要的代谢途径“三羧酸循环”连续相邻的4个中间产物。由图2所示，结合实验1可知，在传统的基础培养基上发酵制备2-KGA过程中，大菌和小菌混合培养，小菌形态正常，菌体数量较大，说明了大菌促进了小菌的生长和产酸。由图3所示，结合实验1可知，小菌单独生长时菌体少，形态膨大异常，菌体数量少。由图4所示，结合实验2可知，在加入琥珀酸的培养基上，小菌形态正常，菌体数量多，说明了产酸的增加与菌体浓度的增加密切相关。

为了更好地阐明四碳酸或其盐在制备2-酮基-L-古龙酸中的应用，下面将描述本发明的四个实施例，但本发明的内容完全不局限于此。

实施例一：含琥珀酸的营养强化玉米浆制品的制备(培养基的制备)

步骤一：选用质量稳定的玉米浸泡水，其干物质含量不低于9％，加入无机絮凝剂，加热至65℃-85℃过滤，

步骤二：采用琥珀酸酸化滤液，使琥珀酸含量达到浸泡水干物质的5％(w/w)，

步骤三：真空浓缩至干物质达到40％，得到浓缩浆，

步骤四：向浓缩浆中再次补加琥珀酸，得到琥珀酸含量为10％(质量体积百分数)的强化浆。该浆在2-KGA发酵时，使用量为1％(以折干物质计)，培养基中的琥珀酸达到0.1％。

本实施例将玉米浆净化与使用三羧酸循环中的四碳酸强化结合在一起，利用四碳二羧酸的阻垢能力，解决了净化之后的设备结垢问题，可以降低蒸发温度，保护玉米浆中的维生素等生长因子，所制备的强化浆杂质少、杂菌少、储存期长，可以商业化。

此外，除琥珀酸外的其他四碳酸或其盐制备培养基的方法同上，在此不再重复阐述。

实施例二：琥珀酸钠对“二步发酵法”工艺的改善，菌种采用大菌和小菌

由实验2结果表明四种化合物中，琥珀酸对小菌生长和产酸的促进作用最为明显，因此以它为代表应用到发酵生产2-KGA的过程中。由于“二步发酵法”工艺的第一步从山梨醇到山梨糖的工艺已经十分成熟，所以，只从山梨糖到2-KGA的第二步发酵的试验来说明“二步发酵法”工艺的改善

步骤一：培养基的制备，采用常规的培养基制备方法，以山梨糖为底物制备：

1、固体培养基(质量体积百分数)：山梨糖2％，玉米浆1％，酵母粉1％，尿素1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸铵0.1％，琥珀酸钠0.1％，琼脂1.8％，pH7.0。

2、种子培养基(质量体积百分数)：山梨糖5％，玉米浆1.2％，尿素1.2％，琥珀酸钠0.15％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸铵0.1％，碳酸钙0.3％，微量元素及维生素各1ml/L，pH7.0。

3、发酵培养基配方(质量体积百分数)：山梨糖8％，玉米浆1％，尿素1％，琥珀酸钠0.15％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸铵0.1％，碳酸钙0.3％，微量元素及维生素各1ml/L，pH7.0。

步骤二：培养基常规灭菌，121℃，25min，固体培养基灭菌后制成平板。

步骤三：10升发酵罐，蒸汽空消30min，液体培养基，121℃灭菌25min，山梨糖、尿素与其他培养基成分分开灭菌。

步骤四：大菌和小菌分别接种在固体培养基上28℃，培养36h。

步骤五：固体培养基生长的大菌、小菌分别制成菌悬液，各取5ml混合接入种子培养基，装液量75ml/500ml，28℃-30℃、摇床转速180-200rpm，培养18-20h

步骤六：液体种子，5％接种量接入10L发酵罐，28℃-30℃，250-300rpm，氢氧化钠自动调节pH7.2，培养48h。

分离提纯：发酵液加入絮凝剂、加温到50℃、过滤，滤液经阳离子树脂进行离子交换，除去金属离子及铵离子，将2-KGA盐转化为2-KGA酸，活性炭脱色，真空旋转浓缩，结晶，获得2-KGA粗晶体，经重结晶获得纯品。

检测：2-KGA检测方法：同实验1

结果表明：琥珀酸钠的加入可以提高小菌的产酸速率，缩短发酵周期，最终2-KGA效价达到74.5mg/ml。

实施例三：采用琥珀酸钠建立从山梨糖到2-KGA的“纯种发酵新工艺”，菌种采用小菌

步骤一、培养基的制备，同实施例二。

步骤二、培养基常规灭菌，同实施例二。

步骤三、10升发酵罐，蒸汽空消30min，液体培养基，121℃，实消灭菌25min，山梨糖、尿素与其他培养基成分分开灭菌。

步骤四、固体培养基生长好的小菌，制成菌悬液，取5ml接入种子培养基，装液量75ml/500ml，28℃-30℃、摇床转速180-200rpm，培养18-20h，制成液体种子。

步骤五、液体种子，5％接种量接入10L发酵罐，28℃-30℃，250-300rpm，氢氧化钠自动调节pH7.2，培养48h。

步骤六：分离提纯，同实施例二。

检测：2-KGA检测方法：同实验1

结果表明：在没有芽孢杆菌伴生的条件下，琥珀酸钠同样可以极大提高小菌的产酸速率，缩短发酵周期，实现了小菌的独立培养，最终2-KGA效价达到75.2mg/ml，构建出新的从山梨糖到2-KGA的“纯种发酵新工艺”。

该工艺的特点是：二步发酵的第二步不再采用芽孢杆菌伴生，而采用琥珀酸钠等本发明公开的三羧酸循环中的四碳酸作为小菌生长的强化剂，变混合发酵为纯种发酵，不仅可以提高发酵水平，还可以避免了芽孢杆菌对营养的消耗、避免了芽孢释放和细胞自溶产生的杂质，降低产物分离难度。

实施例四：采用琥珀酸钠建立从山梨醇到2-KGA的“单菌一步发酵”新工艺，菌种采用冷冻管保藏的小菌

步骤一：培养基的制备——采用常规方法制备培养基

1、固体培养基(质量体积百分数)：山梨醇2％，玉米浆1％，酵母粉1％，尿素1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸铵0.1％，琥珀酸钠0.1％，琼脂1.8％，pH7.0。

2、种子培养基(质量体积百分数)：山梨醇5％，玉米浆1.2％，尿素1.2％，琥珀酸钠0.15％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸铵0.1％，碳酸钙0.3％，微量元素及维生素各1ml/L，pH7.0。

3、发酵培养基(质量体积百分数)：山梨醇8％，玉米浆1％，尿素1％，琥珀酸钠0.15％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸铵0.1％，碳酸钙0.3％，微量元素及维生素各1ml/L，pH7.0。

步骤二、培养基常规灭菌，121℃，25min，固体培养基灭菌后制成平板。

步骤三、pH自控摇瓶(500ml)，液体培养基121℃灭菌25min，山梨糖、尿素与其他培养基成分分开灭菌。

步骤四、平皿种子制备：冷冻管保藏的小菌接种在固体培养基上28℃，培养36h。

步骤五、摇瓶种子制备：取固体培养基生长的小菌制成菌悬液1ml接入种子培养基，装液量25ml/250ml，28℃-30℃、摇床转速180-200rpm，培养18-20h。

步骤六、自控摇瓶发酵：5％接种量接入500ml pH自控摇瓶，28℃-30℃，200rpm，氢氧化钠自动调节pH7.2，培养64h。

步骤七：分离提纯，同实施例二。

检测：2-KGA检测方法：同实验1

结果表明：2-KGA效价达到45.2mg/ml。利用琥珀酸钠，实现了从山梨醇到2-KGA的“单菌一步发酵”新工艺。

实施例五：采用琥珀酸钠建立从山梨醇到2-KGA的“双菌一步发酵”新工艺，菌种采用冷冻管保藏的小菌，冷冻管保藏的醋酸菌Acetobacter melanogenumAs1.114

步骤一、培养基制备——采用常规方法制备：

1、固体培养基(质量体积百分数)：山梨醇2％，玉米浆1％，酵母粉1％，尿素1％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸铵0.1％，琥珀酸钠0.1％，琼脂1.8％，pH7.0。

2、种子培养基(质量体积百分数)：山梨醇5％，玉米浆1.2％，尿素1.2％，琥珀酸钠0.15％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸铵0.1％，碳酸钙0.3％，微量元素及维生素各1ml/L，pH7.0。

3、发酵培养基(质量体积百分数)：山梨醇8％，玉米浆1％，尿素1％，琥珀酸钠0.15％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸铵0.1％，碳酸钙0.3％，微量元素及维生素各1ml/L，pH7.0。

步骤二、培养基常规灭菌，121℃，25min，固体培养基灭菌后制成平板。

步骤三、pH自控摇瓶(500ml)，液体培养基121℃灭菌25min，山梨糖、尿素与其他培养基成分分开灭菌。

步骤四、平皿种子制备：冷冻管保藏的小菌及醋酸菌分别接种在固体培养基上28℃，培养36h。

步骤五、摇瓶种子制备：分别取固体培养基上的小菌及醋酸菌，各制成菌悬液1ml，混合接入种子培养基，装液量25ml/250ml，30℃，摇床转速200rpm，培养18-20h。

步骤六、自控摇瓶发酵：按5％接种量，将混合培养的摇瓶种子接入500mlpH自控摇瓶，30℃，200rpm，氢氧化钠自动调节pH7.2，培养60h。

步骤七：分离提纯，同实施例二。

检测：2-KGA检测方法：同实验1

结果表明：2-KGA效价达到70.6mg/ml。利用琥珀酸，经小菌和醋酸菌的混合发酵，实现了从山梨醇到2-KGA的“双菌一步发酵”新工艺。

比较实施例三和实施例四，可以看出，单独采用小菌就可以完成由山梨醇到2-KGA发酵的一步发酵，但是，其转化效率有些低，借助醋酸菌的协助，在混合发酵模式下，一步发酵的效率得到提升，达到了“二步发酵法”的产酸水平，但工艺更加简单。