通过重组瑞氏木霉以诱导型方式高效表达和生产T4溶菌酶的方法

摘要

本发明公开了一种在瑞氏木霉中以诱导型方式表达和生产T4溶菌酶重组蛋白的方法，其中包括：1)使用密码子得到优化、人工合成的T4溶菌酶基因以提高其在瑞氏木霉工程菌中的生物产量；2)采用瑞氏木霉来源的纤维二糖水解酶基因启动子或终止子序列作为外源质粒载体整合到瑞氏木霉基因组中的同源序列；3)采用瑞氏木霉纤维二糖水解酶基因启动子调控T4溶菌酶外源基因在瑞氏木霉中以诱导型方式高效表达；4)特定的瑞氏木霉工程菌发酵培养生长条件以提高T4溶菌酶重组蛋白的生物产量以及快速提纯该重组外源蛋白的方法，而由此方法制备的T4溶菌酶重组蛋白纯品具有生物活性，可广泛应用于医疗、食品、饲料以及科研等领域。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种在瑞氏木霉中以诱导型方式表达和生产T4溶菌酶重组蛋白的方法。

背景技术

溶菌酶(Lysozyme，EC3.2.17)是指一类广泛存在于自然界中且对多种革兰氏阳性和阴性病原细菌、真菌以及某些病毒具有杀灭或抑制作用的水解酶类，1922年由英国细菌学家Fleming首次发现。该水解酶的主要杀菌方式是破坏细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4糖苷键，造成胞壁破裂和内溶物渗出，由此导致细菌崩溃和死亡，因此，溶菌酶又被称为N-乙酰胞壁酸酶。在自然界中，溶菌酶的来源是十分广泛的，大致可分为动物、植物和微生物来源的溶菌酶等几类。动物来源的溶菌酶一般存在于人和哺乳动物的多种组织和分泌物中，如存在于眼泪、唾液、肝、肾、淋巴组织以及蛋清中等。木瓜、芜菁和萝卜等植物中也能分离到溶菌酶，它们被认为在生物肌体的第一道防御屏障中起重要作用。

目前已在多种微生物体内发现溶菌酶的存在，如球孢链霉菌、丙酮丁酸梭菌以及多种噬菌体等。T4溶菌酶来源于侵染大肠杆菌的T4噬菌体，由T4噬菌体gpe基因所编码(Arisaka F，et al.，2003)，基因全长495个碱基，编码164个氨基酸，分子量18700Da。当噬菌体颗粒在宿主细胞内包装完成后，在T4溶菌酶的作用下导致宿主-大肠杆菌细胞裂解。迄今为止，T4溶菌酶已经有30多年的研究历史，该酶及其多种突变体的晶体结构已经得到解析。T4溶菌酶由两个结构域所组成：位于N端的α/β结构域和位于C端的α螺旋结构域。研究发现，T4溶菌酶的杀菌作用主要表现在两个方面：一是该酶具有N-乙酰胞壁酸酶活性，二是位于该酶C端带正电荷的α螺旋域能够与细菌或真菌带负电荷的细胞膜结合，从而干扰宿主细胞正常的生理代谢。位于T4溶菌酶C端的α螺旋结构域主要有4个，分别是α1(115-122)、α2(126-134)、α3(137-141)和α4(143-155)。人工合成的α2-α3和α4短肽没有N-乙酰胞壁酸酶活性，但仍表现抗细菌或真菌的生物活性。同样将T4溶菌酶加热变性后，发现其N-乙酰胞壁酸酶生物活性虽然丧失，但仍保留较强的杀菌能力。研究显示，对T4溶菌酶进行结构改造和修饰能够提高其杀菌活性和热稳定性，例如蛋白N端带有6组氨酸标签结构(6xHis-Tag)的T4溶菌酶的杀菌活性为天然T4溶菌酶的2倍；此外，若将N端第6位氨基酸由疏水的甲硫氨酸M变成带正电的赖氨酸K后，抗菌活性可提高4倍，但蛋白分子的稳定性下降，推测其杀菌活性提高的原因可能是由于C端自由度增强，从而使α螺旋结构域能更有效地与细胞膜靶标结合。

T4溶菌酶除了能够杀灭多种病原细菌外，对某些病原真菌也具有抑制作用。T4溶菌酶虽然不能穿过真菌分生孢子的细胞膜，但经该酶处理后的真菌分生孢子不再膨大和发芽。T4溶菌酶对土豆原生质体外膜也具有一定的破坏作用，但研究证实对人和哺乳动物的细胞无毒害作用，因此，T4溶菌酶在医药、食品和饲料等工业领域都具有极大的应用潜力。

从T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞中提取T4溶菌酶，生产工艺不仅繁琐、产量低，而且难以工业化。近几年来，随着分子生物学和基因重组技术的迅猛发展，构建基因工程菌株如酵母和大肠杆菌等表达和生产外源重组蛋白的方法越来越受到科技工作者和工业领域专家的青睐，而丝状真菌作为外源蛋白表达的新宿主则同样具有许多优点，如：1)外源蛋白基因也能够整合到丝状真菌基因组中而可获得稳定遗传的转化子；2)受诱导物紧密调控的强启动子能够启动下游外源蛋白基因的高效表达，且能够将重组外源蛋白分泌到胞外，从而有利于后期的纯化工作；3)作为真核表达系统能够对外源重组蛋白进行翻译后加工和修饰，包括二硫键的生成和糖基化等；4)菌体和其代谢产物对人体和哺乳动物无毒副作用等；5)工业发酵技术成熟，方便重组外源蛋白的工业化生产等。

本发明中所使用的瑞氏木霉(Trichoderma reesei)是一种无害的腐生性丝状真菌，工业上常应用于纤维二糖水解酶的生产，其产量最高可达40g/L(姜天一等，2007)。纤维素酶系中的1，4-β-纤维二糖水解酶1(1，4-beta-D-glucan cellobiohydrolase)基因CBH1的启动子是一个极强的诱导型启动子，该启动子可被乳糖、麦秸粉和纤维素等底物诱导，但能够被葡萄糖所阻遏。同时，它也可作为外源基因整合到木霉基因组上的同源核苷酸序列。瑞氏木霉的转化方法主要有电融合法和原生质体转化法等，重组子的筛选主要是通过采用抗生素抗性作为选择标志基因，最常用的是潮霉素以及G418抗性基因。

瑞氏木霉作为一种新的外源蛋白基因表达系统其操作技术还不够成熟，目前仅有零星成功的报道(见表1)。

表1瑞氏木霉表达的外源重组蛋白

  名称>  来源>  分子量  (kDa)>  启动  子>  宿主>  表达量>  参考文献>  乙烯合  成酶>  Pseudomonas syringae  pv.glycinea  40>  Cbh1>  T.viride>   Li Tao et  al.，2008>  木聚糖  酶>  Acrophialophora  nainiana  19>  Cbh1>  T.reesei>  172mg/L>  Bruno C，et  al.，2007>  酯酶>  Melanocarpus albomyces  74>  Cbh1>  T.reesei>   Hanna K.，et  al.，2005>  抗真菌  蛋白>  Aspergillus giganteus  MDH18894  6>  Cbh1>  T.viride>   徐军等，2003>  大麦内  肽酶B>  大麦>  30>  Cbh1>  T.reesei>  500mg/L>  Ritva S.，et  al.，1997>

在本发明之前，还没有采用密码子得到优化、人工合成的T4溶菌酶基因在瑞氏木霉中以诱导型方式表达该外源蛋白的报道，还没有人使用瑞氏木霉纤维二糖水解酶1基因CBH1的启动子作为同源序列将T4溶菌酶基因整合到瑞氏木霉基因组中的报道，更没有人在瑞氏木霉中进行T4溶菌酶重组蛋白的高密度发酵生产。

发明内容

本发明的第一个目的是要提供一种密码子得到优化、人工合成的T4溶菌酶基因，其能够在瑞氏木霉中得到稳定和高效表达。

本发明的第二个目的是使用一个同源核苷酸整合序列，使携带有T4溶菌酶外源基因以及筛选标记等重要表达元件的质粒载体能够被整合到瑞氏木霉基因组中，并得到稳定遗传的重组瑞氏木霉工程菌株。

本发明的第三个目的是要提供一种在瑞氏木霉纤维二糖水解酶1基因启动子启动下稳定地高效表达T4溶菌酶基因的瑞氏木霉重组菌。

本发明的第四个目的是提供最适的重组瑞氏木霉生长和表达条件以及目标蛋白快速的纯化方法。

为达到上述目的，本发明首先提供一种编码T4溶菌酶蛋白的基因，其是按照瑞氏木霉偏爱的密码子优化过的、编码或至少部分编码T4溶菌酶蛋白的基因。其中所述的T4溶菌酶蛋白一级结构为SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列。根据一个优选的实施方案，所述基因具有或至少部分具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

然后所述基因被置于瑞氏木霉纤维二糖水解酶1基因启动子操纵之下，整合到瑞氏木霉基因组中，随着重组木霉菌体的生长，T4溶菌酶基因能够以诱导型方式得到稳定地高效表达。

根据一个优选的实施方案，瑞氏木霉的纤维二糖水解酶1基因的启动子和终止子DNA序列被先后克隆出来并被插入到一个新的T4溶菌酶木霉表达质粒载体中，借助该启动子或终止子DNA序列与瑞氏木霉基因组之间发生的同源重组，可将受瑞氏木霉纤维二糖水解酶1基因启动子调控的T4溶菌酶基因及其它重要的表达元件同时整合到瑞氏木霉基因组中，而得到重组瑞氏木霉工程菌株，其在纤维素的诱导下能够稳定和高效地表达T4溶菌酶重组蛋白，并最终将其分泌到胞外。

具体的，首先是编码T4溶菌酶的基因被按照瑞氏木霉所偏爱的密码子完全人工合成出来，然后通过PCR扩增技术，在其5’端上游区域添加瑞氏木霉纤维二糖水解酶1分泌信号肽的核苷酸编码序列以及瑞氏木霉纤维二糖水解酶1基因的启动子，在其3’端下游区域添加瑞氏木霉纤维二糖水解酶1基因的终止子序列，由此形成一个新的外源基因读码框。按照一个优选的实施方案，T4溶菌酶基因首先被置于一个诱导型启动子调控之下，然后被插入到一个瑞氏木霉表达质粒载体上。在该表达质粒载体上，该诱导型启动子位于纤维二糖水解酶1分泌信号肽核苷酸编码序列与T4溶菌酶核苷酸编码序列所形成的融合基因的上游，它操纵所谓的融合蛋白基因在瑞氏木霉中的稳定和高效地表达。同时，该启动子核苷酸序列在表达质粒载体整合到瑞氏木霉基因组的过程中还起到了同源重组序列的作用。在该表达质粒载体经完全线性化处理后，可通过电融合法或原生质体等方法被导入到瑞氏木霉细胞中，进而通过同源重组稳定整合到瑞氏木霉染色体基因组上，此重组瑞氏木霉在发酵培养过程中表达的T4溶菌酶重组蛋白在纤维二糖水解酶1分泌信号肽的引导下得以分泌到胞外的培养基中。

本发明所指的重组蛋白可以是T4溶菌酶蛋白的全部，然而，在某些具体实施方案中，所表达的外源基因也可能只是该天然蛋白的一部分。有时，T4溶菌酶重组蛋白可与另外一个具有不同生物学功能的蛋白基因以独立或融合方式同时在一个木霉细胞内表达，其目的是为了方便提纯或提高其生物活性。蛋白的融合可以通过蛋白翻译后加工、共价结合的方式，或者通过DNA重组技术使基因在翻译表达前就相互拼接在一起，而这两种技术是本领域技术人员早已熟知的技术。

这样，本发明较优选的实施方案是：1)按照瑞氏木霉所偏爱的密码子，进行T4溶菌酶基因的人工合成；2)瑞氏木霉纤维二糖水解酶1基因启动子及纤维二糖水解酶1分泌信号肽核苷酸编码序列的克隆；3)纤维二糖水解酶1基因终止子DNA的克隆；4)构建一个质粒表达载体，其中含有编码T4溶菌酶重组蛋白的基因或其衍生物的基因(包括基因密码子被优化、改变或与其它基因相融合等)，该基因首先与瑞氏木霉纤维二糖水解酶1分泌信号肽核苷酸编码序列相互拼接形成融合基因，然后被置于瑞氏木霉纤维二糖水解酶1基因启动子控制之下，在该融合基因下游添加有纤维二糖水解酶1终止子DNA序列，同时质粒表达载体中还包含有用于外源基因整合到瑞氏木霉基因组的同源重组序列，该序列可以是瑞氏木霉纤维二糖水解酶1基因启动子或其他同源序列；5)通过电融合法或其他方法，将上述线性化后的质粒表达载体DNA转化瑞氏木霉原生质体中，并将转化后的瑞氏木霉原生质体涂布于含有0.5mg/mL G418的HM固体平板培养基上生长，能够在此培养基上生长的木霉单菌落就是含有外源基因的木霉重组子。

更进一步，本发明提供了有关重组重组瑞氏木霉最适的生长培养条件和外源蛋白表达条件，如培养基的成分、接种量、pH值、溶氧量和培养时间等，由此使该重组木霉工程菌的生长量和重组蛋白的分泌量都尽可能地达到最大化。通过离心除菌、中空纤维过滤、离子交换层析等操作从发酵液中可得到高纯度的T4溶菌酶重组蛋白，为以后该酶的工业化生产、低成本发酵和快速纯化奠定基础。具体包括以下三个阶段：1)菌体培养阶段，以10％的接种量接种瑞氏木霉工程菌后，经过72小时的培养，木霉菌体湿重将达到35～40g/L左右；2)诱导表达阶段，加入纤维素，诱导木霉细胞高效表达T4溶菌酶重组蛋白并将其分泌到培养基中，维持一定的pH值和溶氧量；3)蛋白纯化，发酵液经过离心和三次不同规格的滤膜过滤处理，在经过一次离子交换层析，T4溶菌酶蛋白的纯度可达99％以上。

最优选的，采用本发明的工程菌株发酵生产重组蛋白的方法包括：(1)种子液制备：首先将菌丝接种于PDA培养基上，27～28℃培养6～7天，再将孢子溶于无菌水中，以1～2％体积比接种于液体MM培养基中，27～28℃振荡培养(375～380转/分)72～96小时；以其作为高密度发酵的种子液；

(2)菌体培养：在发酵罐中盛放适量MM基础发酵培养基，按8～10％的体积比接种步骤(1)的木霉种子液，27～28℃通气搅拌(转速自始至终维持在375～380转/分)培养72～96小时左右，pH维持在5.5～6左右；

(3)蛋白诱导表达：在接种后的第4～6天，往上述培养基中流加溶解在MM培养基中50wt％的纤维素，使培养基纤维素浓度维持在2～3wt％左右，溶氧量大于20％，温度维持在27～28℃，pH维持在5.5～6左右，在这种条件下继续振荡(转速自始至终维持在375～380转/分)诱导培养3～4天。

在上述过程中用到的MM培养基配方为：每升含：葡萄糖20g、(NH₄)₂SO₄ 5g、KH₂PO₄ 15g、MgSO₄·7H₂O 0.6g、CaCl₂ 0.6g、FeSO₄·7H₂O 0.005g、MnSO₄·H₂O 0.0016g、ZnSO₄·7H₂O 0.0014g、CoCl₂0.002g，pH 5.5。

发酵产品中T4溶菌酶重组蛋白的纯度直接关系到该重组蛋白的应用范围及所生产相关产品成本的高低，按照一个优先的实施方案，为了快速纯化大量的T4溶菌酶重组蛋白，可以首先将瑞氏木霉发酵液上清液使用不同截流分子量的过滤装置以及离子交换层析等进行预处理，在纯化过程中的每一个环节，都可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，通过上述方法可获得纯度达到99％的重组蛋白。

本发明在详细介绍瑞氏木霉表达系统时仅提到了瑞氏木霉菌株QM9414，然而，正如本领域技术人员所早已熟知的木霉表达系统那样，许多种木霉表达系统都可以利用本发明所提供的方法进行遗传转化、表达和生产。因此，所有这些木霉表达系统都应包括在本发明的权利要求范围之内。

就像下面实例中所要详细描述的那样，本发明描述的瑞氏木霉转化方法中所用的质粒载体是一个整合型的质粒表达系统，按照一个优先的实施方案，本发明所使用的质粒表达载体是一个得到改造后的pPIC9K，其原先的AOX1诱导型启动子被瑞氏木霉纤维二糖水解酶1基因诱导型启动子所取代，同时质粒表达载体中还包含有用于外源基因整合到酵母基因组的同源重组序列，该序列可以是瑞氏木霉纤维二糖水解酶1基因诱导型启动子、终止子序列或其它同源序列。

本发明极大地提高了T4溶菌酶重组蛋白在瑞氏木霉细胞中生物产量的方法，该重组蛋白已知在天然状态下具有很强的抑菌或杀菌作用；或更确切地说，本发明所指的T4溶菌酶重组蛋白与源自T4噬菌体gp e基因所编码的蛋白或其它常规表达系统生产的该重组蛋白相类似，作为抑菌或杀菌剂可以广泛地应用到医疗、食品、饲料和科研等领域。采用本发明所述的方法，可有效地将密码子优化的T4溶菌酶基因通过瑞氏木霉纤维二糖水解酶1基因启动子或终止子序列以同源重组的方式整合到瑞氏木霉基因组中，获得的瑞氏木霉工程菌株能够以诱导型方式式稳定和高效地表达T4溶菌酶重组蛋白，同时提供了该重组蛋白的发酵和纯化工艺，适用于规模化生产T4溶菌酶重组蛋白。

附图说明

图1为T4溶菌酶基因密码子优化和改造前后对比，N代表密码子优化和改造前的基因序列；M代表密码子优化和改造后的基因序列，两序列间有纵线的表示核苷酸碱基未发生改变；

图2为诱导型木霉高效表达载体T4-CBH9K的构建过程；

图3为木霉转化重组子的PCR扩增鉴定：1为DNA标准分子量；2～9为9个木霉转化子的T4溶菌酶基因扩增结果；CK+为T4溶菌酶基因阳性对照；CK-为T4溶菌酶基因阴性对照；

图4为SDS-PAGE电泳检测T4溶菌酶重组蛋白表达情况：M为标准分子量蛋白(Blue Plus Protein marker 12～94KDa，北京TransGenBiotech公司产品)；CK-为阴性对照，CBH9K转化的(不含T4溶菌酶基因)重组木霉菌株诱导培养120小时发酵液上清；1为TR-T4诱导前培养72小时的发酵上清液；2～4分别为TR-T4诱导培养24、48及72小时后的发酵上清液；

图5为重组T4溶菌酶活性测定：横坐标为不同稀释浓度的重组T4溶菌酶纯品(单位为mg/mL)，纵坐标为OD350nm光吸收值，T4lysozyme为自木霉工程菌TR-T4发酵液中制备的T4溶菌酶纯品的活性测定结果，CK-为CBK9K(空载体)转化木霉菌发酵上清液提取物不同稀释浓度的活性测定结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：密码子优化后的T4溶菌酶基因的人工合成

T4溶菌酶基因来源于T4噬菌体，其密码子与原核生物较接近，而瑞氏木霉属于真核生物，因此它们在基因密码子偏好方面存在着一定的差异，而这种差异很可能会影响到T4溶菌酶基因及其转录产物在瑞氏木霉细胞中的稳定性和表达效率。为提高T4溶菌酶重组蛋白的生物产量，根据业已公布的T4溶菌酶基因的DNA核苷酸序列和氨基酸序列(GenBank：NY000866)，在不改变其氨基酸序列的前提下(见SEQ ID NO.1)，按照瑞氏木霉所偏爱的密码子(见CodonUsageDatabase：Hypocrea jecorina)，人工设计和合成了新的T4溶菌酶成熟蛋白的DNA编码序列。密码子优化后的T4溶菌酶成熟蛋白基因与改造前相比，改变了其中的159个核苷酸碱基，总共涉及到53个密码子，而G+C的含量由原来的36.6％变为58.8％(见SEQID NO.2)。基因改造前后对比见附图1(上述基因拼接和合成工作由上海博亚生物技术公司代为完成)。

实施例2：瑞氏木霉纤维二糖水解酶1基因启动子-分泌信号肽和终止子核苷酸序列的克隆

1、瑞氏木霉基因组的提取

将瑞氏木霉菌株QM9414(该菌株来自中国农业大学)接种在MM[每升含葡萄糖20g、(NH₄)₂SO₄ 5g、KH₂PO₄ 15g、MgSO₄·7H₂O0.6g、CaCl₂ 0.6g、FeSO₄·7H₂O 0.005g、MnSO₄·H₂O 0.0016g、ZnSO₄·7H₂O 0.0014g、CoCl₂ 0.002g、2％(w/v)琼脂粉，pH 5.5]固体培养基上，28℃培养4～5天，从平板上挑取少量菌丝体转移到离心管中，用生理盐水洗2次，再加入少量玻璃珠和500μlL STES缓冲液[200mM Tris·HCl(pH8.5)，250mM NaCl，25mM EDTA，2％SDS]，在涡旋振荡器上振荡3×40s后，65℃反应10min，冰浴5min。再加入200μL 10M乙酸铵冰浴5min后，12000rpm离心10min。取上清，加入200μL 10M乙酸铵再次冰浴5min，12000rpm离心10min。将上清液用异丙醇-20℃沉淀20min。12000rpm离心10min，沉淀用70％乙醇洗涤两次，烘干，用10μL水溶解，加入适量RNase A，37℃反应30min后，-20℃备用。

2、瑞氏木霉纤维二糖水解酶1基因启动子-信号肽和终止子核苷酸序列的克隆

根据已知的瑞氏木霉纤维二糖水解酶基因启动子-分泌信号肽(GenBank：D86235和E00389)和终止子序列(GenBank：E00389)，分别设计了primer1、primer2、primer3和primer4 4个引物，其中引物Primer1序列为(见SEQ ID NO.3)：5′-ACAATTCTGGAGACGGCTTGTTGA ATC-3′，Primer2为(见SEQ ID NO.4)：5′-CTCGAAGATGTTCATAGCACGAGCTGTGGCCAAGAAGGC-3′，Primer3为(见SEQ ID NO.5)：5′-TACAAGAACTTGTAAAGGTCACCTTCTCCAACATCAAGTTCG-3′，Primer4为(见SEQ ID NO.6)：5′-ACCACGAAGAGCGGCGATTCTACGGG-3′。引物中下划波浪线部分表示限制性内切酶酶切位点，下划横线部分是与人工合成的T4溶菌酶基因两末端前15个核苷酸碱基序列分别呈碱基互补的部分。以Primer1和Primer2为引物，以瑞氏木霉菌株QM9414基因组DNA为模板，经PCR扩增，扩增得到瑞氏木霉纤维二糖水解酶1基因启动子-分泌信号肽核苷酸编码序列(Pcbh1-sig)(注：纤维二糖水解酶1分泌信号肽长度为17氨基酸残基，由51个核苷酸碱基所编码)，为方便后续表达载体的构建，在Primer1中，添加了Bgl II限制性内切酶酶切位点(见Primer1中的下划波浪线部分)；在Primer2中，添加了与T4溶菌酶核苷酸编码序列5′端前15个核苷酸碱基呈碱基互补的DNA序列(见Primer2中有下划横线的部分)；PCR扩增条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性40秒，55℃退火40秒，72℃延伸1.5分钟，30个循环，最后72℃延伸10分钟。同样地，以Primer3和Primer4为引物，以瑞氏木霉菌株QM9414基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得了瑞氏木霉纤维二糖水解酶1基因终止子序列(Tcbh1)；为方便后续表达载体的构建，在Primer3中，添加了与T4溶菌酶核苷酸编码序列3′端前15个核苷酸碱基呈碱基互补的DNA序列(见Primer3中有下划横线的部分)；在Primer4中，添加了Sal I限制性内切酶酶切位点(见Primer4中的下划波浪线部分)。PCR扩增条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性40秒，55℃退火40秒，72℃延伸45秒，30个循环，最后72℃延伸10分钟。

实施例3：T4溶菌酶瑞氏木霉基因读码框的拼接

将上述密码子优化的T4溶菌酶基因(人工序列)、Pcbh1-sig以及Tcbh1的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶回收试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司，方法见该产品说明)回收目的DNA片段，按照1∶1∶1的比例，将Pcbh1-sig、T4溶菌酶基因和Tcbh1三种DNA片段(凝胶回收产物)混合，以此为模板，进行PCR再扩增，所用的两端引物分别为上述的primer1和primer4，PCR扩增条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性40秒，55℃退火40秒，72℃延伸2分钟，30个循环，最后72℃延伸10分钟。

将上述全长的PCR产物直接插入到pEASY-T1(购自北京全式金生物技术有限公司，操作方法见该产品说明书)质粒中的T位点内，按照该公司所提供的方法，得到含有外源DNA片段插入的中间质粒载体T4-T(含T4溶菌酶瑞氏木霉基因读码框，其顺序为：纤维二糖水解酶1基因启动子-纤维二糖水解酶1分泌信号肽编码序列-密码子优化后的T4溶菌酶基因-纤维二糖水解酶1基因终止子序列)的细菌克隆，然后，通过核苷酸测序分析，确定T4溶菌酶瑞氏木霉基因读码框中的DNA序列是正确和完整的(DNA测序由北京标凯科技有限公司完成)。

实施例4：瑞氏木霉表达载体T4-CBH9K的构建

用限制性内切酶Bgl II和Sal I进行双酶切，将连接在中间质粒载体T4-T内的T4溶菌酶瑞氏木霉基因读码框切下来，利用琼脂糖凝胶电泳分离目的片段。用相同的限制性内切酶处理质粒pPIC9K，利用琼脂糖凝胶电泳分离目的片段。将上述两个回收的DNA片段混合后并用连接酶连接在一起便得到瑞氏木霉表达载体T4-CBH9K(见附图2)，然后用上述质粒载体转化大肠杆菌细胞DH5α(购自美国GIBCO公司)以方便进行该质粒的复制和保存。

质粒载体pPIC9K购自美国Invitrogen公司，它是一个酵母诱导型表达质粒载体，它含有一个高效的诱导型启动子-醇氧化酶启动子(AOX1)，在甲醇的诱导下，可调控下游插入外源基因的高效表达。

实施例5：线性化T4-CBH9K质粒DNA的制备

首先用碱裂解法(参见分子克隆试验指南)从大肠杆菌细胞DH5α中提取T4-CBH9K质粒DNA，然后用1～2倍过量的限制性内切酶Nde I酶切，使之完全线性化，利用琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否完全。然后用酚和氯仿分别抽提上述酶切产物，乙醇沉淀，弃上清，收集沉淀，经冷冻干燥后，将沉淀重新溶解在无菌的去离子水中，-20℃保存备用。

实施例6：瑞氏木霉原生质体的遗传转化

将在PDA培养基(去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，加水到1L)斜面上培养7天左右的瑞氏木霉QM9414的分生孢子用生理盐水洗下。在PDA平板培养基上放置一张无菌玻璃纸，将瑞氏木霉分生孢子悬液(浓度约为107个/mL)涂布于培养基上，28℃培养18h左右。将20mg/mL溶壁酶(购自广东省微生物研究所)、20mg/mL蜗牛酶和10mg/mL纤维素酶混合，完全溶解于1.2M山梨醇～100mM磷酸钾缓冲液(pH5.6)中，再将平板中玻璃纸上的幼嫩菌丝转移到其中，28℃水浴1.5h～2h。在此过程中不时镜检，观察原生质体的生成情况。通过6层擦镜纸过滤，将原生质体与未被消化的菌丝体分离开，并用1.2M山梨醇～10mMTris·HCl(pH7.5)洗涤2次。6000转/分钟离心10分钟，收集原生质体，并用1M山梨～10mMTris·HCI(pH7.5)洗涤2次，最后重悬于1M山梨醇～10mMCaCl2-10mM Tris·HCl(pH7.5)中，使原生质体浓度为5x10⁷-5x10⁸/mL。将线性重组质粒(2～10μg)与制备好的瑞氏木霉原生质体(约200μL)混合，加入200μL 60％PEG4000～50mMCaCl₂～10mMTris·HCl(pH7.5)，冰浴30min，然后室温温浴20min，再加入2mL 60％PEG4000～50mM CaCl₂～10mmol/LTris·HCl(pH7.5)，继续于室温放置5min，最后加入4mL 1M山梨醇～10mmol/LCaCl₂～10mmol/LTris·HCl(pH7.5)，混匀，将上述转化液涂布在含有G418浓度为0.5mg/mL的MH[每升含dextrose 20g，(NH₄)₂SO₄ 5g，KH₂PO₄ 15g，MgSO₄·7H₂O 0.6g，CaCl₂ 0.6g，FeSO₄·7H₂O 0.005g，MnSO₄·H₂O0.0016g，ZnSO₄·7H₂O 0.0014g，CoCl₂ 0.002g，sorbitol 182.18g，pH5.5]平板上，28℃培养4～5天至木霉转化子长出。

实施例7：重组瑞氏木霉菌株的筛选

将MH培养基上生长的G418抗性转化子分别接种在MM培养基平板上，28℃培养4～5天后，从平板上分别挑取少量菌丝体转移到不同的离心管中，用生理盐水洗2次，再加入少量玻璃珠和500μLSTES缓冲液[200mM Tris·HCl(pH8.5)，250mM NaCl，25mM EDTA，2％SDS]，在振荡器上振荡3×40s后，65℃反应10分钟，冰浴5分钟。再加入200μL 10M乙酸铵溶液，冰浴5分钟后，12000转/分离心10分钟，取上清，加入200μL 10M乙酸铵溶液，再次冰浴5分钟，12000转/分离心10分钟。取上清液并用异丙醇-20℃沉淀20分钟，然后离心，沉淀用70％乙醇洗涤两次，风干后，用10μL水溶解，加入适量RNase A，37℃反应30分钟后，备用。

以上述提取的瑞氏木霉基因组DNA为模板，以P1(见SEQ IDNO.7)(5′-AAATGA ACATCTTCGAGAAGT TGAGG-3’)和P2(见SEQ ID NO.8)(5′-AATTACAAGTTCTTGTAGGCGTCCC-3’)为引物，通过PCR，扩增495bp的T4溶菌酶基因。反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸40s，共30个循环，72℃延伸10min，选出有阳性条带的克隆(见附图3中的泳道7)。

将有阳性条带的木霉菌丝再次接种在PDA斜面上，28℃培养一周左右，令其大量产生分生孢子。先用生理盐水将分生孢子洗下来，然后用12层擦镜纸过滤，以除去多余的菌丝。将木霉分生孢子按照100个孢子/皿均匀的涂布在薄的PDA培养基平板上，28℃培养10h左右，在超净台内用显微镜10倍物镜观察平板培养基上的孢子萌发情况，用无菌刀片将视野内独立的且萌发的分生孢子连同培养基一同切下。转入含有0.4mg/mL G418的PDA斜面上，28℃培养一周左右，当试管内有大量菌丝产生时，将其挑出一部分，快速提取基因组，进行PCR扩增验证是否仍含有T4溶菌酶基因，扩增条件同上。经过上述单孢分离和PCR检测后的仍为阳性的克隆被确认为成功的木霉转化子，并被命名为TR-T4。

实施例8：重组木霉工程菌的高密度发酵

1、种子液的制备

将工程菌株TR-T4的菌丝接种于多个PDA固体斜面培养基中，27～28℃培养6～7天，待分生孢子长成绿色后，刮下孢子并悬浮于无菌水中，以1～2％接种量接种于500mL MM液体培养基中，27～28℃避光震荡(375～380转/分)培养48～72h，以其作为高密度发酵的种子液。

2、重组木霉在5L发酵罐中的高密度发酵

本发酵过程可以分为以下两个阶段：1)菌体培养阶段：在5L发酵罐(镇江东方生物工程设备技术有限责任公司)中盛放了3.5L MM基础发酵培养基，按10％的比例接种此前制备好的木霉种子液，27～28℃通气搅拌(转速自始至终维持在375～380转/分)培养72～96小时左右，pH维持在5.5～6左右。在该培养过程中，随着木霉菌体的生长，培养基中的溶氧量将由100％逐渐降低，当培养基中的碳源基本消耗完后，溶氧量将再度升高至80％以上，此时菌体的湿重将达35～40g/L。2)诱导表达阶段(72～144h)：在接种第四天后，通过蠕动泵流加50％纤维素悬浮液(用MM培养基配制)，使其工作浓度始终维持在2～3％左右，溶氧量始终大于20％，27～28℃通气搅拌培养至接种后144～166小时，pH维持在5.5～6左右。每隔24小时取数毫升发酵液经5000rpm 4℃下离心10分钟，取30uL发酵液上清液进行SDS-PAGE检测，发现有肉眼可观察到的一条蛋白带，分子量约为19KDa，与推测中的T4溶菌酶重组蛋白的分子量相吻合。此外，从PAGE电泳图看，在加入纤维素诱导培养72小时后，重组蛋白的表达量达到最高峰(见附图4)。

实施例9：重组蛋白的纯化

待一个发酵周期全部结束之后，留取400mL发酵液作为种子液(接种量为10％)直接进行下一轮的发酵过程。类似的操作累计进行3轮，在每轮发酵过程中，均对菌体的生长量和T4溶菌酶重组蛋白的表达量进行了测定。另外，在每轮发酵过程完全结束后，还取少许菌液涂布于PDA固体平板上，并从中任意挑取10个木霉单菌落，快速提取其基因组DNA，进行PCR检测，结果发现，菌体的生物量、生长速度以及重组蛋白的表达量在各轮发酵过程中基本保持稳定，另外，PCR的检测结果也证实重组木霉具有很好的遗传稳定性(见表2)。

表2TR-T4菌株的遗传稳定性和外源蛋白表达稳定性的测定

 PCR阳性>  生长72小时的菌体湿重  (g/L)>  诱导72小时T4溶菌酶表达量(mg/L)> 100％>  39>  550> 100％>  37>  540> 100％>  40>  590>

除留存的种子液外，其余的发酵液用于T4溶菌酶重组蛋白的纯化。发酵液经5000rpm 4℃离心10分钟，留取上清。发酵液上清首先用截流分子量为50KDa的中空纤维滤柱(天津膜天膜工程技术有限公司，产品型号：MOF-503，使用方法见该公司说明)过滤，收集透过液，澄清的透过液再用截流分子量为10KDa的纳滤膜(上海朗极化工科技有限公司，产品编号：2426538，使用方法见该公司说明)处理，保留回流液，终体积约为700mL。将此回流液进行脱盐处理，向700mL回流液中加入6.3L蒸馏水，即将回流液稀释10倍，然后将稀释液再次通过上述10KDa的纳滤膜处理，此时得到的回流液中盐离子浓度也相应稀释10倍，如此重复操作5次，即回流液中盐离子浓度稀释10⁵倍，最终得到700mL回流液，将此回流液冷冻干燥后，可得到初步提纯(纯度大60％左右)的重组蛋白冻干粉。

该蛋白冻干粉样品可通过离子交换层析得到进一步的纯化，以满足不同的生产需求。所使用的阳离子离子交换树脂为CM-Sephadex-C25(美国GE公司产品)。按照该公司产品说明，对树脂进行预处理，然后进行装柱(装柱方法见产品说明，层析仪为上海沪西分析仪器厂有限公司产品-型号MA99-3)，具体操作方法如下

1)蛋白冻干粉加入5倍体积的蒸馏水进行稀释，然后用丙醋酸将该稀释液pH值调至5.5～5.8。

2)样品上柱(注：若冻干粉样品为2g+500mL蒸馏水时，使用1.5x50cm的层析柱，树脂床体积高度为40cm)，流速3mL/分钟。用紫外蛋白检测仪及记录仪记录洗脱液流出过程。

3)洗柱，待样品快全部进入树脂后，用0.1M磷酸盐缓冲液含10^-3M MgSO₄(pH6.5)进行洗柱，流速3mL/分钟，至OD280nm吸光值为零，约需缓冲液为5～6倍柱体积。

4)洗脱，用0.1M磷酸盐缓冲液含10^-3M MgSO₄和0.5M NaCl(pH6.5)进行目标蛋白洗脱，流速3mL/分钟，用紫外蛋白检测仪监视蛋白流出情况并收集最大蛋白洗脱部分(目的蛋白峰一般出现在加入洗脱液后不久)，收集含目的蛋白的洗脱液。

5)将洗脱液移置透析袋中，对蒸馏水进行透析过夜，期间更换蒸馏水数次，目的是为了去除其中所含的NaCl。

6)透析液通过冷冻干燥，可得到目标蛋白干粉，蛋白纯度可达99％(SDS-PAGE电泳图经LabWork软件分析，美国UVP公司产品)。以上，室温下可长期保存。视使用目的不同，可加工成各种剂型，如食品添加剂，针剂等。

实施例9：T4溶菌酶重组蛋白生物活性的检测

利用比色法进行溶菌活性比较，具体操作如下：

①底物制备：从-72℃超低温冰箱中取出冷冻保藏的小球菌(Micrococcus Lysodeikticus)(购自于中国普通微生物菌种保藏中心，菌种编号1.634)，用接种针挑取少许菌液后，在LB(5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g NaCl，20g agar，加水至1L，pH7.0)固体平板培养基上划线，37℃倒置培养过夜。

挑取小球菌细胞培养单菌落，接种于5mL LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，次日全部转接于100mL LB液体培养基中，37℃振荡培养至细胞浓度OD_600nm值为1.602。将培养液转移至100mL离心管中，冰浴后5000rpm 4℃离心10分钟，收集沉淀。用0.05M Tris-HCl(pH7.4)缓冲液50mL悬浮和洗涤细胞，同上离心后，收集沉淀。将细胞再次悬浮于10mL相同的Tris-HCl缓冲液中，并转移置至干燥瓶中，置于-20℃冷冻1个星期(冷冻贮存对增强细胞敏感度是必需的)，然后再进行冷冻干燥。细胞干粉在密闭条件下可置于干燥器中室温下长期保存。如果细胞干粉对T4溶菌酶不敏感，还可将细胞干粉置于37℃保存以便增强细胞的敏感度。

取小球菌冻干粉40mg，重新悬浮于100mL 0.2M的磷酸盐缓冲液(5.54g Na₂HPO₄·12H₂O，0.704g NaH₂PO₄·2H₂O，加蒸馏水至100mL，pH7.4)，其OD_350nm值为1.0左右(若将40mg小球菌冻干粉重新悬浮于50mL的磷酸缓冲液中，其OD₃₅₀值为1.6左右)，备用。

②底物孵育：取上述制备的T4溶菌酶重组蛋白纯品若干毫克，分别稀释成不同的工作浓度后各取300uL，分别与上述制备好的2.7mL小球菌底物，阴性对照为蒸馏水。将各试管置于37℃温箱中孵育1h后，在350nm波长下测定溶液的吸光值(用2.7ml 0.2M的磷酸盐缓冲液加入300μL蒸馏水来调零)，测定结果见表3：

表3  T4溶菌酶重组蛋白溶菌活性的检测

  T4溶菌酶工作浓度(mg/mL)>  OD₃₅₀nm吸光值>  对照CK->  0>  1.721>  1.693>  0.0005>  1.645>  1.715>  0.0010>  1.554>  1.673>  0.0015>  1.515>  1.681>  0.0020>  1.443>  1.696>  0.0025>  1.402>  1.666>  0.0030>  1.364>  1.697>  0.0035>  1.269>  1.672>  0.0040>  1.242>  1.673>

注：表中数字为三次试验结果的平均值

本发明首次按照瑞氏木霉所偏爱的密码子，人工合成了一个全新的T4溶菌酶基因，并与瑞氏木霉纤维二糖水解酶1分泌信号肽(17aa)的编码序列融合；克隆了瑞氏木霉纤维二糖水解酶1基因的启动子及该基因的终止子序列；并利用上述的各种元件，在质粒pPIC9K的基础上重新构建了一个全新的、诱导型的和分泌型的瑞氏木霉高效表达载体；在将T4溶菌酶基因导入瑞氏木霉细胞中后，通过抗性筛选、活性检测等方法，获得了能够稳定和高效表达T4溶菌酶的重组瑞氏木霉工程菌株，再经高密度发酵、重组蛋白纯化等一系列操作，最终制备的重组T4溶菌酶蛋白纯品具生物活性，可广泛应用于医疗、食品、饲料以及科研等领域。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

参考文献

1、Arisaka F.，et al.，The international journal of biochemistry & cellbiology，2003，35(1)：16-21

2、Cellitti J.，et al.，Protein Sci.，2007，16(5)：842-51

3、姜天一和朱平，生物技术通讯，2007，18(6)：1050-1052

4、Li Tao，et al.，Appl Microbiol Biotechnol.，2008，80：573-578

5、Bruno C.，et al.，Biotechnol.Lett.，2007，29：1195-1201

6、Hanna K.，et al.Biotechnology and Bioengineering，2006，94：407-415

7、徐军等，生物化学与生物物理学报2003，35(5)：454-458

8、Ritva S.，et al.，Applied and Environmental Microbiology，1997，63(12)：4938-4940

序列表

<110>中国农业科学院生物技术研究所

 

<120>通过重组瑞氏木霉以诱导型方式高效表达和生产T4溶菌酶的方法

 

<130>KHP10112298.4

 

<160>8

 

<170>PatentIn version 3.5

 

<210>1

<211>164

<212>PRT

<213>T4噬菌体

 

<400>1

Met Asn Ile Phe Glu Met Leu Arg Ile Asp Glu Arg Leu Arg Leu Lys

1               5                   10                  15

Ile Tyr Lys Asp Thr Glu Gly Tyr Tyr Thr Ile Gly Ile Gly His Leu

            20                  25                  30

Leu Thr Lys Ser Pro Ser Leu Asn Ala Ala Lys Ser Glu Leu Asp Lys

        35                  40                  45

Ala Ile Gly Arg Asn Cys Asn Gly Val Ile Thr Lys Asp Glu Ala Glu

    50                  55                  60

Lys Leu Phe Asn Gln Asp Val Asp Ala Ala Val Arg Gly Ile Leu Arg

65                  70                  75                  80

Asn Ala Lys Leu Lys Pro Val Tyr Asp Ser Leu Asp Ala Val Arg Arg

                85                  90                  95

Cys Ala Leu Ile Asn Met Val Phe Gln Met Gly Glu Thr Gly Val Ala

            100                 105                 110

Gly Phe Thr Asn Ser Leu Arg Met Leu Gln Gln Lys Arg Trp Asp Glu

        115                 120                 125

Ala Ala Val Asn Leu Ala Lys Ser Arg Trp Tyr Asn Gln Thr Pro Asn

    130                 135                 140

Arg Ala Lys Arg Val Ile Thr Thr Phe Arg Thr 6ly Thr Trp Asp Ala

145                 150                 155                 160

Tyr Lys Asn Leu

<210>2

<211>495

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>2

atgaacatct tcgagatgtt gcgcatcgac gagaggttga ggttgaagat ctacaaggac    60

accgagggct actacaccat cggcatcggc cacttgttga ccaagtcccc ctccttgaac    120

gccgccaagt ccgagttgga caaggccatc ggcaggaact gcaacggcgt catcaccaag    180

gacgaggccg agaagttgtt caaccaggac gtcgacgccg ccgtcagggg catcttgagg    240

aacgccaagt tgaagcccgt ctacgactcc ttggacgccg tcaggaggtg cgccttgatc    300

aacatggtct tccagatggg cgagaccggc gtcgccggct tcaccaactc cttgaggatg    360

ttgcagcaga agaggtggga cgaggccgcc gtcaacttgg ccaagtccag gtggtacaac    420

cagaccccca acagggccaa gcgcgtcatc accaccttca ggaccggcac ctgggacgcc    480

tacaagaact tgtaa                                                     495

 

<210>3

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>3

acagatctaa ttctggagac ggcttgttga atc                                  33

 

<210>4

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>4

ctcgaagatg ttcatagcac gagctgtggc caagaaggc                            39

<210>5

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>5

tacaagaact tgtaaaggtc accttctcca acatcaagtt cg 42

 

<210>6

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>6

acgtcgacca cgaagagcgg cgattctacg gg            32

 

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>7

aaatgaacat cttcgagaag ttgagg                   26

 

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>8

aattacaagt tcttgtaggc gtccc                    25