一种通过胚抢救获得植物嫁接嵌合体后代的方法

摘要

本发明公开一种通过胚抢救获得植物嫁接嵌合体后代的方法，包括如下步骤：(1)在十字花科植物嫁接嵌合体幼胚败育前1天摘取子房；(2)将子房消毒并冲洗；(3)将子房置于铺有用营养液充分浸泡过的滤纸的培养皿上，剖开子房一端后沿腹缝线撕开，选取淡绿色且有光泽的胚珠连同胚柄及与胚柄相连的子房壁组织一同切下并接种到发育培养基上；于25±2℃黑暗条件下培养，再光照培养；(4)将成熟种子摘下接种于发芽培养基上于25±2℃黑暗条件下培养；(5)在种子萌发长出真叶后将幼苗先转移到继代培养基上培养，后转移至生根培养基上生根；(6)将生根后的幼苗取出，移栽至装有基质的营养钵中炼苗6～12天，后将幼苗移至田间，获得植物嫁接嵌合体后代。

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种通过胚抢救获得植物嫁接嵌合体后代的方法，尤其涉及一种抢救十字花科植物种间嫁接嵌合体有性后代的技术方法。

背景技术

嫁接是将植物体的芽或枝接到另一植物体的适当部位，使两者接合成一个新植物体的技术。作为一项世界性的技艺，嫁接一直被广泛地应用并积极地促进了农业的发展。植物嫁接是一种无性繁殖方式，但是它能够诱导植物产生遗传变异。早在明代的《本草纲目》中就记载了“李接桃而本强者其实毛，梅接杏而本强者其实甘”的现象。20世纪初，苏联园艺学家米丘林曾提出嫁接杂交、定向培育和驯化等改变植物遗传性的原则和方法，并培育出许多果树新品种。因此，研究嫁接对植株性状的影响和调控机制具有重要的意义。

茎尖嫁接是植物嫁接的一种形式，通过茎尖嫁接可以获得植物嵌合体，即顶端分生组织包含两种或两种以上遗传型细胞，并由这些细胞层共同形成器官并最终发育而成的完整植株。植物嫁接嵌合体是研究嫁接对植物生长发育调控机制的优良材料。但是，研究发现嫁接嵌合体中存在的异源细胞层能够影响植物的生殖发育特性，进而导致嵌合体的不育(参见Plant cell graft chimerasobtained by co-culture of isolated protoplasts.Binding et al.Protoplasma，第141卷第1期，64-73页，1987年2月)，从而阻碍了人们对嫁接遗传变异机制的研究。因此急需一套完善的人工胚抢救体系以保留嫁接嵌合体植物的有性后代，但在此之前还没有关于嫁接嵌合体植物胚抢救及植株再生的方法，更没有成功的实例。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过胚抢救获得植物嫁接嵌合体后代的方法。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：该通过胚抢救获得植物嫁接嵌合体后代的方法主要包括如下步骤：

(1)在十字花科植物嫁接嵌合体的幼胚败育的前1天摘取子房；

(2)将摘取的子房先消毒，后在超净工作台上用无菌蒸馏水冲洗；

(3)将冲洗后的子房置于铺有用营养液充分浸泡过的滤纸的培养皿上，剖开子房的一端，然后将子房沿腹缝线撕开，选取子房内呈淡绿色且有光泽的胚珠；将胚珠连同胚柄以及与胚柄相连的子房壁组织一同切下并接种到发育培养基上，使胚柄和子房壁组织与培养基相接触；接种后的胚珠先于25±2℃的黑暗条件下培养12～24小时，再进行光照培养，所述光照培养的温度为25±2℃、光照强度为30～60μmol m^-2s^-1、光照时间为8～12小时/天；

(4)在胚珠成熟为种子后，将种子摘下后接种于发芽培养基上于25±2℃的黑暗条件下进行培养使种子萌发；

(5)在种子萌发长出真叶后将幼苗先转移到继代培养基上培养，后再转移至生根培养基上生根，在继代培养基和生根培养基上进行培养的温度为25±2℃、光照强度为80～120μmol m^-2s^-1、光照时间为12小时/天；

(6)将生根后的幼苗从生根培养基中取出，洗掉根部的培养基并将幼苗移栽至装有基质的营养钵中炼苗6～12天，后将幼苗移至田间，从而获得植物嫁接嵌合体后代。

进一步地，本发明在所述步骤(3)中，所述营养液为3％蔗糖溶液。

进一步地，本发明在所述步骤(3)中，将胚珠接种到发育培养基时的接种密度为1～3个胚珠/厘米²。

进一步地，本发明所述接种密度为1个胚珠/厘米²。

进一步地，本发明在所述步骤(3)中，所述发育培养基的配方为MS+3％蔗糖+0.8％琼脂+400mg/L谷氨酰胺+400mg/L水解酪蛋白+0.2％活性炭，pH＝5.8。

进一步地，本发明在所述步骤(4)中，所述发芽培养基的配方为1/2MS+3％蔗糖+0.8％琼脂+0.2mg/L 6-苄氨基嘌呤。

进一步地，本发明在所述步骤(5)中，所述继代培养基的配方为1/2MS+3％蔗糖+0.8％琼脂。

进一步地，本发明在所述步骤(5)中，所述生根培养基的配方为1/2MS+3％蔗糖+0.8％琼脂+0.1mg/L α-萘乙酸。

进一步地，本发明在所述步骤(6)中，所述基质为蛭石和珍珠岩，蛭石和珍珠岩的体积比为2∶1。

进一步地，本发明在步骤(6)中进行炼苗时，先在幼苗上覆盖薄膜并遮荫，在炼苗2～4天后逐渐揭开薄膜使幼苗适应外界环境。

本发明的优点是：本发明采用人工培养基对胚珠进行培养使胚珠成熟为种子，种子萌发后再经过继代和生根，可在短期内获得大量的有性后代植株。该方法可操作性强，简单实用，胚抢救的效果显著，可以广泛应用于十字花科植物及嫁接嵌合体植物的胚抢救，对于特殊植物新品种的培育和嫁接育种的发展具有重要的意义。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1：

材料：本实例以人工合成的十字花科芸薹属紫甘蓝(Brassica oleracea)和榨菜(B.juncea)的种间嫁接嵌合体TCC为材料。该种间嫁接嵌合体TCC是以其茎尖分生组织三层结构的细胞来源命名的：从外向内依次为L1-L2-L3，T＝榨菜，C＝紫甘蓝(可参见：Synthesis of interspecific chimeras between tuber mustard(Brassicajuncea)and cabbage(B.oleracea)and cytological analysis.Chen et al.Plant CellReports，第25卷第9期：907-913页，2006年9月)

步骤(1)：取材

对TCC进行蕾期人工自花授粉，取授粉后不同时期的子房，通过石蜡切片的方法观察其幼胚发育过程，发现败育发生在球形胚后期，其具体的败育时间为授粉后的第17天。故在胚胎败育的前1天即第16天时摘取子房。

步骤(2)：材料消毒

将摘取的子房先用75％的酒精消毒30秒，再用5％的次氯酸钠溶液浸泡15分钟，其间摇动几次以彻底消毒。然后在超净工作台上用无菌蒸馏水冲洗3遍。

步骤(3)：胚珠的剥离和接种

将冲洗后的子房置于铺有用3％蔗糖溶液充分浸泡过的滤纸的培养皿上，用手术刀剖开一端，然后用两把镊子缓慢地将子房沿腹缝线撕开，这种操作方法简单易行，可有效地减少刀切，在避免对胚珠的操作损伤方面有显著效果。其中，3％蔗糖溶液的作用是维持渗透压和湿度，从而使胚珠在脱离母体后到接种至培养基期间保持良好的生长状态，有利于提高抢救效率。本发明使用3％蔗糖溶液作为营养液，效果较佳，且其配制简单方便，当然也可用其它适当浓度的营养液代替。选取子房内呈淡绿色且有光泽的胚珠，将其与胚柄及与胚珠相连的子房壁组织一同切下，接种到发育培养基上，子房壁组织可以只切取与胚柄相连的那部分。接种时使胚柄及子房壁组织接触到发育培养基，有利于胚柄对营养物质的吸收；若使胚珠不直接接触培养基，则可为其提供一个与活体更接近的生长环境从而更有利于促进胚珠的发育。适当的接种密度有利于胚柄和子房壁组织吸收发育培养基中的养分，从而使胚珠获得充足的营养，当接种密度为1～3个胚珠/厘米2时，营养供给较为理想，其中当接种密度为1个胚珠/厘米2时，营养供给效果最好。发育培养基配方为MS+3％蔗糖+0.8％琼脂+400mg/L谷氨酰胺+400mg/L水解酪蛋白+0.2％活性炭，pH＝5.8。其中，谷氨酰胺和水解酪蛋白是营养添加物，对胚珠的发育有显著的促进作用；活性炭的添加可以有效防止接种材料的褐化。接种后的胚珠先于25±2℃、黑暗条件下培养24小时，再转到25±2℃，40μmol m^-2s^-1光照下培养，光照时间为16小时/天。

培养6天左右，以胚珠内可以肉眼观察到绿色胚体为佳；培养15天左右，整个胚珠转为深绿色；大约在培养的第24天，胚珠表面局部出现淡红色并逐渐蔓延至整个胚珠；培养30天后，胚珠通体转为褐色并逐渐成为成熟种子。

步骤(4)：种子的成熟和萌发

将成熟的种子从胚柄上摘下并接种于发芽培养基上，发芽培养基的配方为1/2MS(MS中的大量元素减半)+3％蔗糖+0.8％琼脂+0.2mg/L 6-苄氨基嘌呤，培养条件：温度为25±2℃，黑暗。待种子萌发后统计抢救成活率(即胚的抢救成活率)为22.4％。

步骤(5)：继代和生根

种子萌发长出真叶后将幼苗先转移到继代培养基上培养，继代培养基的配方为1/2MS+3％蔗糖+0.8％琼脂。待长出4～5片叶子时再转移至生根培养基上生根，生根培养基的配方为1/2MS+3％蔗糖+0.8％琼脂+0.1mg/L α-萘乙酸(NAA)。培养条件：温度为25±2℃，80μmol m^-2s^-1光照下培养，光照时间为12小时/天。

步骤(6)：幼苗的移栽

当生根后的幼苗的平均根长大于2厘米时，幼苗的根系已经足够健壮，此时将其从培养瓶中取出，轻轻冲洗掉根部的培养基并移栽至营养钵中，营养钵中的基质为蛭石和珍珠岩(2∶1，v/v)。为防止幼苗失水萎蔫，提高移栽成活率，可在幼苗上方覆盖薄膜并适当遮荫以保持湿度，2天后开始逐渐揭开薄膜使幼苗适应外界环境。大约炼苗10天后移至田间，从而获得本发明的嫁接嵌合体TCC的有性后代植株，移栽成活率可达100％。

植物学特性观察：通过本实施例培养获得的嫁接嵌合体TCC的自交后代植株的植物学特性与紫甘蓝较为相似，未出现显著的形态学变异，且染色体数为2n＝18，也与紫甘蓝相同。

实施例2-10：

在实施例2-10中，本发明通过胚抢救获得植物嫁接嵌合体后代的方法的步骤与实施例1相同，不同之处见表1。

表1

  实施例  在步骤  (3)中的  黑暗培养  时间(小  时)  在步骤(3)  中的光照培  养时的光照  强度μmol  m^-2s^-1  在步骤  (3)中的  光照时间  (小时/  天)  在步骤(3)  中的胚珠接  种的密度  (个/厘米²)  在步骤(5)  中的光照培  养时的光照  强度μmol  m^-2s^-1  胚的抢救  成活率  (％)  实施例2  12  30  8  1  80  15.6  实施例3  12  45  10  2  100  13.3  实施例4  12  60  12  3  120  10.8  实施例5  18  30  8  1  80  16.7  实施例6  18  45  10  2  100  18.0  实施例7  18  60  12  3  120  17.1  实施例8  24  30  8  1  80  21.6  实施例9  24  45  10  2  100  20.8  实施例10  24  60  12  3  120  18.5

实施例11-12：

在实施例11-12中，本发明通过胚抢救获得植物嫁接嵌合体后代的方法的步骤与实施例1相同，不同之处见表2。

表2

  实施例  在步骤(3)中的发  育培养基配方的活  性炭含量(％)  在步骤(3)中的发  育培养基配方的谷  氨酰胺的含量  (mg/L)  在步骤(3)中的  发育培养基配方  的水解酪蛋白的  含量(mg/L)  胚的抢救成  活率(％)  实施例11  0.2  400  0  15.8

  实施例  在步骤(3)中的发  育培养基配方的活  性炭含量(％)  在步骤(3)中的发  育培养基配方的谷  氨酰胺的含量  (mg/L)  在步骤(3)中的  发育培养基配方  的水解酪蛋白的  含量(mg/L)  胚的抢救成  活率(％)  实施例12  0.2  0  400  17.3

植物学特性观察：以上实施例2-12培养获得的嫁接嵌合体TCC的自交后代植株的植物学特性与紫甘蓝较为相似，未出现显著的形态学变异，且染色体数为2n＝18，也与紫甘蓝相同。

最后需要说明的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。