人羊膜上皮细胞与神经干细胞共培养诱导分化多巴胺能神经元的方法

摘要

本发明人羊膜上皮细胞与神经干细胞共培养诱导分化出多巴胺能神经元的方法包括：将人羊膜上皮细胞放置在复合培养板的上层培养室内的半透膜上，神经干细胞球放置在复合培养板的下层培养室内，上层培养室在下层培养室的上方，复合培养板内充满了神经干细胞基础培养基，人羊膜上皮细胞分泌至培养基中的生长因子通过半透膜进入到放置神经干细胞球的下层培养室中；将复合培养板放置在二氧化碳孵化箱内培养；培养数日后移走上培养室，去除放置在下培养室内的神经干细胞球、未贴壁细胞和神经干细胞基础培养基，收获上述所有细胞。本发明方法具有操作方便、成本低和得到多巴胺能神经元的比例较高的优点，并且以人源性细胞作为滋养细胞，可以避免来自动物源性及肿瘤源性细胞的病源污染，提高临床应用的安全性。

说明书

技术领域

本发明涉及了一种人羊膜上皮细胞与神经干细胞共培养诱导分化多巴胺能神经元的方法。

背景技术

人羊膜组织是胚胎发育的早期产物，形成于原肠胚之前的受精第8天，人羊膜上皮细胞主要由外胚层的成人羊膜细胞和滋养层细胞等构成，近年的研究证实培养人羊膜上皮细胞可以合成分泌神经营养因子(Neurotrophic-3 NT-3)、脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor BDNF)和神经生长因子(nerve growth factor NGF)，可释放乙酰胆碱和儿茶酚胺等神经介质，认为人羊膜组织的主要作用之一是向羊水提供神经营养因子，确认了其在早期神经系统发育中的神经营养作用^[12]。人羊膜上皮细胞条件培养基与含有睫状神经营养因子、N2和B27的培养基相比较，可以明显提高视网膜神经节细胞的成活率，考虑人羊膜上皮细胞可能分泌合成一种未知的生物活性物质，具有神经保护作用，对胚胎早期神经系统的发育具有调控作用^[13]。Marvin等从分子水平证实了人羊膜组织表达神经营养因子基因，如ephrin-A2，ephrin受体-A2、-B1、-B3、-B4和-B5，neuropilin-2，p75等神经生长因子受体和semaphorin-F^[18]，这些基因在胚胎发育成熟的不同阶段具有重要作用。因此神经发育生物学研究认为，神经发生的早期人羊膜组织直接与神经上皮联系，向羊水中释放神经递质及神经营养因子，在神经系统发育过程中起着重要作用。特别是近年文献报道人羊膜上皮细胞可以移植胶质细胞分化，促进神经元分化，我们的实验证实，人羊膜上皮细胞表达多巴胺能表型分化相关基因：Math1、NGN2；以及神经发生相关基因：Mash1、Noth1，hAEC-NSC体外复合培养80％以上向神经元细胞分化，胶质细胞分化紧1-5％。

基于上述理论我们开展并建立了“人羊膜上皮细胞与神经干细胞共培养诱导分化多巴胺能神经元的方法”的实验体系。

发明内容

本申请的发明目的在于提供人羊膜上皮细胞与神经干细胞共培养诱导分化多巴胺能神经元的方法。

本申请的发明内容通过以下的方法进行实施：

本发明的一种人羊膜上皮细胞与神经干细胞共培养诱导分化出多巴胺能神经元的方法，该方法包括以下步骤：

(a)将人羊膜上皮细胞种植在复合培养板的上层培养室内的半透膜上，神经干细胞球放置在复合培养板的下层培养室内，上层培养室在下层培养室的上方，上层培养室和下层培养室之间装有半透膜装置，其中充满微孔，复合培养板内充满了神经干细胞基础培养基，人羊膜上皮细胞分泌的生长因子透过半透膜装置进入到放置神经干细胞球的下层培养室中；

(b)将上述复合培养板放置在二氧化碳孵育箱内培养10-15天；

(c)移走上层培养室，去除放置在下层培养室内的神经干细胞球、未贴壁细胞和神经干细胞基础培养基；

(d)对收获的部分细胞进行鉴定，确认酪氨酸羟化酶阳性细胞的存在，并进行定量分析，得到了含有多巴胺能神经元样细胞的细胞；

(e)收获上述所有细胞。

本发明的一种人羊膜上皮细胞与神经干细胞共培养诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其中：所述人羊膜上皮细胞的个数与神经干细胞球的个数比为10～100∶1。

本发明的一种人羊膜上皮细胞与神经干细胞共培养诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其中：所述复合培养板是在温度为37℃、湿度为95％和5％的二氧化碳的孵育箱内进行培养的。

本发明的一种人羊膜上皮细胞与神经干细胞共培养诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其中：所述步骤(c)中的定量分析是利用免疫荧光细胞化学双标记法进行标记，然后在倒置生物显微镜下选择至少三个低倍视野进行计数分析，该低倍视野的倍数为10倍。

本发明的一种人羊膜上皮细胞与神经干细胞共培养诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其中：所述每毫升的神经干细胞基础培养基含有：15％的血清、200ng的Sonic hedgehogSHH、100ng的成纤维细胞生长因子8、10ng的碱性成纤维细胞生长因子8、200μM的维生素C和20ng的脑源性神经营养因子。

用本发明的人羊膜上皮细胞与神经干细胞共培养诱导分化出多巴胺能神经元的方法与现有的诱导神经干细胞转化为多巴胺能神经元的方法相比，具有操作方便、成本低和得到多巴胺能神经元的比例较高的优点，并且以人源性细胞作为滋养细胞，可以避免来自动物源性及肿瘤源性细胞的病源污染，提高临床应用的安全性。

附图说明

图1为用于人羊膜上皮细胞与神经干细胞共培养的复合培养板示意图；

图2为人羊膜上皮细胞与神经干细胞共培养过程的流程图；

具体实施方式

参见图1和图2，本发明的人羊膜上皮细胞与神经干细胞共培养诱导分化出多巴胺能神经元的方法，该方法包括以下步骤：

(a)将人羊膜上皮细胞4放置在图1的复合培养板的上层培养室1内，神经干细胞球5放置在复合培养板的下层培养室2内，上层培养室1在下层培养室2的上方，上层培养室1和下层培养室2之间装有半透膜装置3，其中充满微孔，人羊膜上皮细胞4放置在上述半透膜3上，复合培养板内充满了神经干细胞基础培养基7，人羊膜上皮细胞4中的生长因子如：脑源神经营养因子、神经生长因子、上皮细胞生长因子和转化生长因子透过半透膜装置3进入到放置神经干细胞球5的下层培养室2中，在下层培养室2内的神经干细胞球5分泌的物质也可以透过半透膜3进入上层培养室1中，人羊膜上皮细胞4的个数与神经干细胞球5的个数比为10～100∶1，图1中的复合培养板为市售产品；所述每毫升的神经干细胞基础培养基7含有：15％的血清、200ng的Sonic hedgehog SHH、100ng的成纤维细胞生长因子8、10ng的碱性成纤维细胞生长因子8、200μM的维生素C和20ng的脑源性神经营养因子；

(b)将上述复合培养板放置在二氧化碳孵育箱6内培养10-15天，复合板是在温度为37℃、湿度为95％和5％的二氧化碳的孵化箱6内进行培养的；神经干细胞球5在上述因子的作用下，分化成神经元细胞和胶质神经细胞，其中含有90％的多巴胺能神经元样细胞；

(c)移走上层培养室1，去除放置在下层培养室2内的神经干细胞球5、未贴壁细胞和神经干细胞基础培养基7；

(d)对收获的部分细胞进行鉴定，确认酪氨酸羟化酶阳性细胞的存在，并利用免疫荧光细胞化学双标记法进行标记，然后在倒置生物显微镜下选择至少三个低倍视野进行计数分析，该低倍视野的倍数为10倍。

(e)收获上述所有细胞，获得到了含有多巴胺能神经元样细胞的细胞。

以上方法只是对本发明的解释，不是对发明的限定，本发明所限定的范围参见权利要求，在不违背本发明的精神的情况下，本发明可以作任何形式的修改。