白介素-11半成品溶液的制备方法及其产品

摘要

本发明公开了白介素-11半成品溶液的制备方法及其产品，包括：将白介素-11溶解于磷酸缓冲液中，添加甘氨酸，搅拌，得到混合溶液，调节混合溶液的pH值；补加注射用水定容，搅拌，即得；其中，采用稀碱将混合溶液的pH值调至8.0-9.5，或者采用稀酸将混合溶液的pH调为1.0-6.0。本发明方法较好解决白介素-11蛋白在半成品配制、无菌过滤和分装过程易出现聚集和沉淀的问题，所制备得到的半成品溶液澄清透明，无乳光，主药蛋白定量准确；半成品溶液配制后的无菌过滤易行，滤膜不堵塞，半成品分装过程也不会造成聚集和沉淀。成品复溶后的产品澄清度好，无任何絮状沉淀且不产生乳光，活性保持稳定，临床使用量减少。

说明书

技术领域

本发明涉及白介素-11制剂的制备方法，尤其涉及白介素-11半成品溶液的制备方法以及由该制备方法所制备得到的产品，属于白介素-11的制剂领域。

背景技术

人白介素-11是一种可直接刺激骨髓造血干细胞和巨核祖细胞增殖，诱导巨核祖细胞成熟分化，增加体内血小板生成，从而提高血液血小板计数，而血小板功能无明显改变的细胞因子。临床研究表明，使用该产品后发育成熟的巨核祖细胞在超微结构上完全正常，生成的血小板的形态、功能和寿命与天然生成的相一致。成熟人白细胞介素11由178个氨基酸组成，分子量为20KD，是强碱性蛋白(等电点为11.7)，同时该蛋白疏水性极强。

由于类似IL-11的细胞因子的自然来源十分有限，应用基因工程手段进行基因克隆、重组表达及改造，是目前众多细胞因子在基础研究和临床应用上的重要手段。基因工程的改造主要包括基因的缺失、突变和融合，从而可以制备出各种形式的衍生物。重组人白介素-11便是应用基因重组技术生产的一种促血小板生成因子。

白介素11蛋白性质的特殊性：由于白介素-11为强碱性蛋白，等电点为11.7，且疏水性极强，因此该蛋白药物在生产过程中对诸如离子强度、pH、温度、反复冻融和常规剪切力十分敏感。所述的剪切压力包括生产过程使用的加压泵或利用其它方法加压的管道输送，还有样品在包装和运输过程遇到的振荡等。其物理不稳定性表现为变性或者产生可溶性聚集和不可溶性的沉淀，而化学不稳定性表现为水解(尤其是其Asp¹³³和Pro¹³⁴氨基酸之间)、Asn⁴⁹位氨基酸的脱酰胺化及Met⁵⁸位氨基酸的氧化。因此白介素-11蛋白是一种性质十分特殊的细胞因子，必须对其生产过程的各个环节都小心处理并对制剂配方进行优化。

有鉴于白介素-11蛋白对所处环境的高度敏感性，所以国内外的成品生产都采用冻干粉针剂型。美国Genetics Institute公司rhIL-11产品于1997年获得最早获得FDA上市许可，其成品每支为5mg冻干粉，制剂配方中添加剂为甘氨酸，缓冲液为10mM的磷酸缓冲液(PB)，pH值为7.0，使用时用1.0ml无菌注射用水溶解。

由于白介素-11蛋白性质的特殊性，制剂配方采用pH值7.0时，尽管加入甘氨酸作为保护剂，但白介素-11的原液量取、pH的调节及搅拌和定容，会不同程度产生一些丝状沉淀或聚集体。它们或吸附到容器壁或悬浮于溶液中，造成配制好的半成品溶液不澄清透明，且有乳光产生。这种现象的产生造成两种不利的结果，一是因沉淀或聚集体的产生会影响成品的白介素-11浓度，使得最终产品的精确定量存在一定的不确定性；二是配制过程生成的聚集体或沉淀也为后续的无菌过滤带来困难，很容易造成滤膜堵塞。另外，在此pH值下的无菌过滤后的半成品分装也会因料液输送引入的剪切力造成主药蛋白的聚集或沉淀，使得冻干后的成品复溶后会絮状沉淀较多。临床应用上，乳光和微小沉淀导致临床起效慢、使用剂量大，另外医生在使用也必须加倍小心，不能用力振荡溶解及混匀，以避免产生更多的沉淀，给使用带来一定的困难。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有的白介素-11半成品溶液的制备所存在的白介素-11溶解度低、易产生沉淀和制剂乳光、活性不稳定等缺陷，提供一种新的白介素-11半成品溶液的制备方法，该制备方法克服了现有技术的缺陷，有利于促进白介素-11溶解，消除微小的丝状沉淀和制剂乳光，保持活性稳定，减少临床使用量。

一种白介素-11半成品溶液的制备方法，包括以下步骤：将白介素-11溶解于终浓度为10mM的磷酸缓冲液中(由磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制，pH7.0)，添加甘氨酸，搅拌，得到混合溶液，用稀碱或稀酸调节混合溶液的pH值；补加注射用水定容，搅拌混匀，即得；其中，采用稀碱将混合溶液的pH值调至为8.0-9.5，或者采用稀酸将混合溶液的pH值调为1.0-6.0；优选的，采用稀碱将混合溶液的pH值调至为8.0或9.5，或者采用稀酸将混合溶液的pH值调为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0或6.0；

更优选的，采用稀酸将混合溶液的pH值调为4.0、5.0或6.0；最优选的，采用稀酸将混合溶液的pH值调为5.0；其中，所述的稀碱优选为0.1mol/L的氢氧化钠，所述的稀酸优选为0.1mol/L的盐酸。

本发明制备方法可以较好解决白介素-11蛋白因其特殊的理化性质，在半成品配制、无菌过滤和分装过程易出现聚集和沉淀的问题。按照本发明制备方法所制备得到的半成品溶液澄清透明，无乳光，主药蛋白定量准确。半成品配制后的无菌过滤易行，滤膜不堵塞，半成品分装过程也不会造成聚集和沉淀。成品复溶后的产品澄清度好，无任何絮状沉淀且不产生乳光，活性保持稳定，临床使用量减少。这对于重组人白介素-11大规模成品生产具有重要意义。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

称量30g甘氨酸(注射级药用辅料)为添加剂，将量取的白介素-11原液(根据原液浓度计算加入，白介素-11终浓度为0.75mg/ml)溶解于终浓度为10mM的磷酸缓冲液(由药用级十二水磷酸二氢钠2.18克和二水磷酸氢二钠0.61克配制，pH7.0)中，搅拌，得到混合溶液；用0.1mol/L的氢氧化钠调节混合溶液的pH值至9.5；补加注射用水至1.0L，搅动混匀，得到产品1。

实施例2

称量30g甘氨酸(注射级药用辅料)为添加剂，将量取的白介素-11原液(根据原液浓度计算加入，白介素-11终浓度为0.75mg/ml)溶解于终浓度为10mM的磷酸缓冲液(由药用级十二水磷酸二氢钠2.18克和二水磷酸氢二钠0.61克配制，pH7.0)中，搅拌，得到混合溶液；用0.1mol/L的氢氧化钠调节混合溶液的pH值至8.0；补加注射用水至1.0L，搅动混匀，得到产品2。

实施例3

称量30g甘氨酸(注射级药用辅料)为添加剂，将量取的白介素-11原液(根据原液浓度计算加入，白介素-11终浓度为0.75mg/ml)溶解于终浓度为10mM的磷酸缓冲液(由药用级十二水磷酸二氢钠2.18克和二水磷酸氢二钠0.61克配制，pH7.0)中，搅拌，得到混合溶液；用0.1mol/L的盐酸调节混合溶液的pH值至6.0；补加注射用水至1.0L，搅动混匀，得到产品3。

实施例4

称量30g甘氨酸(注射级药用辅料)为添加剂，将量取的白介素-11原液(根据原液浓度计算加入，白介素-11终浓度为0.75mg/ml)溶解于终浓度为10mM的磷酸缓冲液(由药用级十二水磷酸二氢钠2.18克和二水磷酸氢二钠0.61克配制，pH7.0)中，搅拌，得到混合溶液；用0.1mol/L的盐酸调节混合溶液的pH值至5.0；补加注射用水至1.0L，搅动混匀，得到产品4。

实施例5

称量30g甘氨酸(注射级药用辅料)为添加剂，将量取的白介素-11原液(根据原液浓度计算加入，白介素-11终浓度为0.75mg/ml)溶解于终浓度为10mM的磷酸缓冲液(由药用级十二水磷酸二氢钠2.18克和二水磷酸氢二钠0.61克配制，pH7.0)中，搅拌，得到混合溶液；用0.1mol/L的盐酸调节混合溶液的pH值至4.0；补加注射用水至1.0L，搅动混匀，得到产品5。

实施例6

称量30g甘氨酸(注射级药用辅料)为添加剂，将量取的白介素-11原液(根据原液浓度计算加入，白介素-11终浓度为0.75mg/ml)溶解于终浓度为10mM的磷酸缓冲液(由药用级十二水磷酸二氢钠2.18克和二水磷酸氢二钠0.61克配制，pH7.0)中，搅拌，得到混合溶液；用0.1mol/L的盐酸调节混合溶液的pH值至3.0；补加注射用水至1.0L，搅动混匀，得到产品6。

实施例7

称量30g甘氨酸(注射级药用辅料)为添加剂，将量取的白介素-11原液(根据原液浓度计算加入，白介素-11终浓度为0.75mg/ml)溶解于终浓度为10mM的磷酸缓冲液(由药用级十二水磷酸二氢钠2.18克和二水磷酸氢二钠0.61克配制，pH7.0)中，搅拌，得到混合溶液；用0.1mol/L的盐酸调节混合溶液的pH值至6.0；补加注射用水至1.0L，搅动混匀，得到产品7。

实施例8

称量30g甘氨酸(注射级药用辅料)为添加剂，将量取的白介素-11原液(根据原液浓度计算加入，白介素-11终浓度为0.75mg/ml)溶解于终浓度为10mM的磷酸缓冲液(由药用级十二水磷酸二氢钠2.18克和二水磷酸氢二钠0.61克配制，pH7.0)中，搅拌，得到混合溶液；用0.1mol/L的盐酸调节混合溶液的pH值至1.0；补加注射用水至1.0L，搅动混匀，得到产品8。

对比实施例1

称量30g甘氨酸(注射级药用辅料)为添加剂，将量取的白介素-11原液(根据原液浓度计算加入，白介素-11终浓度为0.75mg/ml)溶解于终浓度为10mM的磷酸缓冲液(由药用级十二水磷酸二氢钠2.18克和二水磷酸氢二钠0.61克配制，pH7.0)中，搅拌，得到混合溶液；用0.1mol/L的盐酸调节混合溶液的pH值至7.0；补加注射用水至1.0L，搅动混匀，得到对照产品1。

试验例1 本发明产品与对照产品的外观检查和蛋白回收率检测对比试验

一、试验样品

1、供试产品：实施例1-8所制备的产品(产品1-8)；

2、对照产品：对比实施例1所制备的产品(对照产品1)；

二、评价方法

(1)外观检查：将供试产品和对照产品按照药典方法分别进行外观检查(可见异物检测法)。

(2)蛋白回收率检测：将供试产品和对照产品分别取相同体积样品离心。离心后的上清液用Lowry法测浓度，每个样品测三次计算平均值。计算离心后的白介素11蛋白回收率。

试验结果见表1。

表1 供试产品和对照产品的外观和蛋白回收率的对比试验结果

由表1可以看出，当半成品溶液pH值为1-6时，溶液中的丝状悬浮物明显减少，溶液中的乳光现象有显著改善，白介素-11蛋白的回收率高。当半成品溶液pH值为4-6.0时，溶液变为澄清透明，无乳光；当半成品溶液pH值为5.0时，溶液变为澄清透明，无乳光，且白介素-11蛋白回收率接近达到100％。

试验例2 本发明产品与对照产品1的比活性稳定性对比试验

通过表1可以看出，当半成品溶液pH值为4-6时，半成品溶液的澄清度和主药蛋白的回收率都可以达到相关的国家药典的要求。在综合考虑到该产品作为人用的注射剂的适用性和较长期澄清度稳定性，特选择pH值为4.0、5.0或6.0的产品进行下一步的比活性稳定实验。

一、试验样品

1、供试产品：实施例3-5所制备的产品(产品3、产品4，产品5)；

2、对照产品：对比实施例1所制备的产品(对照产品1，pH7.0)；

二、评价方法

比活性稳定性检测：取供试产品和对照产品分别用6.0ml西林瓶分装，按下表2比活性稳定性检查项下的保存条件分别做稳定性实验，每组平行样三个，用B911细胞做活性测定。

试验结果见表2。

表2 供试产品和对照产品的外观、蛋白回收率和比活性稳定性的对比试验结果

由表2可以看出，供试产品3-5在比活性稳定性方面要显著优于对照产品1，此外，供试产品4相比于其它产品，其比活性稳定性尤为突出。