山橿乙酸乙酯部位提取物及其应用

摘要

本发明涉及一种山橿乙酸乙酯部位提取物及其应用，可有效解决制备治疗及预防慢性胃炎，胃溃疡药物的问题，该提取物是取山橿根，粉碎，过筛，取山橿根粉用沸点为60-90℃石油醚回流提取3次，抽滤，弃去滤液，再用乙酸乙酯进行回流提取3次，抽滤，真空减压回收乙酸乙酯，40-60℃浓缩干燥，得干粉，得率为2.48％，本发明提取物制备方法简便，所得有效部位提取物，质量稳定，可有效用于制备治疗及预防脾胃虚寒性胃炎、胃溃疡药物，开辟了山橿制备药物的新领域，是中医药学上的一大创新。

说明书

一、技术领域

本发明涉及医药领域，特别是一种山橿乙酸乙酯部位提取物及其应用。

二、背景技术

山橿Lindera reflexa Hemsl.系樟科山胡椒属植物，为灌木或小乔木。主要分布于河南的大别山区、桐柏山区、江苏、安徽等地，而河南信阳地区分布最广泛，且产量丰富，是山橿的主要产地。山橿根或根皮入药，性温，味辛，具有行气止痛，健脾消积，活血消肿等作用。山橿在长期的临床应用中收到良好的效果，且有很长的应用历史。由于其良好的临床疗效和我省丰富的药材资源，被收入《河南省中药材标准》。

由于山橿资源广泛，价格低廉，临床效果明显，如果其对抗炎、抑制溃疡和镇痛的有效部位、活性成分进行深入研究，并开发成治疗胃病的新药，将会创造显著的经济效益及良好的社会效益。

三、发明内容

针对上述情况，本发明之目的就是提供一种山橿乙酸乙酯部位提取物及其应用，即一种用乙酸乙酯从山橿根中提取的有效部位物质，在制备治疗及预防脾胃虚寒性胃炎、胃溃疡药物中的应用，可有效解决制备治疗及预防慢性胃炎，胃溃疡药物的问题。

本发明是采用极性不同的系统溶剂对山橿依次进行提取，得石油醚部位，乙酸乙酯部位，正丁醇部位，水部位。选取山橿乙酸乙酯部位回收乙酸乙酯，得浸膏，即得用于制备治疗及预防慢性胃炎，胃溃疡药物的山橿有效部位提取物：山橿乙酸乙酯部位提取物，该提取物是取山橿根，粉碎，过24目筛，取山橿根粉用沸点为60-90℃石油醚回流提取3次，第一次、第二次均加入6-10倍量山橿根粉重量体积的石油醚回流提取2-4小时，第三次加入4-8倍量山橿根粉重量体积的石油醚回流提取2-4小时，抽滤，弃去滤液，再用乙酸乙酯进行回流提取3次，第一次、第二次均加入6-10倍量山橿根粉重量体积的乙酸乙酯回流2-4小时，第三次加入4-8倍量山橿根粉重量体积的乙酸乙酯回流2-4小时，抽滤，真空减压回收乙酸乙酯，40-60℃浓缩干燥，得干粉，得率为2.48％，即为山橿根药理有效部位提取物(或称山橿乙酸乙酯部位提取物)。所说的重量体积(W/V)是指固体物以g计，液体物以ml计。

筛选确定山橿活性部位。采用河南省羚锐制药股份有限公司生产的中成药制剂“胃疼宁片”为阳性对照组(胃疼宁片为山橿的水煎煮浸膏、山橿挥发油、鸡蛋壳与蜂蜜制成的中成药)，山橿乙酸乙酯部位提取物为乙酸乙酯部位组，0.9％生理盐水为模型组，分别通过急性胃溃疡模型实验，慢性胃溃疡模型实验，疼痛模型实验，炎症模型实验等来确定具有确切疗效的山橿有效部位。

Wister大白鼠用幽门结扎法造急性胃溃疡模型，用醋酸法造慢性胃溃疡模型，分别用以上各组灌胃给药；通过统计胃溃疡面积和溃疡抑制率来考察山橿有效部位对Wister大白鼠胃溃疡模型的影响。采用扭体法和热板法，分别以扭体次数和痛域值为观察指标来统计山橿有效部位对小鼠疼痛模型的影响。用二甲苯致耳壳水肿炎症模型，以实验小鼠两耳片重量之差为肿胀度，考察山橿有效部位对实验小鼠耳壳水肿炎症模型的肿胀抑制率。

综合考虑对急性胃溃疡模型和慢性胃溃疡模型、疼痛模型、炎症模型的实验结果，可以确定山橿的有效部位为：山橿的乙酸乙酯部位。

本发明的山橿乙酸乙酯部位提取物制备方法简便，所得有效部位提取物，质量稳定，可有效用于制备治疗及预防脾胃虚寒性胃炎、胃溃疡药物，开辟了山橿制备药物的新领域，是中医药学上的一大创新。

四、具体实施方式

以下结合实际情况对本发明的具体实施方式作详细说明。

实施例1

取山橿根，粉碎，过24目筛，取山橿根粉用沸点为60-90℃的石油醚回流提取3次，第一次、第二次均加入6倍量山橿根粉重量体积的石油醚回流提取2小时，第三次加入4倍量山橿根粉重量体积的石油醚回流提取2小时，抽滤，弃去滤液，再用乙酸乙酯进行回流提取3次，第一次、第二次均加入6倍量山橿根粉重量体积的乙酸乙酯回流2小时，第三次加入4倍量山橿根粉重量体积的乙酸乙酯回流2小时，抽滤，真空减压回收乙酸乙酯，45℃浓缩干燥，得干粉，即山橿乙酸乙酯部位提取物。

实施例2

取山橿根，粉碎，过24目筛，取山橿根粉用沸点为60-90℃的石油醚回流提取3次，第一次、第二次均加入8倍量山橿根粉重量体积的石油醚回流提取3小时，第三次加入6倍量山橿根粉重量体积的石油醚回流提取3小时，抽滤，弃去滤液，再用乙酸乙酯进行回流提取3次，第一次、第二次均加入8倍量山橿根粉重量体积的乙酸乙酯回流3小时，第三次加入6倍量山橿根粉重量体积的乙酸乙酯回流3小时，抽滤，真空减压回收乙酸乙酯，50℃浓缩干燥，得干粉，即山橿乙酸乙酯部位提取物。

实施例3

取山橿根，粉碎，过24目筛，取山橿根粉用沸点为60-90℃的石油醚回流提取3次，第一次、第二次均加入10倍量山橿根粉重量体积的石油醚回流提取4小时，第三次加入8倍量山橿根粉重量体积的石油醚回流提取3小时，抽滤，弃去滤液，再用乙酸乙酯进行回流提取3次，第一次、第二次均加入10倍量山橿根粉重量体积的乙酸乙酯回流4小时，第三次加入8倍量山橿根粉重量体积的乙酸乙酯回流4小时，抽滤，真空减压回收乙酸乙酯，60℃浓缩干燥，得干粉，即山橿乙酸乙酯部位提取物。

实施例4

取山橿根粉碎，过24目筛，取山橿根粉500g用沸点为60-90℃的石油醚回流提取3次，第一次、第二次均加入4000ml石油醚回流3小时，第三次加入3000ml石油醚回流3小时，抽滤，弃去滤液，再用乙酸乙酯进行回流提取3次，第一次、第二次均加入4000ml乙酸乙酯回流3小时，第三次加入3000ml乙酸乙酯回流3小时，抽滤，真空减压回收乙酸乙酯，50℃浓缩干燥，得干粉12.4g，即山橿乙酸乙酯部位提取物。

本发明的一种山橿有效部位提取物即山橿乙酸乙酯部位提取物有效用于制备治疗及预防慢性胃炎，胃溃疡的药物，并为试验所证明，有关试验资料如下：

经以下对比试验，结果表明，本发明的山橿有效部位提取物对急性胃溃疡模型和慢性胃溃疡模型、疼痛模型、炎症模型的治疗作用比较稳定：

有效部位的药理模型筛选

1.用胃消化性胃溃疡模型进行药效学筛选，其中包括急性胃溃疡模型(幽门结扎法)和慢性胃溃疡模型(醋酸法)两种：

1.1急性胃溃疡模型(胃溃疡幽门结扎法)：取体重200±20g的Wistar大白鼠30只，雌雄各半，随机分成3组，每组10只，分别为模型组、阳性对照组、乙酸乙酯部位组。模型组：以0.9％生理盐水按20ml/Kg体重剂量灌胃给药。阳性对照组：胃疼宁片以0.225g/Kg剂量每日次灌胃给药(配制11.25mg/ml胃疼宁片溶液按20ml/Kg体重剂量给药)。山橿乙酸乙酯部位喂药组按山橿药材7g/Kg剂量每日次灌胃给药。

连续灌胃7天。用急性胃溃疡模型(幽门结扎法)造模，于造模前48小时禁食不禁水，18小时后脱颈椎处死，剖腹，结扎贲门取胃，向胃内注射1％甲醛溶液10ml，并将胃浸泡于1％甲醛溶液中固定15min后，沿胃大弯剖开，用生理盐水清洗后，观察溃疡的发生情况。用肉眼和放大镜观察胃黏膜面，记录每组产生溃疡的鼠数、溃疡数、每个溃疡面的最大直径、溃疡面积及病变情况等。溃疡指数按Guth标准由每个溃疡面的最大直径计算其溃疡指数，具体标准如下：病变面直径＜1mm计1分，病变面直径在1--1.9mm之间计2分，病变面直径在2--2.9mm之间计3分，病变面直径在3--4mm之间计4分，病变面直径＞4mm者将其分成若干段，每段按上法计分；糜烂宽度＞2mm时则分值×2计。全胃得分为粘膜损伤指数，即溃疡指数。

溃疡抑制百分率＝(模型组溃疡指数-给药组溃疡指数)/模型组溃疡指数

统计学方法：数据统计运用SPSS13.0统计软件，数值变量采用x±s进行统计描述，用单因素方差分析法(One-Way ANOVA)进行分析。由统计结果可知：乙酸乙酯部位组与模型组比较有显著性差异(P＜0.01)；乙酸乙酯部位组与阳性对照组比较没有显著性差异(P＞0.05)。结果见表1-2。

表1-2山橿有效部位对幽门结扎法所致大鼠胃溃疡的影响(x±s)

与模型组比较：**P＜0.01。

1.2慢性胃溃疡模型(醋酸法)：取体重200±20g的Wistar大鼠30只，雌雄各半，半空腹状态下随机分为3组，每组10只，分别为模型组、阳性对照组、乙酸乙酯部位组。采用醋酸法造慢性胃溃疡模型，从手术次日起，分别灌胃给药生理盐水、胃疼宁片溶液(0.225g/Kg剂量)、山橿乙酸乙酯部位提取物(按山橿药材7g/Kg剂量)，每日1次，连续治疗12天，第14天处死，开腹、结扎幽门和贲门，取胃浸于0.01ml/ml甲醛溶液中，固定10分钟。沿胃大弯剪开，将胃外翻，倒掉内容物，用吸管冲掉食物残渣。观察并记录溃疡情况，计算溃疡指数和溃疡抑制百分率。

溃疡指数统计方法、溃疡抑制率计算方法同幽门结扎法。

统计学方法：数据统计运用SPSS13.0统计软件，数值变量采用x±s进行统计描述，用单因素方差分析法(One-Way ANOVA)进行分析。由统计结果可知：乙酸乙酯部位组与模型组比较有显著性差异(P＜0.01)；乙酸乙酯部位组与阳性对照组比较没有显著性差异(P＞0.05)。实验结果见表1-3。

表1-3山橿有效部位对醋酸法所致大鼠胃溃疡的影响(x±s)

与模型组比较：**P＜0.01。

2.用疼痛模型进行药效学筛选，包括扭体法和热板法。

2.1扭体法取体重18-25g的清洁级Wistar小鼠，雌性，实验室适应3天后，取同批次小鼠50只，随机分为3组：模型组(生理盐水组)10只、阳性对照组(胃疼宁组)20只、乙酸乙酯部位组20只。所有动物在进行扭体实验前禁食24h，饮水不限。

模型组小鼠以生理盐水(按20ml/kg剂量)灌胃给药；阳性对照组小鼠以“胃疼宁片”(按0.289g/kg剂量)灌胃给药；乙酸乙酯部位组以山橿乙酸乙酯提取物(按相当于山橿原药材9g/Kg剂量)灌胃给药。连续灌胃5天。于造模前24小时禁食不禁水，各组小鼠灌胃给药120分钟后，腹腔注射0.6％冰醋酸0.15ml/10g，观察给药小鼠扭体反应潜伏期(以腹部收缩、伸展后肢或臀部抬高为扭体反应阳性)记录15分钟内每只小鼠扭体的次数，按下试计算各给药组镇痛抑制率，给药组与模型组进行比较。

镇痛百分率＝(给药组无扭体数-模型组无扭体数)/模型组实际扭体数

统计学方法：数据统计运用SPSS13.0统计软件，数值变量采用x±s进行统计描述，用单因素方差分析法(One-Way ANOVA)进行分析。由统计结果可知：乙酸乙酯部位组与模型组比较有显著性差异(P＜0.01)；乙酸乙酯部位组与阳性对照组比较有差异(P＜0.05)，但没有显著性差异(P＜0.01)。实验结果见表1-4。

表1-4山橿各部位对冰醋酸法所致小鼠扭体反应的影响(x±s)

与模型组比较：**P＜0.01。

2.2热板法

取体重18-25g的清洁级Wistar小鼠，雌性。实验室适应3天后，进行预试：用YLS-6A智能热板仪(55±5)℃筛选热板痛反应时间合格的实验小鼠。随机分为3组：模型组(生理盐水组)10只、阳性对照组(胃疼宁组)20只、乙酸乙酯部位组20只。模型组小鼠以生理盐水(按20ml/kg剂量)灌胃给药；阳性对照组小鼠以“胃疼宁片”(按0.289g/kg剂量)灌胃给药；乙酸乙酯部位组以山橿乙酸乙酯提取物(按相当于山橿原药材9g/Kg剂量)灌胃给药。每天1次，连续5天。小鼠末次灌胃给药后分别在60、120、180分钟时，将小鼠放入热板，测定每鼠痛阈值。

按如下公式计算给药后痛阈提高值：痛阈提高值＝用药后平均痛阈值-用药前平均痛阈值

统计学方法：数据统计运用SPSS13.0统计软件，数值变量采用x±s进行统计描述，用单因素方差分析法(One-Way ANOVA)进行分析。由统计结果可知：乙酸乙酯部位组与模型组比较有显著性差异(P＜0.01)；乙酸乙酯部位组与阳性对照组比较有差异(P＜0.05)，但没有显著性差异(P＜0.01)。结果见表1-5。

表1-5山橿各部位对热板法小鼠痛域值的影响(x±s)

与模型组比较：**P＜0.01；*P＜0.05。

3抗炎实验(小鼠耳廓肿胀法)

取体重18-24g的清洁级Wistar小鼠，雌性，50只，随机分为3组：模型组(生理盐水组)10只、阳性对照组(胃疼宁组)20只、乙酸乙酯部位组20只。模型组小鼠以生理盐水(按20ml/kg剂量)灌胃给药；阳性对照组小鼠以“胃疼宁片”(按0.289g/kg剂量)灌胃给药；乙酸乙酯部位组以山橿乙酸乙酯提取物(按相当于山橿原药材9g/Kg剂量)灌胃给药。每天1次，连续5天。末次给药1.5h后，将二甲苯均匀涂于小鼠右耳前后两面，40μL/只，左耳作自身空白对照。1h后将小鼠脱椎处死，用内径9mm打孔器分别在左、右双耳同一部位打下圆耳片，天平上称重，右耳圆片重量减去左耳圆片重量之差为肿胀度，计算肿胀抑制率。

肿胀抑制率＝(模型组肿胀度-给药组肿胀度)/模型组肿胀度

统计学方法：数据统计运用SPSS13.0统计软件，数值变量采用x±s进行统计描述，用单因素方差分析法(One-Way ANOVA)进行分析。由统计结果显示：山橿乙酸乙酯部位组与模型组比较有差异(P＜0.05)；与阳性对照组比较没有差异(P＞0.05)。结果见表1-6。

表1-6山橿各部位对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响(x±s)

与模型组比较：**P＜0.01；*P＜0.05。

综上所述，表明本发明性能稳定、可靠，有临床意义。山橿根提取的有效山橿乙酸乙酯部位对急、慢性胃溃疡模型有抑制作用并有镇痛抗炎作用，山橿乙酸乙酯部位提取物能够在制备治疗及预防脾胃虚寒性胃炎、胃溃疡、慢性胃炎药物中得到应用。由于其来源于天然植物成分，药理作用明显，毒副作用相对较小，具有开发成为治疗及预防脾胃虚寒性胃炎、胃溃疡、慢性胃炎药物的潜力。