抑制N-酰基乙醇胺水解性酸酰胺酶的组合物和方法

摘要

考虑抑制N-酰基-乙醇胺水解性酸酰胺酶(NAAA)的化合物和药物组合物将提高NAAA底物棕榈酰乙醇酰胺(PEA)的浓度。考虑NAAA抑制将有效减轻与PEA浓度降低有关的疾病。在各种用途之中，特别考虑各种NAAA抑制剂作为炎性疾病治疗中的治疗剂。

说明书

本申请要求我们在2007年10月11日提交的、编号为60/979304的共同未决的美国临时申请的优先权，其引入本文作为参考。

本发明得到国家健康研究所(National Institutes of Health)授予的NIH赠款号DA-12413的政府支持。政府可拥有本发明的某些权利。

技术领域

本发明的领域为与抑制N-酰基乙醇胺水解性酸酰胺酶(NAAA)有关的组合物和方法，并且尤其是当其涉及治疗和预防与脂肪酸乙醇酰胺调制临床相关的疼痛、炎症和其它疾病时。

背景技术

虽然现有技术中已知许多组合物和方法来治疗疼痛和/或炎症，但是仍然存在许多困难。最明显的是，长期给药期间和/或较高剂量下的副作用经常阻止这种药物的成功使用。例如，最近已经暗示某些COX-2抑制剂不利于心血管的情况，而阿司匹林型疼痛药物治疗经常增大肠出血的风险。在其它实例中，布洛芬和醋氨酚往往不利地影响肝功能，特别是在较高的剂量下。

长链脂肪酸的乙醇酰胺(N-酰基乙醇胺(NAE))存在于许多低级生物体、高级生物体和哺乳动物中，具有多种功能。例如，证实花生四烯酸乙醇胺(anandamide)(多元不饱和脂肪酸型NAE)具有大麻素类(cannabimimetic)活性并且据报道其充当TRPV 1(瞬时感受器电位香草酸(vanilloid)型1)的配体。相反，饱和的和单不饱和的NAE作为大麻类(cannabinoid)受体的配体是无活性的。然而，已经报道这种化合物具有许多其它生物活性。例如，N-棕榈酰乙醇胺(PEA)具有抗炎的、抗疼痛的、免疫抑制的、神经保护性的以及抗氧化性的活性。有意思的是，N-棕榈酰乙醇胺的抗炎作用可以通过过氧物酶体增生物(proliferator)活化的受体-α(PPAR-α)的作用来调制。在其它实例中，N-油酰乙醇胺显示为经由PPAR-α减食欲(参见，例如The Journal OfPharmacology And Experimental Therapeutics(2006)，卷318，No.2，第563-570页)，并且N-硬脂酰乙醇胺为促凋亡性的和减食欲性的。

NAE是NAAA的底物，NAAA将NAE催化水解为乙醇胺和相应的脂肪酸。值得注意的是，NAAA的催化活性与类似的酶FAAH(脂肪酸酰胺水解酶)明显不同。在许多不同之中，NAAA的一个特征性特点在于其在约5.0的pH下具有最佳活性。NAAA相对于其它NAE来说还呈现出对于N-棕榈酰乙醇胺(PEA)的实质优选，其通过TRITON X-100^TM(Union Carbide的注册商标；4-辛基-苯酚聚乙氧基化物)和二硫苏糖醇(DTT)活化。值得注意的是，NAAA对于苯基甲基磺酰氟化物和甲基花生酰基氟代磷酸酯的抑制来说具有较低的灵敏度。虽然已经克隆了NAAA的基因并且相对好地表征了相应的多肽(参见，例如J Biol Chem(2005)，卷280，No.12，第11082-11092页)，但是还没有很好地理解NAAA在哺乳动物中的功能性质。

虽然已经在文献(参见，例如Eur J Pharmacol(2007)，565(1-3)；第26-36页；J Enz Inhib and Med Chem(2003)，18(1)，第55-58页；Arch BiochemBiophys(1999)，362(2)，第191-196页)中确认出许多FAAH抑制剂，但是目前没有报道NAAA的抑制剂。而且，由于FAAH和NAAA在结构上不是紧密相关的，预计FAAH抑制剂不会对NAAA具有显著的抑制作用。

因此，虽然现有技术中已知许多治疗和预防疼痛与炎症的组合物和方法，但是所有或者几乎所有的组合物和方法都具有一种或多种缺点。因此，仍然需要提供改进的组合物和方法来治疗和预防疼痛与炎症。

发明内容

本发明涉及使用发明者考虑和确认的各种化合物来抑制NAAA的组合物和方法。最有利的是，这些化合物和组合物将有利于治疗与棕榈酰乙醇酰胺水平降低有关的疾病(condition)，尤其是炎性疾病。

在本发明主题的一个优选方面中，用于治疗与棕榈酰乙醇酰胺水平降低有关的疾病的药物组合物包含式I的化合物和药用载体，

式I

其中A为O或S；B为O、S或NR^a；R₁和R₂独立地为H、卤素、或任选取代的低级烷基；n为0～3的整数；X为O、S、C(O)、NR^b、CHR^b或者不存在；Y为C(O)、C(S)、或CHR^c；Z为O、S、NR^d、或CHR^d；V为任选取代的低级烷基或任选取代的低级烯基；其中W为各自均可任选取代的芳基、杂芳基、环烷基、杂环烷基、或C(R₃R₄R₅)；在一些方面中，Y和V可形成五元环或六元环；最典型地，R^a、R^b、R^c和R^d独立地选自H、任选取代的低级烷基或任选取代的低级硫代烷基；且R₃、R₄和R₅独立地选自H、任选取代的低级烷基、任选取代的低级芳基、任选取代的低级杂环烷基、和任选取代的低级杂芳基。

特别考虑的化合物包括这样的化合物，其中A和B为O，其中X为NR^b且Y为C(O)或C(S)，和/或其中Z为O或CHR^d，V为低级烷基，且其中W为芳基或低级烷基。最优选地，n为1，R₁为H且R₂为低级烷基，和/或W为芳基或低级烷基。进一步优选的化合物包括这样的化合物，其中A为O，B为O或NR^a，X为NR^b且Y为C(O)或C(S)。

因此，治疗具有与细胞、器官或身体部分中棕榈酰乙醇酰胺水平降低有关的疾病的患者的方法包括如下步骤：给药包括以上式I的化合物的药物组合物。最典型地，所述疾病包括炎性部分(inflammatory component)(例如，类风湿性关节炎、骨关节炎、或哮喘)、疼痛、和/或神经变性方面。然后所述组合物的给药在足以降低患者炎症的剂量和方案下进行。从不同的观点看来，所考虑的方法因此还包括将根据以上式I的化合物用于抑制NAAA。在优选的方面中，接触NAAA的步骤在体内进行，和/或所述化合物在小于20uM的IC50下抑制NAAA。

根据以下本发明优选实施方式的具体描述，本发明的各种目的、特征、方面和优势将变得更加明晰。

附图说明

图1A-1C为根据本发明主题的示例性化合物以及它们各自的IC₅₀值。

图2A-2C为说明炎症对浸润嗜中性粒细胞数影响的图(A)、对内源细胞PEA的水平影响的图(B)、以及炎症对PEA的影响的时程图(C)。

图3A-3B为说明外源PEA对浸润嗜中性粒细胞数的影响随着PEA浓度变化的图(A)、以及对PPAR-α野生型和无效突变体小鼠中浸润嗜中性粒细胞数影响的图(B)。

图4为NAAA活性位点的计算机模型的详图。

图5为描述通过根据本发明主题的选定化合物抑制NAAA的图。

图6A-6C为说明示例性NAAA抑制剂对于浸润嗜中性粒细胞数(A)、内源PEA的数量(B)、以及PPAR-α野生型和无效突变体小鼠中浸润嗜中性粒细胞数(C)的影响的图。

图7描述了经过和未经过NAAA抑制剂处理的动物以及对照动物中用选定标记物染色的脊髓损伤之后的组织切片的显微照片。

具体实施方式

本发明涉及NAAA抑制的化合物、组合物和方法，尤其是适合用于治疗与细胞、器官或其它身体结构(或者甚至整个身体)中降低的PEA水平有关的各种疾病的化合物、组合物和方法。最优选地，这种调制将导致疼痛、炎症和其中异常NAE水平与失调有关的其它疾病的治疗和/或预防。在进一步考虑的方面中，根据本发明主题的抑制剂和方法还被认为可用于研究其中PEA起调节或调制作用的机理和途径。

考虑的化合物

本文中总体考虑的化合物将具有以竞争性、非竞争性、变构性或其它方式有效抑制NAAA的结构。最优选地，根据本发明主题的化合物将在相对低浓度(例如，等于或小于50uM的IC₅₀)下抑制NAAA。其它合适的选择之中，尤其优选的化合物具有式I的结构：

式I

其中A为O或S；B为O、S或NR^a，其中R^a为H、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、卤素、硝基、羟基、烷氧基、烯氧基、氰基、羧基、烷氧基羰基、羧基烷基、氨基、酰氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、N-烷基、N-环烷基、氨基、硫基、烷硫基和卤代烷基(所有这些均可任选地被取代)；n为0～3的整数，其中所形成的饱和或不饱和C1-3可任选地在独立的位置被R₁和R₂取代，其中R₁和R₂独立地为如上所定义的R^a；Q如以上R^a一样定义；X为O、S、C(O)、NR^b、或CHR^b，或者不存在，其中R^b如以上Ra一样定义；Y为C(O)、C(S)、或CHR^c，或者不存在，其中R^c如以上Ra一样定义；Z为O、S、NR^d、或CHR^d，或者不存在，其中R^d如以上Ra一样定义；V为任选取代的低级烷基或任选取代的低级亚烷基或者不存在；W为H，或者各自均可任选被取代的芳基、杂芳基、环烷基、杂环烷基或C(R₃R₄R₅)，其中R₃、R₄和R₅独立地为如上所定义的R^a；且其中Y和V可任选地形成任选被取代的五元环、六元环或七元环。

在尤其优选的方面中，A和B为O，和/或X为NR^b且Y为C(O)或C(S)。另外或者替代地，考虑Z为O或CHR^d，V为低级烷基，且其中W为芳基或低级烷基，和/或n为1，R₁为H且R₂为低级烷基。更进一步优选的化合物包括其中A为O、B为O或NR^a、X为NR^b且Y为C(O)或C(S)的那些。在本发明主题的更进一步考虑的方面中，X-Y可一起形成-CH＝CH-或CH＝CJ，其中J为卤素，特别是当Z＝-CHR^d或不存在时。更进一步考虑的是Y-Z-V可通过除去Z变为Y-V，或者通过除去Z和V变为Y。类似地，Z-V-W可通过除去V变为Z-W。更进一步考虑的化合物包括所有的A＝C-B-键的(例如酸性或碱性)水解断裂产物。

更进一步考虑的化合物包括根据如下所示式II和III的那些：

   式II                       式III

其中B为O、S或NR^a，其中R^a为H、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、卤素、硝基、羟基、烷氧基、烯氧基、氰基、羧基、烷氧基羰基、羧基烷基、氨基、酰氨基、烷基氨基、二烷基氨基、环烷基氨基、N-烷基、N-环烷基、氨基、硫基、烷硫基和卤代烷基(所有这些可任选地被取代)；n为0～3的整数，其中所形成的饱和或不饱和C1-3可任选地在独立的位置被R₁和R₂取代，其中R₁和R₂独立地为如上所定义的R^a；Q如以上Ra一样定义；X为O、S、C(O)、NR^b、或CHR^b，或者不存在，其中R^b如以上Ra一样定义；Y为C(O)、C(S)、或CHR^c，或者不存在，其中R^c如以上Ra一样定义；Z为O、S、VR^d、或CHR^d，或者不存在，其中R^d如以上Ra一样定义；V为任选取代的低级烷基或任选取代的低级亚烷基或者不存在；W为H，各自均可任选被取代的芳基、杂芳基、环烷基、杂环烷基或C(R₃R₄R₅)，其中R₃、R₄和R₅独立地为如上所定义的R^a；且其中Y和V可任选地形成任选被取代的五元环、六元环或七元环。

应该更进一步地认识到，当存在立构中心时，考虑所有的异构体及其混合物。类似地，当存在双键时，双键每一侧的自由基的取向可以为顺式或反式。图1A-1D描述了根据本发明主题的各种示例性优选化合物。

本文中使用的术语“卤素”是指氟、溴、氯或碘，其通常与另一原子(例如，碳)共价键合。本文中还使用的术语“羟基”是指-OH基团。本文中此外还使用的术语“羰基原子”是指共价键合有三个原子的碳原子，其中三个原子之一通过双键(其可部分离域)与碳原子键合。因此，特别考虑的羰基原子包括氧代基、醛基、甲酰胺基、甲脒基和硫代甲酰胺基中的碳原子。

本文中使用的术语“烷基”是指环状、支链或直链烃，其中所有的碳-碳键均为单键，并且术语“低级烷基”是指1～10个碳原子的环状、支链或直链烷基(例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基(或2-甲基丙基)、环丙基甲基、异戊基、正戊基、己基等)。本文中使用的术语“亚烷基”是指比相应烷烃少两个氢原子的烷基(即，C_nH_2n)。例如，合适的亚烷基包括亚甲基、亚乙基、亚丙基等。本文中使用的术语“环烷基”是指含有3～15个碳的环烷基或多环烷基。对于多环基团来说，这些可为其中末端环之一可为芳族的多稠环(例如，茚满基、四氢萘等)。本文中使用的术语“烷芳基”是指与芳基部分共价连接的烷基。例如，在本文提供的定义中苄基被认为是烷芳基。

类似地，本文中使用的术语“烯基”是指其中至少一个碳-碳键为双键的烷基。因此，术语“低级烯基”包括具有1～10个碳原子的所有烯基。本文中使用的术语“环烯基”是指含有3～15个碳和至少一个双键的环状或多环基团。同样地，本文中使用的术语“炔基”是指其中至少一个碳-碳键为三键的烷基或烯基。因此，术语“低级炔基”包括具有1～10个碳原子的所有炔基。

本文中另外还使用的术语“烷氧基”是指-OR基，其中R为低级烷基、取代的低级烷基、酰基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳基烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基或取代的杂环烷基。类似地，术语“芳氧基”是指-OAr基团，其中Ar为芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基。

而且，术语“芳基”是指具有至少一个芳环的芳族碳环基团(例如，苯基或联苯基)或者其中至少一个环为芳族的多稠环(例如，1，2，3，4-四氢萘基、萘基、蒽基或菲基)。本文中使用的术语“杂原子”是指除了碳以外的原子(例如，S、O或N)，其可任选地被如下所取代，例如氢、卤素、低级烷基、烷氧基、低级烷硫基、三氟甲基、氨基、酰氨基、羧基、羟基、芳基、芳氧基、杂环、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、烷硫基、巯基、磺酰胺基等。

更进一步地，本文中使用的术语“取代的”是指与基团或原子(或者原子的自由电子对或双键电子对)共价键合的氢原子被共价键合的非氢取代基所替代，所述取代基包括羟基、巯基、烷硫基、卤素、烷氧基、氨基、酰氨基、硝基、羧基、环烷基、杂环、杂环烷基、酰基、羧基、芳基、芳氧基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基、烷基、烯基、炔基和氰基。

本文中使用的术语“前药”是指考虑的化合物的改性，其中经改性的化合物呈现较少的药理活性(与经改性的化合物相比)并且其中经改性的化合物在目标细胞(例如，B细胞)或目标器官/组织结构(例如，关节)中转化回到改性的形式。例如，考虑的化合物到前药的转化可用于如下情况：其中活性药物毒性太高而难以安全全身给药，或者其中考虑的化合物很难被消化道或者其它区室或细胞吸收，或者其中考虑的化合物在到达其目标之前被身体所分解。因此，应该认识到，根据本发明主题的化合物可以许多方式改性，并且尤其优选的改性包括改善一个或多个药物代谢动力学和/或药效参数的那些。例如，可加入或替换一种或多种取代基以实现血清中较高的AUC。

另一方面，并且尤其是当希望提高的溶解度时，可加入亲水基团。更进一步地，当考虑的化合物含有可以水解(或者断裂)的一个或多个键时，也特意考虑反应产物。将考虑的化合物转化为相应的前药形式的合适的示例性方案可以在Kenneth B.Sloan的″Prodrugs(Drugs and the Pharmaceutical Sciences：a Series of Textbooks and Monographs)″(ISBN：0824786297)和Bernard Testa，Joachim M.Mayer的″Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism：Chemistry，Biochemistry，and Enzymology″(ISBN：390639025X)中找到，这两本书引入本文作为参考。而且，尤其是在当考虑的化合物在代谢(例如，水解、羟基化、葡萄苷酸化(glucuronidate)等)时具有较高活性的情况下，应该认识到，在本文中也特意考虑所考虑化合物的代谢产物。

取决于具体目的(例如，止痛、抗炎)，应该认识到考虑的化合物可与至少一种其它药物活性成分组合(在体内或者在药物配方或者给药疗法中)，尤其考虑的其它成分包括各种镇痛药(例如，类罂粟碱、布洛芬型药物、醋氨酚型药物、阿司匹林型药物等)、各种免疫抑制剂和/或抗炎药物(例如，类固醇和NSAIDS)等。第二药物活性成分的浓度通常为针对单独给药所推荐的浓度或者优选低于该推荐的浓度，但是较高的浓度也被认为适合用于本发明。

因此，考虑的药物组合物将尤其包括其中考虑的化合物(以及其它药物活性成分)具有合适的载体的那些，其中考虑的化合物优选以将生物体和/或目标器官中的脂肪酸乙醇酰胺浓度有效地调节至如下程度的浓度存在，所述程度为有效地减轻并更优选治疗与异常水平脂肪酸乙醇酰胺有关的疾病的体征和症状。从不同的角度看来，考虑的化合物以有效地减轻疼痛和/或炎症的量存在于组合物中。

因此，取决于具体用途和结构，根据本发明主题的考虑的化合物存在于组合物中的量为每单剂量单位1微克～1000毫克，更典型地为10微克～500毫克，最典型地为50微克～500毫克。因此，考虑的化合物在体内或体外的优选浓度通常为0.1nM～500uM，更典型地为50nM～400uM，最典型地为100nM～200uM。

而且，应该认识到，所有配方均被认为适合用于本发明，并且尤其包括口服和非肠胃配方。例如，对于口服给药来说，考虑的组合物可为片剂、胶囊、混悬液或液体的形式。所述药物组合物优选制成含有特殊量的活性成分的剂量单位的形式。这种剂量单位的实例为片剂或胶囊。活性成分也可作为组合物注射给药，其中例如盐水、葡萄糖或水可用作合适的载体。在尤其优选的方面中，考虑的是配方适合用于局部给药、经由气溶胶给药和用于鞘内给药。因此，尤其合适的配方可为用于局部喷雾或滴剂给药的无菌水溶液，或者作为酊剂应用。或者，合适的局部配方包括乳膏、软膏、泡沫状物、洗剂、乳液等。而且，当化合物配制用于鞘内给药时(例如，在脊髓损伤的治疗中)，优选将所述化合物制备为可注射溶液、混悬液或乳液。在更进一步考虑的配方中，考虑的化合物可配制用于气溶胶递送(例如，微粉化、涂布在可分散的载体上、溶解在雾化溶剂中等)。

应该认识到，具体配方和载体的选择将至少部分取决于化合物的特定用途和类型。现有技术中已知许多方式的药物配方，并且认为它们全部适用于本发明(参见，例如Mark Gibson的Pharmaceutical Preformulation andFormulation：A Practical Guide from Candidate Drug Selection to CommercialDosage Form；Informa HealthCare，ISBN：1574911201；或者Robert O.Williams、David R.Taft和Jason T.McConville的Advanced Drug FormulationDesign to Optimize Therapeutic Outcomes；Informa HealthCare；ISBN：1420043870)。

治疗性活性化合物的给药量和本发明的化合物和/或组合物用于治疗疾病的给药方案取决于多种因素，包括受试者的年龄、体重、性别和医疗条件，疾病的严重性，给药的途径和频率，以及所采用的具体化合物，因此可在宽范围内变化。然而，以上提供了尤其合适的量，因此可允许每日剂量为约0.001(或甚至更少)～100mg/kg体重，优选为约0.01～约50mg/kg体重，最优选为约0.1～20mg/kg体重。通常，每日剂量可以每天1～4次的剂量给药。

为了治疗或预防的目的，考虑的化合物通常与一种或多种适于标明的给药途径的载剂组合。如果口服给药，所述化合物可与乳糖、蔗糖、淀粉粉末、链烷酸的纤维素酯、纤维素烷基酯、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、明胶、阿拉伯胶、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和/或聚乙烯醇混合，然后片剂化或胶囊化以方便给药。这种胶囊或片剂可含有控释配方，所述控释配方可以活性化合物在羟基丙基甲基纤维素中的分散体提供。非肠胃给药的配方可为含水或无水等渗无菌注射液或混悬液的形式。这些溶液和混悬液可由无菌粉末或颗粒制备，所述无菌粉末或颗粒具有针对在口服给药配方中使用而提及的一种或多种载体或稀释剂。所述化合物可溶解在水、聚乙二醇、聚丙二醇、乙醇、玉米油、棉籽油、花生油、麻油、苯甲醇、氯化钠和/或各种缓冲剂中。其它载剂和给药模式在制药领域是公知的。

考虑的用途

通常考虑的是，根据本发明主题的化合物和组合物可用于影响与异常水平(例如，在相应的测试部位，相对于健康人中的平均PEA水平偏离至少10％)的NAE有关的或者其中为了特殊目的希望调节这种化合物的正常水平的任何疾病。因此，从不同的角度看来，考虑的化合物可用于治疗其中在治疗上希望提高棕榈酰乙醇酰胺水平的疾病。因此，特别考虑的疾病包括对NAE的变化敏感的那些。例如，考虑的化合物和组合物可用于预防和/或治疗疼痛、炎症、癌症和代谢疾病。进一步考虑的疾病包括神经系统紊乱，且尤其是涉及神经炎症、阿尔茨海默病、哮喘、皮炎、过敏性肠综合征(IBS)、克罗恩氏病(Crohn′s Disesase)和食欲障碍。

因此，用考虑的化合物和组合物治疗的疾病尤其包括疼痛、炎症和神经变性疾病。在其它实例之中，这种疾病可包括神经性疼痛、三叉神经痛、带状疱疹后神经痛、糖尿病性神经病、癌症疼痛、幻肢痛、复杂区域疼痛综合征和纤维肌痛；类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎、腱炎、牛皮癣、法伯尔病、克罗恩氏病、鼻炎、皮肤过敏症、哮喘和带有炎性部分的自身免疫性疾病例如多发性硬化症和其它脱髓鞘性(demylenating)疾病；阿尔茨海默病、外伤性脑损伤。可通过异常NAE水平表征的并可使用所考虑的化合物的其它疾病包括各种代谢紊乱、食欲调节和肥胖症。

更进一步考虑的用途包括其中根据本发明主题的化合物和组合物用于体内和体外抑制研究以确定化合物相对于NAAA抑制的结构-功能关系。替代地，或者另外，还应该认识到，考虑的化合物和组合物可用于抑制NAAA和/或在途径中激活或调制信号传递的各种方法，在所述途径中PPAR-α参与信号转导或其它处理。

考虑的示例性化合物的合成

由N-Boc-L-丝氨酸(1)制备URB783，N-Boc-L-丝氨酸(1)在三信反应中环化以产生2，对2进行脱保护和成盐作用以提供甲苯磺酸盐3。使甲苯磺酸盐3与3-苯基丙酰氯反应以提供URB783。URB894得自3与4-联苯碳酰氯之间的反应，4-联苯碳酰氯通过用草酰氯处理4-苯基苯甲酸得到。

(S)-(2-氧代氧杂环丁烷-3-基)氨基甲酸叔丁基酯(2)：向保持在-50℃、N₂下的无水PPh₃(在P₂O₅的存在下真空保持72h)(5mmol)在无水CH₃CN(31mL)中的搅拌溶液加入偶氮二羧酸二甲酯(5mmol)，20分钟之后，逐滴加入1(4.47mmol)在CH₃CN(10.4mL)中的溶液。所述混合物在-50/-35℃下搅拌1.5小时并浓缩。通过快速色谱法(flash-chromatography)(环己烷/EtOAc 8∶2～6∶4)对残留物进行纯化，得到粗产物2，对2进行最终清洗并研磨以得到白色固体，Mp为120～122℃(Et₂O)。[α]_D²⁰＝-27°(c 0.1，CH₃CN)。¹H NMR与文献(Arnold等人，1985)一致。

(S)-2-氧代氧杂环丁烷-3-基-4-甲苯磺酸铵(3)：在10分钟期间，向保持在0℃、N₂下的2(1.34mmol)和无水对甲苯磺酸(在P₂O₅的存在下真空保持72h)(1.43mmol)的搅拌混合物中逐滴加入三氟乙酸(3mL)。使所述溶液在搅拌下在0℃下反应15分钟，达到室温，并在低于30℃的温度下浓缩。将油状残留物在真空下保持1小时，对所得白色固体进行研磨并用无水二乙醚清洗，然后在真空下保持24小时。得率为81％。Mp和¹H NMR与文献(Arnold等人，1988)一致。

(S)-N-(2-氧代氧杂环丁烷-3-基)-3-苯基丙酰胺(URB783)：向保持在0℃、N₂下的3(0.4mmol)在无水CH₂Cl₂(2mL)中的搅拌混合物中逐滴加入Et₃N(1.59mmol)和3-苯基丙酰氯(0.6mmol)。使该混合物在0℃下反应30分钟并在室温下反应2小时，然后浓缩。通过快速色谱法(环己烷/EtOAc 1∶1～3∶7)对残留物进行纯化并进行重结晶，得到作为白色固体的URB783。得率为60％。Mp为104～106℃(丙酮/石油醚)。[α]_D²⁰＝-13°(c 0.5，MeOH)。MS(EI)：m/z 219(M⁺)，91(100)。IR(努乔尔(Nujol))3333、1832、1625、1541cm^-1；¹H NMR(CDCl₃)δ2.57(br s，1H)、2.99(t，2H)、4.34(t，1H，J＝5Hz)、4.43(dd，1H，J₁＝5Hz，J₂＝6.5)、5.14(m，1H)、5.96(br s，1H)、7.18-7.36(m，5H)ppm。¹³C NMR(CDCl₃)：δ31.2(CH₂)、37.7(CH₂)、58.4(CH)、66.1(CH₂)、126.5(CH)、128.3(2CH)、128.7(2CH)、140.2、168.4(C＝O)、172.5(C＝O)ppm。

(S)-N-(2-氧代氧杂环丁烷-3-基)联苯-4-甲酰胺(URB 894)：向保持在0℃、N₂下的联苯-4-羧酸(2.1mmol)在无水CH₂Cl₂(5.3mL)和无水DMF(1mL)中的溶液中加入草酰氯(0.3mL，3.13mmol)。使该混合物在0℃下反应20分钟并在室温下反应2小时，然后浓缩，得到淡黄色固体联苯-4-碳酰氯粗产物。将一定量的这种样品(2mmol)溶解在无水THF(20mL)中，并在0℃下将所得溶液逐滴加入通过在N₂中在0℃下混合3(1.3mmol)、Et₃N(1.143mL，8.2mmol)和无水THF(3mL)得到的悬浮液中。使所得混合物在0℃下反应30分钟并在室温下反应3小时，然后蒸发。通过快速色谱法(环己烷/EtOAc 1∶1)进行纯化并进行重结晶，得到象牙色固体的纯URB894。得率为46％。Mp为218～220℃(丙酮/石油醚；密封毛细管；从146℃开始注意到样品的分解伴随着颜色改变和块的缩小)；[α]_D²⁰＝-20°(c 0.55，CH₃CN)。MS(EI)：rn/z 267(M⁺)，222、181、167(100)。IR(努乔尔)3270、1827、1641、1540cm^-1；¹H NMR(d₆-丙酮)δ4.53-4.65(m，2H)、4.50-4.59(m，1H)、7.38-7.55(m，3H)、7.70-7.84(m，4H)、8.00-8.07(m，2H)、8.68(br d，1H，J＝7Hz)ppm。¹³C NMR(d₆-丙酮)δ58.8、65.1、126.9、127.0、128.0、128.1、129.0、131.9、139.7、144.4、166.4、169.2ppm。

实施例

本发明人和其它人的在先研究已经表明，PEA通过活化炎性和神经性疼痛模型两者中的核受体过氧物酶体增生物活化受体α(PPAR-α)产生快速广谱的镇痛作用。最近的研究表明，发炎组织(例如，类风湿性关节炎和骨关节炎患者的滑膜液)中PEA水平降低，这表明这种生物活性脂质可能参与炎症应答的调控和/或促成慢性炎症状态。

支持这种可能性的是，本发明人已经发现在炎症期间恢复PEA水平强烈地缓解炎症。这些结果使人想到通过抑制PEA降解以恢复发炎组织中正常的PEA水平来减轻炎症和疼痛的新型原理策略。在本申请中，本发明人已经开发出N-酰基乙醇胺水解性酸酰胺酶(NAAA)的一类有效的和选择性的抑制剂，该NAAA为负责降解PEA的酶。

炎症降低内源PEA的水平

内源PEA对于炎性过程的作用基本上仍然是未确定的。然而，若干证据表明内源PEA可能参与炎症。本发明人以前已经指出，促炎症佛波酯(12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA))在皮肤炎症之后降低真皮PEA水平。这些发现提出了这样的可能性，即炎症期间降低的PEA水平可能容许炎性过程的发展。为了进一步研究该问题，本发明人评估了小鼠中角叉藻聚糖诱发的炎症对于PEA水平的影响。通过外科手术将注入有载体(盐水中10％DMSO)或角叉藻聚糖(1％)的聚乙烯海绵植入到小鼠的背侧皮肤下。三天之后，将小鼠处死，移除该海绵，并分析炎性细胞浸润和细胞PEA含量。在经过角叉藻聚糖处理的动物中，浸润细胞(原发嗜中性粒细胞)的数量大约提高到三倍，这可以从图2中得出。这里，在Swiss小鼠的背侧皮肤下通过外科手术植入浸透有载体(v)或角叉藻聚糖(c)的海绵3天使得(A)浸润嗜中性粒细胞数提高以及(B)内源细胞PEA的水平降低。载体(空心符号)或角叉藻聚糖(实心符号)对于PEA水平的影响的时程**P＜0.01或***P＜0.001vs.V，t检验或ANOVA，之后视需要进行Dunnett事后分析(post-hoc)(n＝6)。

进一步的研究表明(数据未示出)，发炎组织中PEA的减少至少部分是由于抑制N-酰基磷脂酰基-乙醇胺-特异性磷脂酶D(NAPE-PLD)的白细胞表达。缺乏NAPE-PLD的小鼠通过补偿酶途径产生PEA，其不会响应炎性激发降低PEA水平并且对于这种激发呈现出减弱的反应性。N-酰基乙醇胺-水解性酸酰胺酶(NAAA)的抑制剂防止PEA水平降低并因此钝化由炎性刺激所诱发的应答。这种试剂的抗炎作用被内源PEA模仿并通过PPAR-α缺失而被消除。因此，应注意该结果强烈表明白细胞中PPAR-α的PEA活化起到阻止或者甚至抑制炎症发展的早期停止信号的作用。

使用外源PEA恢复PEA水平减轻炎症

作为确定内源PEA在炎症中的作用的第一步，本发明人检查了局部施用PEA对于炎性应答的影响。将注入有载体，或者角叉藻聚糖(1％)、和载体(盐水中10％DMSO)或各种剂量的PEA(0.1～50μg)的聚乙烯海绵通过外科手术植入到小鼠的背部皮肤下。三天之后，处死小鼠，除去海绵并分析细胞浸润。PEA剂量依赖性地减少浸润细胞的数量(如图3所示)以及野生型小鼠中的水肿(数据未示出)，但是对于无PPAR-α(PPAR-α-null)的动物来说没有影响。这里，图片(A-B)描述了载体(空心条)、角叉藻聚糖(实心条)或PEA(0.1-50μg)(黑色条)在Swiss小鼠中的作用；PEA(50μg)在PPAR-α-/-小鼠中的作用，所述作用以进入注射有载体、角叉藻聚糖(1％)或PEA的聚乙烯海绵(尺寸)中的浸润炎性细胞数来评分，所述各聚乙烯海绵植入(A)Swiss小鼠或(B)野生型C57BL6小鼠(+/+)或PPAR-α/-小鼠的背部皮肤下三天。**P＜0.01或***P＜0.001vs.V，##P＜0.01vs.角叉藻聚糖对照。ANOVA，之后视需要进行Tukey或Dunnett事后分析(n＝6)。因此，应该认识到，外周炎症与浸润细胞中降低的PEA合成有关，并且通过外源PEA给药恢复PEA水平减少炎性应答。

设计NAAA抑制剂

NAAA属于胆酰甘氨酸水解酶家族，该家族是Ntn(N-端亲核体)氨基水解酶超家族的亚组。这些酶专门切割线型酰胺并且在它们的氨基酸序列的第一位置具有起负责催化进攻的亲核试剂作用的半胱氨酸、丝氨酸或苏氨酸。在NAAA的情况下，亲核残基很可能为Cys131。实验证据表明，天然NAAA蛋白质经历包括最初130个残基蛋白水解断裂的成熟过程，产生232个氨基酸的蛋白质，其中Cys131变为N-端，这是其它Ntn水解酶常观察到的情况。

最近，通过X射线晶体学解析了Ntn家族成员结合胆汁酸水解酶(CBAH)的结构。NAAA和CBAH的氨基酸序列的比对揭示出这两种酶的结合位点之间高度的序列同源性。使用CBAH的同等物(coordinate)作为模板，通过比较建模建立NAAA模型。根据图4所示的这种模型，通过催化性亲核半胱氨酸131在PEA上的进攻所形成的四面体中间体由于PEA的羰基氧与酶氧阴离子空穴(oxyanion hole)之间的静电相互作用而稳定，该酶氧阴离子空穴部分通过天冬酰胺292的侧链酰胺和天冬酰胺209的主链酰胺形成。此外，以酪氨酸151和其它残基为轮廓的疏水口袋可容纳PEA柔性酰基链。

这些预测通过沿着催化侧排列的这些氨基酸的定点诱变而得到证实。例如，用丙氨酸替代Cys131、Ser133、Asp150、Tyr151或Asn292完全消除了NAAA在体外的活性，而外周残基的突变则没有这种效果(数据未示出)。基于这些结果，本发明人设计了第一系列NAAA抑制剂，其包括与内酯首基(以靶向活性半胱氨酸残基)连接的疏水骨架(以模拟PEA的脂族脂肪酸部分)。本发明人进而合成并测试了许多化合物，其中一些以亚微摩尔的效力(sub-micromolar potencies)抑制重组体NAAA(图1A-C，图5)。两种最有效的化合物(URB783和URB894)分别以420±20nM和115±13nM的IC₅₀值抑制NAAA(图1A-C，图5)。

NAAA抑制恢复PEA水平并减轻炎症

本发明人使用小鼠角叉藻聚糖模型评价NAAA抑制剂URB783对于炎症的作用。如前所示，暴露于角叉藻聚糖刺激的细胞浸润(图6A)产生水肿(数据未示出)，并明显减少内源PEA水平(图6B)。在海绵中包括化合物URB783将PEA恢复至基础水平(图6B)并明显减少浸润细胞数(图6A)和渗出液体积(数据未示出)。值得注意的是，选择性FAAH抑制剂URB597在这种模型中不具有抗炎作用，这表明FAAH在炎症期间不参与调节PEA。化合物URB783的作用很可能通过内源PEA活化PPAR-α而产生，因为在无PPAR-α的小鼠中不存在这些效果(图6C)，并且不抑制NAAA的URB783的手性类似物化合物URB818未再现这些效果(数据未示出)。

更具体地说，图片(A，C)说明炎性细胞计数而图片(B)显示海绵中的PEA水平，该海绵通过外科手术植入(A-B)Swiss小鼠或(C)野生型C57BL6小鼠(+/+)或敲除PPAR-α的小鼠(-/-)的背部皮肤下三天之后从小鼠中取出。聚乙烯海绵(1cm³)注射有载体(100μl水∶DMSO(9∶1)，V，空心条)、角叉藻聚糖(1％，实心条)、URB597(30μg)和URB783(30μg)，如示出的。**P＜0.01或***P＜0.001vs.V，##P＜0.01vs.角叉藻聚糖。ANOVA，之后视需要进行Tukey或Dunnett事后分析(n＝5～7)。

NAAA分析

在0.2ml磷酸氢二钠缓冲液(50mM，pH 5.0)中在37℃下温育重组体NAAA或天然大鼠肺NAAA30分钟，其中该磷酸氢二钠缓冲液含有0.1％Triton X-100、3mM二硫代苏糖醇(DTT)和50mM十七碳烯酰基乙醇酰胺作为底物。反应通过添加0.2ml含有1nM十七酸(HDA，NuChek Prep，Elysian，MN)的冷甲醇而终止。通过LC/MS(液相色谱/质谱)分析样品。以2.2ml/min在XDB Eclipse C18柱上均等地洗脱十七酸1分钟，使用95％甲醇和5％水的溶剂混合物，这两者均含有0.25％乙酸和5mM醋酸铵。柱温为50℃。ESI为负离子模式，毛细管电压为4kV，且裂解(fragment)电压为100V。N₂用作干燥气体，其流速为13升/分钟且温度为350℃。喷雾器压力设置为60psi。使用十七酸作为内标以SIM模式监测[M-H]。使用商用十七碳烯酸(Nu-ChekPrep，m/z＝267)产生标准曲线。

脊髓损伤

在脊髓损伤(SCI)模型中，通过T5-T8四节段椎板切除术暴露的脊髓切片的硬膜外压迫，导致从SCI 24小时之后的小鼠收集的脊髓组织的白质和灰质中Schwann细胞核中和炎性细胞中iNOS表达明显提高。在从假手术(sham)小鼠得到的脊髓中没有检测到iNOS染色。SCI之后给药NAAA抑制剂URB783明显降低iNOS以及这种模型引起的炎症和细胞凋亡的其它标记物的表达，所述其它标记物包括蛋白酶活化受体(PAR)、硝基酪氨酸、Fas-配体、Bax、Bcl-2和末端脱氧核苷酸转移酶介导的UTP末端标记(TUNEL)。典型的实验方案如下所述。

将小鼠随机分为四组(n＝40个动物/组)。假手术动物经历外科手术工序，除了不施用动脉瘤夹，且在外科手术工序1小时和6小时之后以载体(盐水)或3(30μg/小鼠)在脊髓T5-T8节段进行局部处理。其它小鼠经历SCI(如下所述)并且在SCI 1小时和6小时之后以载体(盐水)或3(30μg/小鼠)在脊髓T5-T8节段进行局部处理。在SCI 24小时之后处死每组的小鼠以收集样品用于如下所述的参数评价。

使用水合氯醛(400mg/kg体重)麻醉小鼠。我们使用Rivlin和Tator(Rivlin和Tator，1978)所述的夹压迫模型并通过T5-T8四节段椎板切除术暴露的SC切片的硬膜外压迫产生SCI，其中T5的显性棘突用作外科手术引导。选择六节段椎板切除术以加速及时收获并得到足够的SC组织用于生物化学检查。使用在两侧方向定向的动脉瘤施夹钳(clip applicator)，在T5-T8节段硬膜外施用24g闭合力的动脉瘤夹。然后使用施夹钳快速释放该夹子，导致SC压迫。在受伤的组中，脊髓压迫1分钟。外科手术之后，皮下给药1.0ml盐水以替代外科手术期间损失的血液体积。在麻醉恢复期间，将小鼠放置在温暖的加热垫上并盖上温热毛巾。将小鼠在10天的存活期内单独放置在27℃的温控室中。无限制地为小鼠提供食物和水。这段时期内，每天人工排泄动物的膀胱两次直至小鼠能够恢复正常的膀胱功能。假手术受伤的动物只进行椎板切除术。

PAR、硝基酪氨酸、FAS-配体、Bax、Bcl-2和iNOS的免疫组织化学定位。SCI 24小时之后，通过脊髓切片中的免疫组织化学分析来测量硝基化应激(nitrosative stress)的特异性标记物硝基酪氨酸以确定“过亚硝酸盐形成”和/或SCI期间产生的其它氮衍生物的定位。SCI 24小时之后，将所述组织固定在10％(w/v)PBS-缓冲的甲醛中并由石蜡包埋的组织制备8mm切片。去石蜡化之后，用60％(v/v)甲醇中0.3％(v/v)的过氧化氢使内源过氧物酶骤冷30分钟。用PBS中0.1％(w/v)的Triton X-100渗透所述切片20分钟。通过将所述切片在PBS中2％(v/v)的正常山羊血清中温育20分钟使非特异吸附最小化。分别通过用生物素和抗生物素蛋白(DBA)连续温育15分钟来阻断内源生物素或卵蛋白结合位点。用抗PAR(Alexis；PBS中1∶500，v/v)、抗iNOS抗体(PBS中1∶500，v/v)、抗硝基酪氨酸兔多克隆抗体(Upstate，PBS中1∶500，v/v)，用抗FAS-配体抗体(Abcam，PBS中1∶500，v/v)、抗Bax抗体(Santa CruzBiotechnology，PBS中1∶500，v/v)，或者用抗Bcl-2多克隆抗体(Santa CruzBiotechnology，PBS中1∶500，v/v)将所述切片温育过夜。用PBS清洗切片，并用二次抗体温育。用生物素结合的山羊抗兔IgG和抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶复合物(DBA)检测特异性标记。为了证实硝基酪氨酸、PAR、iNOS、Bax和Bcl-2的结合特异性，某些切片还只用一次抗体(无二次抗体)或者只用二次抗体(无一次抗体)进行温育。在这些情况下，在切片中没有发现阳性染色，这表明进行的所有实验中免疫反应都是阳性的。

通过根据制造商的说明书(Apotag，HRP kit DBA，Milan，Italy)使用TUNEL检测试剂盒进行末端脱氧核苷酸转移酶介导的UTP末端标记(TUNEL)分析。简单地说，用15mcg/ml蛋白酶K将切片在室温下温育15分钟，然后用PBS清洗。用3％H₂O₂将内源过氧化物酶在室温下灭活5分钟，然后用PBS清洗。将切片浸渍在末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)缓冲液中，在37℃、潮湿环境下温育90分钟，然后用PBS清洗，所述TdT缓冲液中含有脱氧核苷酸转移酶和生物素化的dUTP。用抗辣根过氧化物酶结合的抗体在室温下温育切片30分钟，并且用二氨基联苯胺使信号可视化。在每个编码载玻片的5～10个区域中计数TUNEL阳性细胞数/高功率区域。

光学显微镜术。外伤24小时之后取出脊髓组织。将含有损伤的组织片段(损伤各侧1cm)包埋在石蜡中并切割为5μm厚切片。用二甲苯对组织切片(厚度5μm)进行去石蜡化，使用甲基绿派洛宁染色法用苏木精/曙红(H&E)进行染色(同时用于DNA和RNA)，并使用光学显微术(Dialux 22Leitz)进行研究。

通过经验化的组织病理学说评价各脊髓的片段。计数受损的神经元并以6分制(Sirin等人，2002)来评价灰质的组织病理学变化：0，未观察到损伤；1，灰质含有1～5个嗜曙红神经元；2，灰质含有5～10个嗜曙红神经元；3，灰质含有超过10个嗜曙红神经元；4，小梗塞(少于灰质区域的三分之一)；5，中等梗塞(灰质区域的三分之一至二分之一)；6，大梗塞(超过灰质区域的二分之一)。将来自各脊髓的所有切片的分值平均化以得到单个小鼠的最终分值。以遮光方式进行所有组织学研究。图7描述了如上所述实验所得的结果。

因此，已经公开了抑制N-酰基乙醇胺水解性酸酰胺酶的具体实施方式和应用。然而，除了已经描述的那些之外也可进行更多的改进而不脱离本文中的发明构思，这对于本领域技术人员来说应该是明显的。因此，除了所附权利要求的精神之外不应该限制本发明的主题。而且，在解释说明书和权利要求时，所有术语应该以与上下文一致的可能的最宽泛的方式进行解释。具体地说，术语“包括”和“包含”应该解释为以非排他性的方式指示要素、组分、或步骤，这表示所引用的要素、组分、或步骤可以与未明显指出的其它要素、组分、或步骤一起存在、或利用、或组合。本文公开的所有外来资料的全部内容引入本文作为参考。当引用参考文献中术语的定义或使用与本文所提供术语的定义不一致或相反时，该术语适用本文中所提供的定义而不适用参考文献中该术语的定义。