一种快速培育纯合抗虫兼抗除草剂转基因观赏羽衣甘蓝的方法

摘要

本发明公开了一种快速培育纯合抗虫兼抗除草剂转基因观赏甘蓝的方法。本发明培育转基因甘蓝的方法包括如下步骤：用含有目的基因的重组农杆菌侵染甘蓝的子叶，再进行共培养，得到转基因甘蓝。本发明中，在选择培养基上，转化处理后外植体的不定芽诱导率达48％，每个外植体上的再生芽数平均为1-2个，经分子鉴定确认，再生芽的转化频率达35％。人工饲喂小菜蛾幼虫的结果证明，获得的转基因再生株具有抗虫性，最好的抗性材料其幼虫致死率可达97％。自外植体的转化至纯合转基因抗性材料的获得，仅需要短暂的三年时间。

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速培育纯合抗虫兼抗除草剂转基因观赏羽衣甘蓝的方法。

背景技术

观赏羽衣甘蓝(Brassica oleracea var.acephala)，属十字花科二年生草本植物，是芸薹属甘蓝种的园艺变种。以观叶为主，其叶片形态美观多变，心叶色彩绚丽如花，整个植株形如盛开的牡丹花，人们形象地称之为“叶牡丹”。其抗寒性很强，能耐受-8℃左右的低温，近来在许多城市，尤其是长江流域及黄河以南城市，已成为秋冬至早春的主要景观地被植物。我国目前种子基本依靠进口，国内稀有育种工作。

观赏羽衣甘蓝的部分生长期处于虫害发生严重季节，一方面害虫咬食的结果，造成了观赏性的严重破坏，另一方面，大量喷施杀虫剂，也易造成环境污染及害虫抗药性的形成。此外，作为观赏植物，通常大片栽种于户外露地，人工除草是一个耗时耗工的劳动。因此培育抗虫、抗除草剂的观赏羽衣甘蓝具有重要的社会及经济价值。

在甘蓝类作物中，几乎不存在抗虫种质，更不存在抗除草剂种质。采用基因工程手段，引入抗虫及抗除草剂基因，是培育抗虫兼抗除草剂品种的最直接、有效的手段，而且由于是单基因的引入，也保证了其观赏性状不受影响。

目前国际上使用较多的杀虫基因有来自苏云金杆菌的Bt基因，也有部分工作中采用了来自植物的蛋白酶抑制剂基因，而这两个基因的杀虫机理不同。将不同杀虫机理的杀虫蛋白基因同时导入同一受体植物，有可能提高植物的抗虫性，并延缓昆虫对杀虫蛋白产生耐受性。国际上使用较多的抗除草剂基因是来自于细菌Streptomyceshygroscopicus的bar基因，它编码对除草剂Basta中有效成分PPT(Phosphinothricin)的抗性。

在优良育种材料中建立高效组织培养离体再生体系是开展基因工程种质改良的基础。我们已经在几份优良育种材料中建立了高频率的不定芽诱导及植株再生技术(赵秀枢等，2009)，而国内外尚未见利用转基因技术培育抗虫、抗除草剂观赏羽衣甘蓝的有关报道。

甘蓝类作物具有很强的杂种优势。生产中使用的种子均为杂交一代。在杂交育种中，首先必须获得纯合的双亲材料，常规育种需要经过6-10年时间。由于植物的花粉细胞(小孢子细胞)仅具有一套染色体，通过小孢子培养可以一步获得双单倍体纯合植株，仅需1-2年时间，能大大加速育种进程。我们已经建立了观赏羽衣甘蓝小孢子培养技术，并获得了相应的国家发明专利(ZL 2006 1 0112997.5)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种培育转基因甘蓝的方法。

本发明所提供的培育转基因甘蓝的方法，包括如下步骤：用含有目的基因的重组农杆菌侵染甘蓝的子叶，再进行共培养，得到转基因甘蓝。

上述过程中，所述甘蓝的子叶为带柄子叶；所述柄的长度为1mm-4mm；所述柄的长度具体为1mm、2mm或4mm。

上述过程中，所述侵染包括如下步骤：将所述甘蓝的子叶置于所述含有目的基因的重组农杆菌的菌液中，浸泡3min-5min，得到侵染后的子叶。

上述过程中，所述含有目的基因的重组农杆菌的菌液的OD₆₀₀值为0.3-0.5。

上述过程中，所述共培养的方法包括如下步骤：将所述侵染后的子叶置于共培养培养基中，在温度为22℃-27℃且黑暗的条件下培养2天；

所述共培养培养基由NH₄NO₃、KNO₃、CaCl₂·2H₂O、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄、FeSO₄·7H₂O、EDTA·Na₂、KI、CoCl₂·6H₂O、H₃BO₃、Na₂MoO₄·2H₂O、MnSO₄·4H₂O、CuSO₄·5H₂O、ZnSO₄·7H₂O、肌醇、烟酸、甘氨酸、硫胺素(即VB1)、盐酸吡哆辛(即VB6)、6-苄氨基腺嘌呤(即6-BA)、α-萘乙酸(即NAA)、蔗糖、琼脂、乙酰丁香酮和水组成；

所述NH₄NO₃在所述共培养培养基中的浓度为1650mg/L，所述KNO₃在所述共培养培养基中的浓度为1900mg/L，所述CaCl₂·2H₂O在所述共培养培养基中的浓度为440mg/L，所述MgSO₄·7H₂O在所述共培养培养基中的浓度为370mg/L，所述KH₂PO₄在所述共培养培养基中的浓度为170mg/L，所述FeSO₄·7H₂O在所述共培养培养基中的浓度为27.8mg/L，所述EDTA·Na₂在所述共培养培养基中的浓度为37.3mg/L，所述KI在所述共培养培养基中的浓度为0.83mg/L，所述CoCl₂·6H₂O在所述共培养培养基中的浓度为0.025mg/L，所述H₃BO₃在所述共培养培养基中的浓度为6.2mg/L，所述Na₂MoO₄·2H₂O在所述共培养培养基中的浓度为0.25mg/L，所述MnSO₄·4H₂O在所述共培养培养基中的浓度为22.3mg/L，所述CuSO₄·5H₂O在所述共培养培养基中的浓度为0.025mg/L，所述ZnSO₄·7H₂O在所述共培养培养基中的浓度为8.6mg/L，所述肌醇在所述共培养培养基中的浓度为100mg/L，所述烟酸在所述共培养培养基中的浓度为5mg/L，所述甘氨酸在所述共培养培养基中的浓度为2.0mg/L，所述硫胺素在所述共培养培养基中的浓度为0.1mg/L，所述盐酸吡哆辛在所述共培养培养基中的浓度为0.5mg/L，所述6-苄氨基腺嘌呤在所述共培养培养基中的浓度为1.0mg/L，所述α-萘乙酸在所述共培养培养基中的浓度为0.1mg/L，所述蔗糖在所述共培养培养基中的浓度为30g/L，所述琼脂在所述共培养培养基中的浓度为1.0g/L，所述乙酰丁香酮在所述共培养培养基中的浓度为100μmol/L，所述共培养培养基的pH值为5.2。

上述过程中，在所述共培养后，包括诱导筛选培养和生根培养的步骤；

和/或，所述目的基因为Bt-pinII基因和bar基因；所述Bt-pinII基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述bar基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示；

和/或，所述诱导筛选培养和所述生根培养的方法中培养条件均为：温度为25℃、光照周期为16h光照/8h黑暗、光强度为3000lx；

和/或，所述诱导筛选培养基由NH₄NO₃、KNO₃、CaCl₂·2H₂O、MgSO₄.7H₂O、KH₂PO₄、FeSO₄·7H₂O、EDTA·Na₂、KI、CoCl₂·6H₂O、H₃BO₃、Na₂MoO₄·2H₂O、MnSO₄·4H₂O、CuSO₄·5H₂O、ZnSO₄·7H₂O、肌醇、烟酸、甘氨酸、硫胺素、盐酸吡哆辛、6-苄氨基腺嘌呤、α-萘乙酸、蔗糖、琼脂、草胺膦(称Phosphinothricin或PPT)、羧卞青霉素(Carbenicillin)和水组成；

所述NH₄NO₃在所述诱导筛选培养基中的浓度为1650mg/L，所述KNO₃在所述诱导筛选培养基中的浓度为1900mg/L，所述CaCl₂·2H₂O在所述诱导筛选培养基中的浓度为440mg/L，所述MgSO₄·7H₂O在所述诱导筛选培养基中的浓度为370mg/L，所述KH₂PO₄在所述诱导筛选培养基中的浓度为170mg/L，所述FeSO₄·7H₂O在所述诱导筛选培养基中的浓度为27.8mg/L，所述EDTA·Na₂在所述诱导筛选培养基中的浓度为37.3mg/L，所述KI在所述诱导筛选培养基中的浓度为0.83mg/L，所述CoCl₂·6H₂O在所述诱导筛选培养基中的浓度为0.025mg/L，所述H₃BO₃在所述诱导筛选培养基中的浓度为6.2mg/L，所述Na₂MoO₄·2H₂O在所述诱导筛选培养基中的浓度为0.25mg/L，所述MnSO₄·4H₂O在所述诱导筛选培养基中的浓度为22.3mg/L，所述CuSO₄·5H₂O在所述诱导筛选培养基中的浓度为0.025mg/L，所述ZnSO₄·7H₂O在所述诱导筛选培养基中的浓度为8.6mg/L，所述肌醇在所述诱导筛选培养基中的浓度为100mg/L，所述烟酸在所述诱导筛选培养基中的浓度为5mg/L，所述甘氨酸在所述诱导筛选培养基基中的浓度为2.0mg/L，所述硫胺素在所述诱导筛选培养基中的浓度为0.1mg/L，所述盐酸吡哆辛在所述诱导筛选培养基中的浓度为0.5mg/L，所述6-苄氨基腺嘌呤在所述诱导筛选培养基中的浓度为1.0mg/L，所述α-萘乙酸在所述诱导筛选培养基中的浓度为0.1mg/L，所述蔗糖在所述诱导筛选培养基中的浓度为30g/L，所述琼脂在所述诱导筛选培养基中的浓度为1.0g/L，所述草胺膦在所述诱导筛选培养基中的浓度为3-7mg/L，所述羧卞青霉素在所述诱导筛选培养基中的浓度为300mg/L，所述诱导筛选培养基的pH值为5.8；

和/或，所述生根培养基由NH₄NO₃、KNO₃、CaCl₂·2H₂O、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄、FeSO₄·7H₂O、EDTA·Na₂、KI、CoCl₂·6H₂O、H₃BO₃、Na₂MoO₄·2H₂O、MnSO₄·4H₂O、CuSO₄·5H₂O、ZnSO₄·7H₂O、肌醇、烟酸、甘氨酸、硫胺素、盐酸吡哆辛、6-苄氨基腺嘌呤、α-萘乙酸、蔗糖、琼脂、草胺膦、头孢霉素和水组成；

所述NH₄NO₃在生根培养基中的浓度为1650mg/L，所述KNO₃在生根培养基中的浓度为1900mg/L，所述CaCl₂·2H₂O在生根培养基中的浓度为440mg/L，所述MgSO₄·7H₂O在生根培养基中的浓度为370mg/L，所述KH₂PO₄在生根培养基中的浓度为170mg/L，所述FeSO₄·7H₂O在生根培养基中的浓度为27.8mg/L，所述EDTA·Na₂在生根培养基中的浓度为37.3mg/L，所述KI在生根培养基中的浓度为0.83mg/L，所述CoCl₂·6H₂O在生根培养基中的浓度为0.025mg/L，所述H₃BO₃在生根培养基中的浓度为6.2mg/L，所述Na₂MoO₄·2H₂O在生根培养基中的浓度为0.25mg/L，所述MnSO₄·4H₂O在生根培养基中的浓度为22.3mg/L，所述CuSO₄·5H₂O在生根培养基中的浓度为0.025mg/L，所述ZnSO₄·7H₂O在生根培养基中的浓度为8.6mg/L，所述肌醇在生根培养基中的浓度为100mg/L，所述烟酸在生根培养基中的浓度为5mg/L，所述甘氨酸在生根培养基中的浓度为2.0mg/L，所述硫胺素在生根培养基中的浓度为0.1mg/L，盐酸吡哆辛在生根培养基中的浓度为0.5mg/L，所述6-苄氨基腺嘌呤在生根培养基中的浓度为1.0mg/L，所述α-萘乙酸在生根培养基中的浓度为0.1mg/L，所述蔗糖在生根培养基中的浓度为30g/L，所述琼脂在生根培养基中的浓度为1.0g/L，所述草胺膦在生根培养基中的浓度为3-7mg/L，所述头孢霉素在生根培养基中的浓度为20-25mg/L，所述生根培养基的pH值为5.8。

上述过程中，所述甘蓝为观赏羽衣甘蓝，具体可为京冠白1号品种。

由上述任一所述方法获得的转基因甘蓝也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种获得转基因甘蓝纯合体的方法。

本发明所提供的获得转基因甘蓝纯合体的方法，包括如下步骤：取上述任一所述的转基因甘蓝的小孢子，进行胚状体诱导培养、分化培养、筛选培养、生根培养，得到转基因甘蓝纯合体；所述小孢子取自如下时期的花蕾：含70％单核靠边期小孢子细胞和30％双核期小孢子细胞的花蕾；

和/或，所述胚状体诱导培养中使用的胚状体诱导培养基由KNO₃、Ca(NO₃)₂·4H₂O、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄、FeSO₄·7H₂O、EDTA·Na₂、KI、CoCl₂·6H₂O、H₃BO₃、Na₂MoO₄·2H₂O、MnSO₄·4H₂O、CuSO₄·5H₂O、ZnSO₄·7H₂O、肌醇、烟酸、吡哆醇、硫胺素、甘氨酸、叶酸、生物素、谷氨酰胺、丝氨酸、谷胱甘肽、6-苄氨基腺嘌呤、蔗糖、活性炭和水组成；

所述KNO₃在所述胚状体诱导培养基中的浓度为125mg/L，所述Ca(NO₃)₂·4H₂O在所述胚状体诱导培养基中的浓度为500mg/L，所述MgSO₄·7H₂O在所述胚状体诱导培养基中的浓度为125mg/L，所述KH₂PO₄在所述胚状体诱导培养基中的浓度为125mg/L，所述FeSO₄·7H₂O在所述胚状体诱导培养基中的浓度为27.8mg/L，所述EDTA·Na₂在所述胚状体诱导培养基中的浓度为37.3mg/L，所述KI在所述胚状体诱导培养基中的浓度为0.83mg/L，所述CoCl₂·6H₂O在所述胚状体诱导培养基中的浓度为0.025mg/L，所述H₃BO₃在所述胚状体诱导培养基中的浓度为6.2mg/L，所述Na₂MoO₄·2H₂O在所述胚状体诱导培养基中的浓度为0.25mg/L，所述MnSO₄·4H₂O在所述胚状体诱导培养基中的浓度为22.3mg/L，所述CuSO₄·5H₂O在所述胚状体诱导培养基中的浓度为0.025mg/L，所述ZnSO₄·7H₂O在所述胚状体诱导培养基中的浓度为8.6mg/L，所述肌醇在所述胚状体诱导培养基中的浓度为100mg/L，所述烟酸在所述胚状体诱导培养基中的浓度为5mg/L，所述吡哆醇在所述胚状体诱导培养基中的浓度为0.5mg/L，

所述硫胺素在所述胚状体诱导培养基中的浓度为0.5mg/L，所述甘氨酸在所述胚状体诱导培养基中的浓度为2.0mg/L，所述叶酸在所述胚状体诱导培养基中的浓度为0.5mg/L，所述生物素在所述胚状体诱导培养基中的浓度为0.05mg/L，所述谷氨酰胺在所述胚状体诱导培养基中的浓度为800mg/L，所述丝氨酸在所述胚状体诱导培养基中的浓度为100mg/L，所述谷胱甘肽在所述胚状体诱导培养基中的浓度为30mg/L，所述6-苄氨基腺嘌呤在所述胚状体诱导培养基中的浓度为0.5-1.2mg/L，所述蔗糖在所述胚状体诱导培养基中的浓度为130g/L，所述活性炭在所述胚状体诱导培养基中的浓度为0.2g/L；所述胚状体诱导培养基的pH值为5.9；

和/或，所述胚状体诱导培养的条件为：在温度为33℃且黑暗条件下高温胁迫处理24小时后，再在温度为25℃且黑暗条件下培养至出现胚；

和/或，所述小孢子在胚状体诱导培养基中的浓度为10⁵个/mL；

和/或，所述分化及筛选培养中所使用的分化培养基由NH₄NO₃、KNO₃、CaCl₂·2H₂O、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄、FeSO₄·7H₂O、EDTA·Na₂、KI、CoCl₂·6H₂O、H₃BO₃、Na₂MoO₄·2H₂O、MnSO₄·4H₂O、CuSO₄·5H₂O、ZnSO₄·7H₂O、肌醇、烟酸、吡哆醇、硫胺素、甘氨酸、蔗糖、琼脂、草胺膦和水组成；

所述NH₄NO₃在所述分化及筛选培养基中的浓度为1650mg/L，所述KNO₃在所述分化及筛选培养基中的浓度为1900mg/L，所述CaCl₂.2H₂O在所述分化及筛选培养基中的浓度为440mg/L，所述MgSO_4.7H₂O在所述分化及筛选培养基中的浓度为370mg/L，所述KH₂PO₄在所述分化及筛选培养基中的浓度为170mg/L，所述FeSO₄.7H₂O在所述分化及筛选培养基中的浓度为27.8mg/L，所述EDTA.Na₂在所述分化及筛选培养基中的浓度为37.3mg/L，所述KI在所述分化及筛选培养基中的浓度为0.83mg/L，所述CoCl₂.6H₂O在所述分化及筛选培养基中的浓度为0.025mg/L，所述H₃BO₃在所述分化及筛选培养基中的浓度为6.2mg/L，所述Na₂MoO₄.2H₂O在所述分化及筛选培养基中的浓度为0.25mg/L，所述MnSO₄.4H₂O在所述分化及筛选培养基中的浓度为22.3mg/L，所述CuSO₄.5H₂O在所述分化及筛选培养基中的浓度为0.025mg/L，所述ZnSO₄.7H₂O在所述分化及筛选培养基中的浓度为8.6mg/L，所述肌醇在所述分化及筛选培养基中的浓度为100mg/L，所述烟酸在所述分化及筛选培养基中的浓度为0.5mg/L，所述吡哆醇在所述分化及筛选培养基中的浓度为0.5mg/L，所述硫胺素在所述分化及筛选培养基中的浓度为0.1mg/L，所述甘氨酸在所述分化及筛选培养基中的浓度为2.0mg/L，所述蔗糖在所述分化及筛选培养基中的浓度为30g/L，所述琼脂在所述分化及筛选培养基中的浓度为10g/L，所述草胺膦在所述分化及筛选培养基中的浓度为5.5-8.5mg/L；所述分化及筛选培养基的pH值为5.8。

和/或，所述分化及筛选培养的条件为：在温度为25℃、光强为2000Lux、光照时间为16小时光照/天的条件下进行分化及筛选培养20天；

和/或，所述生根培养中使用的生根培养基由NH₄NO₃、KNO₃、CaCl₂·2H₂O、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄、FeSO₄·7H₂O、EDTA·Na₂、KI、CoCl₂·6H₂O、H₃BO₃、Na₂MoO₄·2H₂O、MnSO₄·4H₂O、CuSO₄·5H₂O、ZnSO₄·7H₂O、肌醇、烟酸、吡哆醇、硫胺素、甘氨酸、蔗糖、琼脂、草胺膦和水组成；

所述NH₄NO₃在所述生根培养基中的浓度为825mg/L，所述KNO₃在所述生根培养基中的浓度为950mg/L，所述CaCl₂·2H₂O在所述生根培养基中的浓度为220mg/L，所述MgSO₄·7H₂O在所述生根培养基中的浓度为185mg/L，所述KH₂PO₄在所述生根培养基中的浓度为85mg/L，所述FeSO₄·7H₂O在所述生根培养基中的浓度为27.8mg/L，所述EDTA·Na₂在所述生根培养基中的浓度为37.3mg/L，所述KI在所述生根培养基中的浓度为0.83mg/L，所述CoCl₂·6H₂O在所述生根培养基中的浓度为0.025mg/L，所述H₃BO₃在所述生根培养基中的浓度为6.2mg/L，所述Na₂MoO₄·2H₂O在所述生根培养基中的浓度为0.25mg/L，所述MnSO₄·4H₂O在所述生根培养基中的浓度为22.3mg/L，所述CuSO₄·5H₂O在所述生根培养基中的浓度为0.025mg/L，所述ZnSO₄·7H₂O在所述生根培养基中的浓度为8.6mg/L，所述肌醇在所述生根培养基中的浓度为100mg/L，所述烟酸在所述生根培养基中的浓度为0.5mg/L，所述吡哆醇在所述生根培养基中的浓度为0.5mg/L，所述硫胺素在所述生根培养基中的浓度为0.1mg/L，所述甘氨酸在所述生根培养基中的浓度为2.0mg/L，所述蔗糖在所述生根培养基中的浓度为15g/L，所述琼脂在所述生根培养基中的浓度为8.0g/L，所述草胺膦在所述生根培养基中的浓度为5.5-8.5mg/L，所述生根培养基的pH值为5.9；

和/或，所述生根培养的条件为：在温度为25℃、光强2000Lux且光照时间为16小时光照/天。

上述过程中，所述甘蓝为观赏羽衣甘蓝，具体可为京冠白1号品种。

本发明公开了一种利用根癌农杆菌介导的组织转化途径，并结合转基因材料的游离小孢子培养，快速获得纯合的抗虫兼抗除草剂观赏羽衣甘蓝的方法及所用的培养基。本发明具有以下环节及特征：1)以双价抗虫基因Bt-pinII为目的基因，以编码除草剂Basta抗性的bar基因为标记基因，选择观赏羽衣甘蓝的带柄子叶为外植体，经系列的转化技术指标优化后，建立了农杆菌介导的高频率转化再生体系。该体系条件下非选择培养基上的对照外植体的不定芽诱导率达100％，每个外植体上不定芽数高达25个；选择培养基上，转化处理后外植体的不定芽诱导率达48％，每个外植体上的再生芽数平均为1-2个，经分子鉴定确认，再生植株中外源基因阳性的植株比例约73％，因此外植体的转化频率约达35％。人工饲喂小菜蛾幼虫的结果证明，获得的转基因再生株具有抗虫性，最好的抗性材料其幼虫致死率可达97％。2)采用具有良好抗虫性的转基因再生株为花粉供体母株，通过游离小孢子培养胚状体发生途径，结合在胚成苗阶段及幼苗生根阶段的除草剂抗性筛选，快速获得纯合的转基因植株，并在其自交后代中，通过对标记性状——除草剂Basta抗性的鉴定，证明没有出现抗性分离，进一步证实外源基因得到了纯合。自外植体的转化至纯合转基因抗性材料的获得，仅需要短暂的三年时间，这是常规育种所不能达到的。

本发明获得的新材料，可以直接在生产中应用，也可以用于进一步的杂交育种体系，培育抗虫抗除草剂的杂种新一代。由于国际上观赏植物的基因工程产品较之食用类作物更易获得基因工程产品的安全生产许可，本发明将具有现实的社会效应和经济、生态效益。

附图说明

图1带柄子叶外植体在芽诱导及筛选培养基上形成Basta抗性不定芽

图2再生株在添加Basta的生根培养基上生根

图3再生株完成移栽驯化

图4再生株中外源基因的分子杂交鉴定

图5再生株叶片的小菜蛾幼虫抗性鉴定

图6转基因再生株的游离小孢子培养形成的胚状体

图7小孢子再生植株中除草剂抗性的分离情况。

图8小孢子再生株后代的外源基因得到纯合(全部抗除草剂Basta)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

试材为观赏羽衣甘蓝白色皱叶类型，品种名称为“京冠白1号”，“京冠白1号”的种子购自北京京研益农科技发展中心。除草剂Basta购自AgrEvo公司，产品目录号为9000471。

实施例1、培育重组观赏羽衣甘蓝的方法

实验一、培育重组观赏羽衣甘蓝及鉴定

(一)培育重组观赏羽衣甘蓝

为了考察所建立的离体培养体系是否有效，实验中以相同材料设置对照，对照外植体在预培养后直接进入芽诱导培养基(表1)，不与农杆菌接触，也不经筛选培养(即无步骤4、5、6)。

1、无菌材料的获得

挑选籽粒饱满、大小均匀无病虫害的种子，75％酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，3％次氯酸钠(V/V，)消毒15min(其间不断摇动，加一滴吐温)，无菌水冲洗4次，无菌滤纸吸干种子表面水分，播种于MS基本培养基上，每瓶播种20粒。25℃散射光下或是黑暗中发芽。

2、外植体的预培养

切取萌发4天后无菌苗的带柄子叶(柄长2mm左右)作为外植体，接种(切口插入培养基)到预培养基上，在25℃、16h光照/8h黑暗光周期、光强度为3000lx的培养条件下培养2d。

3、重组农杆菌菌液的制备

重组农杆菌EHA105/pBAC 173的制备：质粒载体pBAC 173中含抗虫基因Bt-pinII，及除草剂抗性基因bar，Bt-pinII基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示，bar基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。

载体pBBBasta-pinII(张军杰，刘凡，罗晨，姚磊，赵泓，黄玉碧.大白菜的马铃薯蛋白酶抑制剂基因转化及抗菜青虫性的鉴定，园艺学报，2004，31(2)：193-198.)(北京市农林科学院)；

载体pBPC56：在基础载体pSP72(购自Promega公司)的HindIII和XbaI位点之间插入CaMV35S启动子(GenBank No.AF502128所示序列中自5′末端起第25-859位核苷酸序列)、BamHI和KpnI位点插入bar基因(序列表中序列3所示)、KpnI和EcoRI位点之间插入Nos终止子(GenBank No.AF502128所示序列中自5′末端起第2778-3030位核苷酸序列)，得到的重组载体记作载体pBPC56；

载体pBPC56RL：将pBPC56用HindIII酶切，用T4DNA polymerase(购自Promega公司)补平，引入EcoRI接头子(CCGGAATTCCGG，上海生工公司合成)获得；

农杆菌菌株EHA105(Hood EE，Kusnadi A，Nikolov Z，Howard JA.Molecularfarming of industrial proteins from transgenic maize.Adv Exp Med Biol.1999，464：127-47)(北京市农林科学院)；

双元载体pCAMBIA0390【Hajdukiewicz，P.，Svab，Z.and Maliga，P.The smallversatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for planttransformation。Plant Mol.Biol.25(6)，989-994(1994)】。(北京市农林科学院)

具体操作如下：

3-1、Bt基因Cry1Ab/Ac的人工合成与克隆：

采用植物基因表达密码子偏好原则，在上海生工生物工程公司合成序列1所示Cry1Ab/Ac基因(即Bt基因)。将合成的基因与pUC-T载体连接，得到重组质粒记作pUC-bt1920。

②根据Cry1Ab/Ac(1-1920bp)序列设计引物，在上游引物Cryp1一端引入BamHI位点，在下游引物Cry1920R一端引入Bgl II位点，并设置终止密码子。用长PCR的方法扩增目的基因(1-1930bp)。

上游引物Cryp 1：5’GGATCCATGG ACAACAACCC AAACATCA 3’

下游引物Cry1920R：5’CAGATCGG CCTGAAGACC TGA TAGATCT3’

③PCR扩增反应体系：

④PCR扩增反应程序：

95℃预变性3min，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸3min，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

⑤克隆序列的测序鉴定

将扩增的PCR产物与-T easy Vector载体连接，重组质粒转化大肠杆菌DH5α，在含有IPTG和X-gal的LB/Amp平板上筛选白色菌落，对重组子进行EcoRI酶切鉴定。把酶切检测正确的质粒送到公司进行Sp6/T7双向测序。比对结果表明(软件：DNAMAN)，所克隆序列与目标基因序列同源性100％，可以确定克隆到的DNA片段就是Cry1Ab/Ac基因。

3-2、Bt基因片段的克隆与Bt-PinII融合基因的克隆

根据Cry1Ab(1-1920bp)和PinIIX04118基因序列，分别设计引物，先去除PinII的内含子(intron)，然后把Bt和PinII基因融合成一个基因片段。Part1为PinII基因intron前面部分；Part2为intron后面部分。

第一步，Bt-Part1融合：

根据基因序列，设计下游引物pin2-1Ar，引物部分与Cry1Ab/Ac(1-1920bp)片段在1900-1920bp处有互补序列20bp，上游引物为Cryp1，模板为pUC-bt1920。扩增片断长度为1960bp。

pin2-1Ar(58bp)：GTAGGTAAGC AACGAAATTA ACTTCCTTGTGAACATCCAT GGTCTTCAGG CCGATCTG

①PCR扩增体系(25μL)：

②PCR扩增反应程序：

95℃预变性3min，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸3min，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

第二步，PinII基因Part2部分的PCR扩增。分别设计引物，模板为pBBBasta-pinII质粒DNA，扩增大小为843bp的目的片段。引物如下：

上游引物pin2-2f(52bp)：TAATTTCGTT GCTTACCTAC TAATTGTTCTTGGATTATTG GTACTTGTAA GC

下游引物pin2-3r(30bp)：GAATTCTGTA AATTATCTCA CTTTATTAAG

①PCR扩增体系：

②PCR扩增反应程序：

95℃预变性3min，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min50s，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

第三步，Bt-PinII融合。1960bp和843bp之间有20bp重叠区域，设计引物重叠延伸，用PCR方法扩增整个基因片段，长度为：2783bp。模板为第一步的扩增产物(模板1)和第二步的扩增产物(模板2)的混合物，引物为Cryp1和pin2-3r。

①PCR扩增体系(25μL)

②PCR扩增反应程序

95℃预变性3min，94℃变性40s，56℃退火50s，72℃延伸4min20s，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。得到的2.8kb PCR产物，测序验证，序列如序列表中序列2所示，确认为Bt-Pin II融合基因。

3-3、表达载体pBAC173的构建

用BamH I和EcoR I分别双酶切pBPC56和Bt-Pin II基因，回收，连接，获得中间载体pBAC169；在用HindIII和EcoR I双酶切中间载体pBAC169和载体pCAMBIA0390，回收片段，连接，得到中间载体pBAC170；然后分别用EcoR I单酶切中间载体pBAC170(CIP处理)和载体pBPC56RL，回收，连接，获得表达载体pBAC173。

3-4、重组质粒对大肠杆菌的转化及鉴定

①在超净工作台中将10μl连接产物加入到100μl的DH5a感受态细胞中，混匀，置冰水浴上30min。

②42℃水浴热激90s，再放入冰浴中1～2min。

③加入900mlLB液体培养基，37℃，150rpm振荡培养1.5～2h。

④在已加入Amp(50μg/)的LB固体培养基上，均匀涂抹上X-gal(20mg/mL)40μl和IPTG(200mg/mL)4μl的混合液。

⑤将活化好的均匀涂布在上述LB平板上，37℃培养过夜，第二天观察结果。

重组质粒的PCR鉴定及酶切鉴定：挑出白色菌落，进行PCR检测。反应体系和条件与前述扩增基因片段同。挑取PCR初步鉴定得到的白色单菌落，在含抗生素的液体LB中过夜培养，收集菌体，提取质粒，选用重组质粒上的单、双酶切位点分别进行酶切鉴定。正确的质粒DNA用于下一步农杆菌的转化。

3-5、重组质粒转化农杆菌EHA105

(1)农杆菌感受态的制备

①挑取农杆菌EHA105单菌落于YEB+50μg/Rif+50μg/Kan的液体培养基，28℃，黑暗，培养过夜(16h)。

②取过夜培养菌液500μl接种于50mLYEB液体培养基中，28℃振荡培养至OD₆₀₀为0.5～1.0。

③菌液冰上放置15min后，4℃，2000g，离心5min，弃上清。

④用1mL预冷的20mmol/L CaCl₂悬浮细胞，每100μl分装到1.5的EP管中即可用于转化。

⑤如果不立即使用，加入甘油，液氮中速冻，置-70℃保存备用。

(2)农杆菌的转化及鉴定

①取100μl感受态细胞，加入1μg提取自上述大肠杆菌，并经验证确认的质粒pBAC173DNA，液氮中速冻3min，37℃水浴5min，然后各加入1mLYEB培养基，28℃培养2～4h。

②10000rpm离心30s，弃上清，分别加入0.1YEB培养基重新悬浮细胞，分别涂布于含有50μg/Kan和50μg/Rif的YEB平板上，28℃黑暗培养2～3d。

③挑单菌落，接种于YEB液体(含有50μg/Kan，500μg/Sm和50μg/Rif)培养基中，28℃振荡培养过夜。

④提取质粒DNA，以质粒DNA为模板进行PCR扩增鉴定或者重新转化到大肠杆菌提取质粒DNA进行酶切鉴定。

结果得到阳性重组农杆菌，记作农杆菌EHA105/pBAC 173。

农杆菌的培养与活化：将重组农杆菌EHA105/pBAC 173的单克隆接种于含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福霉素的20ml LB液体培养基中，28℃，黑暗培养2d，至培养物的OD₆₀₀值为0.8-1.0；4000rpm离心收集菌体沉淀；

菌侵染液的制备：将菌体沉淀重新悬浮于感染液(表1)中，使其OD₆₀₀为0.4，得到菌侵染液。

LB液体培养基：由胰蛋白胨、酵母提取物和NaCl组成；胰蛋白胨在LB液体培养基中的浓度为10g/L，酵母提取物在LB液体培养基中的浓度为5g/L，NaCl在LB液体培养基中的浓度为10g/L；LB液体培养基的pH 7.0。

4、农杆菌侵染外植体：

把预培养后的外植体放入重组农杆菌EHA105/pBAC 173侵染液中，浸泡4min，取出外植体，并在无菌滤纸上吸干多余菌液，接种到共培养基上。

5、共培养：在25℃、黑暗条件下共培养2d；共培养培养基如表1。

6、转化不定芽的诱导及筛选：完成共培养后的材料接种到芽诱导及筛选培养基上，在25℃、16h光照/8h黑暗光周期、光强度为3000lx的培养条件下进行转化不定芽的诱导及筛选培养。20天左右，待幼芽长至3cm左右(图1)时，转入生根培养基促使植株的生长及根的形成。芽诱导及筛选培养基如表1

7、生根及移栽：将步骤6得到的苗转入生根培养基(表1)，在25℃、16h光照/8h黑暗光周期、光强度为3000lx的培养条件下进行生根培养10天，幼苗长出新根，并迅速成株(图2)。具有5片真叶后，即可出瓶移栽。移栽基质由草炭和蛭石组成，质量比为草炭∶蛭石＝1∶1，间隙覆盖薄膜保湿一周后可完全揭掉(图3)，植株存活率为100％。植株存活率的计算公式为：存活率＝存活植株数/移栽植株总数x100％。

在上述实验条件下，对照组：对照外植体在芽诱导培养基上(非选择培养基上，见表1)培养20天左右，有大量的不定芽自子叶柄切口处形成，外植体的不定芽诱导率可达100％，每个外植体上不定芽数高达25个。实验组：农杆菌转化处理后的外植体，在加有除草剂Basta(含PPT)的选择培养基上，部分变褐，无不定芽形成，部分外植体的子叶柄切口端在插入培养基部位形成一些绿色不定芽，外植体的不定芽诱导率可达48％，每个外植体上的再生芽数平均为1-2个。

外植体的不定芽诱导率＝具不定芽发生的外植体数/接种外植体总数x 100％。

本发明中用外植体的转化率来表示转化效率。转化效率的计算公式为：产生转基因植株的外植体数/接种外植体总数x100％。实验组转化效率为35％。

MS基本培养基组成：与文献“Murashige T.and F.Skoog，1962.A revised mediumfor rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture.Physiol.

Plant.15：473-497.”中所述MS基本培养基组成一致。

表1、用于羽衣甘监遗传转化体系建立的培养基配方及灭菌方式

(二)转基因植株的鉴定

1、转基因植株的分子鉴定：

质粒pBAC173的构建方法：与实验(一)中所述一致。

选取生长状态较好的转基因植株，提取基因组DNA；以质粒pBAC173 DNA作为阳性对照，未转基因植株DNA作为阴性对照，不加DNA反应管作空白对照，对羽衣甘蓝再生植株基因组DNA进行外源基因片段的PCR扩增及Southern杂交鉴定；PCR扩增引物为来自bar基因的特异序列，具体为5’-AACTTCCGTACCGAGCCGCA-3’，5’-ATGCCAGTTCCCGTGCTTGA-3’，Southern杂交中使用的核酸探针为地高辛标记的bar基因序列。

对在芽诱导及筛选培养基上获得的分别来自不同外植体的86个独立转化株进行了PCR鉴定，随机取样其中的18份材料进行了Southern杂交鉴定。根据Southern杂交结果，确定再生植株中外源基因阳性植株的频率。代表性结果如图4所示。图4中，泳道1表示非转基因对照材料，泳道2至泳道5为4个阳性植株，泳道6为未检测到外源基因的再生植株。

18份材料的鉴定结果表明，再生株中，外源基因阳性的植株频率约为73％，这样推算出外植体的转化频率约为35％(73％x48％)。这在芸薹属作物中是很高的。外植体转化频率的计算公式：外源基因阳性植株频率x外植体的抗性不定芽诱导率。

2、转基因植株的抗虫性鉴定：

接虫方法：取转基因植株及对照植株对等位置叶片，表面清洗并吸干水分后，分别放入垫有滤纸保湿的直径9厘米培养皿中；将同期孵化约6小时的小菜蛾幼虫(1-2龄)放入培养皿中的菜叶上，每皿放幼虫10头，每处理重复5次。在25℃，RH为60-70％条件下进行饲虫实验(图5)。每三天更换培养皿中叶片。共实验15天，统计平均死亡率。

调查方法：每日观察一次，检查幼虫的存活数量(以毛笔轻触虫体，无任何反应判为死亡)，观察记录1-2龄、3-4龄幼虫死亡数量，统计平均死亡率(表2)。

表2、饲喂转Bt-PinII基因叶片的小菜蛾幼虫死亡率(％)

表中173-1至173-10为转基因植株叶片。

结果表明，与非转基因起始材料相比，各个转基因植株叶片均有较高的抗虫效果，不同单株的抗虫效果不同，但存在具有高抗性的单株，取食小菜蛾幼虫的死亡率可达97％。

实验二、培育重组观赏羽衣甘蓝

所用的种子为京冠白1号，与实验一中相同。

(一)培育重组观赏羽衣甘蓝

为了考察所建立的离体培养体系是否有效，实验中以相同材料设置对照，对照外植体在预培养后直接进入芽诱导培养基，不与农杆菌接触，也不经筛选培养(无步骤4、5、6)。

1、无菌材料的获得

实验中所使用的种子为京冠白1号。

方法与实验一中所述相同。

2、外植体的预培养

方法与实验一中所述相同，不同的是切取萌发3天后无菌苗的带柄子叶(柄长1mm左右)作为外植体。预培养基如表1所示。

3、重组农杆菌菌液的制备

方法与实验一中所述相同。不同的是：重组农杆菌菌液的浓度为OD₆₀₀为0.3。

重组农杆菌EHA105/pBAC 173与实验一中所述相同。

LB液体培养基：与实验一中所述相同。

4、农杆菌侵染外植体：

方法与实验一中所述相同，不同的是浸泡3min。

5、共培养：方法与实验一中所述相同，不同的是共培养的温度为22℃。共培养培养基如表1。

6、转化不定芽的诱导及筛选：方法与实验一中所述相同，不同的是筛选培养基中PPT的浓度为3mg/L。

7、生根及移栽：方法与实验一中所述相同，不同的是生根培养基中PPT的浓度为3mg/L，头孢霉素的浓度为20mg/L。

在上述实验条件下，对照外植体在芽诱导培养基上(非选择培养基上)20天左右，有多量的不定芽自子叶柄切口处形成，外植体的不定芽诱导率可达100％，每个外植体上不定芽数可达18个。农杆菌转化处理后的外植体，在加有PPT的选择培养基上，部分变褐，无不定芽形成，部分外植体的子叶柄切口端在插入培养基部位形成一些绿色不定芽，外植体的不定芽诱导率可达40％，每个外植体上的再生芽数平均为1个。

外植体的不定芽诱导率＝具不定芽发生的外植体数/接种外植体总数x 100％。

(二)转基因植株的鉴定

1、转基因植株的分子鉴定：

方法与实验一中所述相同。

结果表明，再生株中外源基因阳性的植株频率约为75％，这样推算出外植体的转化频率约为30％(75％x40％)，比实验一中的外植体转化频率稍低，推测原因可能是所取用的是发芽3天后的带柄子叶外植体，较幼嫩，致使对农杆菌更敏感。外植体转化频率的计算公式：外源基因阳性植株频率x外植体的不定芽诱导率。

2、转基因植株的抗虫性鉴定：

方法与实验一中所述相同。

结果表明，与非转基因起始材料相比，各个转基因植株叶片均有较高的抗虫效果，不同单株的抗虫效果不同，但存在具有高抗性的单株，取食小菜蛾幼虫的死亡率可达96％，与实验一中结果无显著性差异。

本实验条件下，外植体的转化效率为30％。

实验三、培育重组观赏羽衣甘蓝

所用的种子为京冠白1号，与实验一中相同。

(一)培育重组观赏羽衣甘蓝

为了考察所建立的离体培养体系是否有效，实验中以相同材料设置对照，对照外植体在预培养后直接进入芽诱导培养基，不与农杆菌接触，也不经筛选培养(无步骤4、5、6)。

1、无菌材料的获得

实验中所使用的种子为京冠白1号，与实验一中相同。

方法与实验一中所述相同。

2、外植体的预培养

方法与实验一中所述相同，不同的是切取萌发5天后无菌苗的带柄子叶(柄长4mm左右)作为外植体。预培养基如表1所示。

3、重组农杆菌菌液的制备

方法与实验一中所述相同。不同的是：重组农杆菌菌液的浓度为OD₆₀₀为0.5。

重组农杆菌EHA105/pBAC 173与实验一中所述相同。

LB液体培养基：与实验一中所述相同。

4、农杆菌侵染外植体：

方法与实验一中所述相同，不同的是浸泡5min。

5、共培养：方法与实验一中所述相同，不同的是共培养的温度27℃。共培养培养基如表1。

6、转化不定芽的诱导及筛选：方法与实验一中所述相同，不同的是筛选培养基中PPT的浓度为7mg/L。

7、生根及移栽：方法与实验一中所述相同，不同的是生根培养基中PPT的浓度为7mg/L，头孢霉素在生根培养基中的浓度为25mg/L。

在上述实验条件下，对照外植体在芽诱导培养基上(非选择培养基上)20天左右，有多量的不定芽自子叶柄切口处形成，外植体的不定芽诱导率可达95％，每个外植体上不定芽数可达16个。农杆菌转化处理后的外植体，在加有除草剂Basta(含PPT)的选择培养基上，部分变褐，无不定芽形成，部分外植体的子叶柄切口端在插入培养基部位形成一些绿色不定芽，外植体的不定芽诱导率可达36％，每个外植体上的再生芽数平均为1个。

外植体的不定芽诱导率＝具不定芽发生的外植体数/接种外植体总数x 100％。

(二)转基因植株的鉴定

1、转基因植株的分子鉴定：

方法与实验一中所述相同。

结果表明，再生株中外源基因阳性的植株频率约为80％，这样推算出外植体的转化频率约为28.8％(外植体转化频率＝外源基因阳性植株频率80％x外植体的不定芽诱导率36％)，比实验一中的外植体转化频率低，推测原因可能是所取用的是发芽5天后的带柄子叶外植体，子叶柄偏长，不定芽诱导能力降低所致。此外还可见再生株中外源基因阳性的植株频率提高(约为80％)，这说明芽诱导及筛选培养基，生根培养基中使用7mg/L的PPT浓度是有效的。

2、转基因植株的抗虫性鉴定：

方法与实验一中所述相同。

结果表明，与非转基因起始材料相比，各个转基因植株叶片均有较高的抗虫效果，不同单株的抗虫效果不同，但存在具有高抗性的单株，取食小菜蛾幼虫的死亡率可达95％，与实验一中结果无显著性差异。

本实验条件下，外植体的转化效率为28.8％。

实施例2、转基因再生株通过游离小孢子培养快速得到纯合材料

一般情况下，获得的转基因植株中，外源基因都是呈杂合态存在，如果受体材料自生的遗传背景也是杂合的，如在甘蓝类作物中，常规需要8-10年时间的自交，才能获得完全纯合的材料，用于杂交制种。本实验采用单倍体育种方法，结合转基因材料的特性，在1-2年的时间内快速培育出纯合的转基因材料。

将抗虫性良好的转基因羽衣甘兰供体母株173-2，173-6，173-7，173-8，173-9栽种于具有防虫网的塑料大棚内，在3-6月上旬采集小孢子用本发明的方法进行体外培养，可以一次性获得纯合的转基因植株。具体过程包括以下步骤：

实验一、纯合体的获得

1)游离小孢子培养

通过细胞核的DAPI荧光染色(Colemen A W，Goff L J.Application offluorochrome to pollen biology I.Mithramyc in and 4’，6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)as vital stain and for quantification ofnuclear DNA.Stain Technol，1985，60：145-154)，显微镜检，确定小孢子的发育时期，取含70％单核靠边期小孢子细胞和30％双核期小孢子细胞的花蕾，将花蕾用体积比为2.5％的次氯酸钠水溶液表面灭菌15分钟，无菌水清洗3次，用杵棒挤压法在B5培养液中释放出游离小孢子，经50μm孔径尼龙网过滤悬浮液，1000rpm离心5分钟，弃上清，以B5培养液重新悬浮沉淀，再重复清洗2次后，将小孢子接种于胚状体诱导培养基中，至终浓度为10⁵个/mL，分装于培养皿中，每皿2.5mL，接着在33℃、黑暗条件下高温胁迫处理24小时后，再转入25℃、黑暗条件下培养，以诱导胚状体。3天后，培养于胚状体诱导培养基中的小孢子即开始出现一次分裂，在以后的培养时间里细胞持续分裂，依次形成细胞团、原胚、球形胚和心型胚，约25天后形成鱼雷期、子叶期胚(图6)。之后，转入25℃、2000Lux、16小时光照/天条件下培养7天。

B5培养液的组成及浓度与文献“Gamborg et al.Plant tissue culture media.In vitro，1976，12：473-478”中所述相同。

胚状体诱导培养基如表3所述。

2)分化及筛选培养

将步骤1)得到的胚状体接种于分化及筛选培养基中，在25℃、2000Lux、16小时光照/天条件下进行分化培养20天，部分胚状体长出绿色茎、叶(图7A)，部分胚状体在该分化及筛选培养基上直接变黄、枯死，部分胚状体即使长出了茎叶，也慢慢变黄枯死(图7B)，说明自原始转化再生株中，通过花粉培养，分离出了携带外源基因的配子体和没有携带外源基因的配子体形成的植株，实现了外源基因的纯合。

分化及筛选培养基如表3所述。

3)生根培养

将长出茎、叶的绿色植株转接入生根培养基中，在25℃、2000Lux、16小时光照/天条件下进行生根培养，得到羽衣甘兰完整再生植株。生根培养基如表3所述。

4)移栽、采种

洗净植株根部附带的琼脂，移栽入基质(草炭∶蛭石＝1∶1)中。花期植株常规套袋自交授粉，收获种子。

5)纯合转基因材料的鉴定

将约200粒种子播种于苗盘中，子叶长出后，喷施0.5％(V/V)Basta水溶液(含PPT 750mg/L)，隔周喷施，共二次。三周后调查幼苗的除草剂抗性分离情况。结果表明，小孢子培养获得的再生株中，外源基因均已纯合，其后代全部抗除草剂，不发生抗性分离现象(图8)。

0.5％(V/V)Basta水溶液(含PPT 750mg/L)就是将Basta溶于水得到的，0.5％(V/V)Basta水溶液中PPT的浓度为750mg/L。

至此，在三年的时间内快速获得了抗虫兼抗除草剂的纯合转基因观赏羽衣甘蓝材料。

表3、用于转基因羽衣甘兰游离小孢子培养的培养基配方及灭菌方式

实验二、纯合体的获得

1)游离小孢子培养

小孢子的获得：取含70％单核靠边期小孢子细胞和30％双核期小孢子细胞花蕾中的小孢子，方法与实验一中所述相同。

将小孢子接种于胚状体诱导培养基中，在33℃、黑暗条件下高温胁迫处理24小时后，再转入25℃、黑暗条件下培养，以诱导胚状体，约25天后形成鱼雷期、子叶期胚；再转入25℃、2000Lux、16小时光照/天条件下培养7天。

胚状体诱导培养基与实验一中胚状体诱导培养基的不同之处在于：6-BA在胚状体诱导培养基中的浓度为0.5mg/L。

2)分化培养

将步骤1)得到的胚状体接种于分化及筛选培养基中，在25℃、2000Lux、16小时光照/天条件下进行分化培养20天，部分胚状体长出绿色茎、叶(图7A)，部分胚状体在该分化及筛选培养基上直接变黄、枯死，部分胚状体即使长出了茎叶，也慢慢变黄枯死(图7B)，说明自原始转化再生株中，通过花粉培养，分离出了携带外源基因的配子体和没有携带外源基因的配子体形成的植株，实现了外源基因的纯合。

分化及筛选培养基的组成与实验一中分化及筛选培养基的不同之处在于：PPT在分化及筛选培养基中的浓度为5.5mg/L。

3)生根培养

将长出茎、叶的绿色植株转接入生根培养基中，在25℃、2000Lux、16小时光照/天条件下进行生根培养，得到羽衣甘兰完整再生植株。生根培养基的组成与实验一中生根培养基的不同之处在于：PPT在生根培养基中的浓度为5.5mg/L。

4)移栽、采种

方法与实验一中所述相同。

5)纯合转基因材料的鉴定

将约200粒种子播种于苗盘中，子叶长出后，喷施0.5％(V/V)Basta水溶液(含PPT 750mg/L)，隔周喷施，共二次。三周后调查幼苗的除草剂抗性分离情况。结果表明，其后代全部抗除草剂，不发生抗性分离现象，说明小孢子培养获得的再生株中，外源基因均已纯合。

至此，在三年的时间内快速获得了抗虫兼抗除草剂的纯合转基因观赏羽衣甘蓝材料。

实验三、纯合体的获得

1)游离小孢子培养

小孢子的获得：取含70％单核靠边期小孢子细胞和30％双核期小孢子细胞花蕾中的小孢子，方法与实验一中所述相同。

将小孢子接种于胚状体诱导培养基中，在33℃、黑暗条件下高温胁迫处理24小时后，再转入25℃、黑暗条件下培养，以诱导胚状体，约25天后形成鱼雷期、子叶期胚；再在25℃、2000Lux、16小时光照/天条件下培养7天。

胚状体诱导培养基与实验一中胚状体诱导培养基的不同之处在于：6-BA在胚状体诱导培养基中的浓度为1.2mg/L。

2)分化培养

将步骤1)得到的胚状体接种于分化及筛选培养基中，在25℃、2000Lux、16小时光照/天条件下进行分化培养20天，部分胚状体长出绿色茎、叶(图7A)，部分胚状体在该分化及筛选培养基上直接变黄、枯死，部分胚状体即使长出了茎叶，也慢慢变黄枯死(图7B)，说明自原始转化再生株中，通过花粉培养，分离出了携带外源基因的配子体和没有携带外源基因的配子体形成的植株，实现了外源基因的纯合。

分化及筛选培养基的组成与实验一中分化及筛选培养基的不同之处在于：PPT在分化及筛选培养基中的浓度为8.5mg/L。

3)生根培养

将长出茎、叶的绿色植株转接入生根培养基中，在25℃、2000Lux、16小时光照/天条件下进行生根培养，得到羽衣甘兰完整再生植株。

生根培养基的组成与实验一中生根培养基的不同之处在于：PPT在生根培养基中的浓度为8.5mg/L。

4)移栽、采种

方法与实验一中所述相同。

5)纯合转基因材料的鉴定

将约200粒种子播种于苗盘中，子叶长出后，喷施0.5％(V/V)Basta水溶液(含PPT 750mg/L)，隔周喷施，共二次。三周后调查幼苗的除草剂抗性分离情况。结果表明，其后代全部抗除草剂，不发生抗性分离现象，说明小孢子培养获得的再生株中，外源基因均已纯合。

至此，在三年的时间内快速获得了抗虫兼抗除草剂的纯合转基因观赏羽衣甘蓝材料。

序列表

<110>北京市农林科学院

<120>一种快速培育纯合抗虫兼抗除草剂转基因观赏羽衣甘蓝的方法

<160>3

 

<210>1

<211>1920

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

atggacaaca acccaaacat caacgagtgc atcccgtaca actgcctcag caaccctgag     60

gtcgaggtgc tcggcggtga gcgcatcgag accggttaca cccccatcga catctccctc    120

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gtggacatca tctggggcat ctttggcccc tcccagtggg acgccttcct ggtgcaaatc    240

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ctggacattg tgtccctctt cccgaactac gactcccgca cctacccgat ccgcaccgtg    780

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aacagcatca ctatctacac cgatgcccac cgcggcgagt actactggtc cggccaccag    960

atcatggcct ccccggtcgg cttcagcggc cccgagttta cctttcctct ctacggcacg   1020

atgggcaacg ccgctccaca acaacgcatc gtcgctcagc tgggccaggg cgtctaccgc   1080

accctgagct ccaccctgta ccgcaggccc ttcaacatcg gtatcaacaa ccagcagctg   1140

tccgtcctgg atggcactga gttcgcctac ggcacctcct ccaacctgcc ctccgctgtc   1200

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cgcaggacct ccccgggcca gatcagcacc ctccgcgtca acatcaccgc tcccctgtcc    1560

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atcgacggca ggccgatcaa tcagggtaac ttctccgcca ccatgtccag cggcagcaac    1680

ctccaatccg gcagcttccg caccgtgggt ttcaccaccc ccttcaactt ctccaacggc    1740

tccagcgttt tcaccctgag cgcccacgtg ttcaattccg gcaatgaggt gtacattgac    1800

cgcattgagt tcgtgccagc cgaggtcacc ttcgaagccg agtacgacct ggagagagcc    1860

cagaaggctg tcaatgagct cttcacgtcc agcaatcaga tcggcctgaa gacctgatag    1920

 

<210>2

<211>2783

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

ggatccatgg acaacaaccc aaacatcaac gagtgcatcc cgtacaactg cctcagcaac     60

cctgaggtcg aggtgctcgg cggtgagcgc atcgagaccg gttacacccc catcgacatc    120

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ggcctcgtgg acatcatctg gggcatcttt ggcccctccc agtgggacgc cttcctggtg    240

caaatcgagc agctcatcaa ccagaggatc gaggagttcg ccaggaacca ggccatcagc    300

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ctgatcggca actacaccga ccacgctgtc cgctggtaca acactggcct ggagcgcgtc    660

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accgtcctgg acattgtgtc cctcttcccg aactacgact cccgcaccta cccgatccgc    780

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atcctcaaca gcatcactat ctacaccgat gcccaccgcg gcgagtacta ctggtccggc    960

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tctttgatga accagatgca ttttattaac caattccata tacatataaa tattaatcat    2640

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aagtgagata atttacagaa ttc                                            2783

 

<210>3

<211>552

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

atgagcccag aacgacgccc ggccgacatc cgccgtgcca ccgaggcgga catgccggcg     60

gtctgcacca tcgtcaacca ctacatcgag acaagcacgg tcaacttccg taccgagccg    120

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gtcgccgagg tggacggcga ggtcgccggc atcgcctacg cgggtccctg gaaggcacgc    240

aacgcctacg actggacggc cgaatcgacc gtgtacgtct ccccccgcca ccagcggacg    300

ggactgggct ccacgctcta cacccacctg ctgaagtccc tggaggcaca gggcttcaag    360

agcgtggtcg ctgtcatcgg gctgcccaac gacccgagcg tgcgcatgca cgaggcgctc    420

ggatatgccc cccgcggcat gctgcgggcg gccggcttca agcacgggaa ctggcatgac    480

gtgggtttct ggcagctgga cttcagcctg ccggttccgc cccgtccggt cctgcccgtc    540

accgagattt ag                                                        552