聚酰胺-胺树型高分子改性的大孔交联壳聚糖微球和制备方法

摘要

本发明涉及一种聚酰胺-胺树型高分子改性的大孔交联壳聚糖微球和制备方法，具体为低代数(Genaration≤3)聚酰胺-胺(Polyamidoamine，简称PAMAM)树枝状大分子(Dendrimers)改性的大孔交联壳聚糖微球和制备方法。它是以壳聚糖为原料，蔗糖作致孔剂，戊二醛作交联剂，通过反相悬浮反应制备交联大孔壳聚糖微球，随后用低代数(genaration≤3)聚酰胺-胺树型高分子为胺化试剂，对微球进行化学改性。微球平均粒径在100-170μm。改性的交联大孔壳聚糖微球CS-G0，CS-G1.0，CS-G2.0，CS-G3.0微球的氨基含量分别为4.63，5.30，5.41，4.84mmol/g。本发明材料制备方法步骤简单，通过改性后提高了微球的氨基含量，并用于水溶液中胆红素的吸附，对胆红素的吸附性能均高于未改性的壳聚糖微球。

说明书

技术领域

本发明涉及胆红素吸附材料的制备，特别是一种聚酰胺-胺树型高分子改性的大孔交联壳聚糖微球和制备方法，具体为低代数(Genaration≤3)聚酰胺-胺(Polyamidoamine，简称PAMAM)树枝状大分子(Dendrimers)改性的大孔交联壳聚糖微球和制备方法，该大孔交联壳聚糖微球是吸附性能高的吸附材料，用于治疗高胆红素血症。

背景技术

胆红素是人体内衰老的红细胞中血红素的正常代谢产物，在人体内主要以两种形态存在：一种是游离胆红素，另一种是结合胆红素(与血清白蛋白和葡萄糖醛酸结合)。胆红素是人体一种脂溶性的内毒素，因此在生理环境下是不溶的，正常情况下，它在血液中与人血清白蛋白结合成水溶性复合物经由血液运输到肝脏，在肝脏内与白蛋白分离后与葡萄糖醛酸结合成水溶性更好的络合物由肝细胞排泄到胆汁中，进一步代谢排除体外，从而维持体内胆红素浓度在正常值。但当胆红素的某一个或几个代谢环节出现障碍时，导致血清总胆红素浓度超过正常水平，出现高胆红素血症(黄疸)，尤其在新生婴儿中，进一步引起各种组织的细胞死亡尤其是大脑细胞，导致智障，脑瘫甚至是死亡；同时造成肝或胆管功能紊乱，加重肝损伤，尤其是肝炎病人，因此，血清胆红素浓度是各种肝病的重要指标。

近年来，已发展了多种高胆红素血症的治疗技术，如光线疗法，血浆置换(血浆除去)，血液/血浆灌注，血液/血浆透析，血液过滤，血液透析过滤，分子吸附再循环系统和普罗米修斯系统等血液净化疗法。其中具有良好吸附性能的胆红素吸附剂成为人们研究的重点。早期使用的有活性炭、琼脂糖等，后来又相继发展了苯乙烯二乙烯苯微球，交联壳聚糖树脂，胍基固定化的交联聚乙烯醇水凝胶，环糊精，交联聚甲基丙烯酸羟乙酯树脂，三嗪染料等染料配基亲和吸附微球和吸附膜，胆红素分子印迹聚合物，人(牛)血清白蛋白等生物配基聚合物，多聚赖氨酸膜，纳米级二氧化钛膜，水凝胶衍生化的二氧化钛微粒，碳纳米管等新型吸附剂。作为生物医用材料，吸附剂应该具有安全无毒，好的生物相容性尤其是血液相容性，高的吸附容量，特异性吸附，很好的机械和物理稳定性。目前所用吸附剂不能得到令人满意的临床效果，血液相容性差和吸附容量低是主要的原因。

树枝状高分子是近十几年发展起来的一种具有三维结构的、高度有序的新型高分子，是聚合物合成科学上的研究热点之一，与传统的线性聚合物在结构上有着很大的区别，它由引发核、内层重复单元和外层端基组成，具有高度的几何对称性、精确的分子结构、大量的表面官能团和内部空腔，具有广泛的潜在用途。聚酰胺-胺树型(枝状)高分子是迄今研究最广泛、最深入的树枝状高分子之一，目前已被广泛应用于生物医学、材料改性、工业催化、石油开采等领域，其半代产品(Gn.5)均为酯基结尾，整代产品(Gn.0)均为氨基结尾。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的聚酰胺-胺树型高分子改性的大孔交联壳聚糖微球和制备方法。采用来源广泛的具有良好生物相容性的多羟基和氨基的天然高分子化合物壳聚糖为原料，制备了戊二醛交联的大孔壳聚糖微球，随后用富含氨基的低代数(Genaration≤3)聚酰胺-胺树枝状大分子为胺化试剂，对微球进行了改性，得到改性的交联大孔壳聚糖微球，提高了微球的氨基含量，用于治疗高胆红素血症。本发明材料制备方法步骤简单。

本发明提供的聚酰胺-胺树型高分子改性的大孔交联壳聚糖微球是以壳聚糖为原料，蔗糖作致孔剂，戊二醛作交联剂，通过反相悬浮反应制备交联大孔壳聚糖微球，随后用低代数(genaration≤3)聚酰胺-胺树型高分子为胺化试剂，对微球进行化学改性。微球平均粒径在100-170μm。所述的壳聚糖与蔗糖的质量比为：1-2∶6，所述的壳聚糖与戊二醛的质量比为：1.3-2.6∶1。

本发明提供的低代数(genaration≤3)聚酰胺-胺(PAMAM)树型高分子改性的大孔交联壳聚糖微球的制备方法包括的步骤：

1)壳聚糖微球(CS)的制备：四氯化碳和液体石蜡作油相，span-80作分散剂，蔗糖作致孔剂，壳聚糖的乙酸水溶液与蔗糖水溶液作水相，先用甲醛对壳聚糖上的部分游离氨基进行保护，再用戊二醛作交联剂，用反相悬浮法(以油相为分散相，水相为反应相的反应方式)制得保护氨基的交联壳聚糖微球。

所述的壳聚糖的分子量为10.6×10⁴，脱乙酰度为85％，液体石蜡和四氯化碳体积比为1-2.3∶1，壳聚糖的乙酸水溶液浓度为5％，其中乙酸水溶液浓度为2％(v/v)，绵白糖水溶液浓度为50％，壳聚糖溶液与蔗糖水溶液的体积比为2-4∶1，壳聚糖溶液与37％的甲醛水溶液的体积比为35-50∶1，壳聚糖溶液与50％的戊二醛水溶液的体积比为15-30∶1，油相和水相体积比为2∶1。

2)0代壳聚糖微球(CS-G0)的制备：在酸性溶液条件下，保护氨基的交联壳聚糖微球与环氧氯丙烷反应，形成羟丙基氯化壳聚糖微球(HPCS)，HPCS再与己二胺胺化试剂反应得到CS-G0微球，最后脱掉微球上的甲醛保护，释放出更多的氨基。反应式表示为：

所述的酸(高氯酸，HClO4)和环氧氯丙烷与壳聚糖微球的比为2-5∶5∶1(ml/ml/g)，羟丙基氯化反应温度为50-70℃，反应时间为8-12h，胺化反应温度为50-70℃，反应时间为12-24h，微球脱甲醛反所用的酸为0.5mol/LHCl，反应温度为室温，反应时间为12-24小时。

3)1.0代壳聚糖微球(CS-G1.0)的制备：以脱甲醛的CS-G0微球为原料，按照PAMAM的合成方法，与丙烯酸甲酯(MA)和己二胺(HDA)交替反应，发散法(目前树状PAMAM分子的主要合成法，即从中心核出发，由内向外合成大分子)制备壳聚糖微球胺基化衍生物CS-G1.0微球。

室温下，以乙醇为溶剂，氩气保护，CS-G0微球与MA反应进行彻底的Michael加成(迈克尔加成)反应，得到CS-G0.5微球；同样的反应条件下，CS-G0.5微球再与HDA进行胺化反应得到CS-G1.0微球。

所述的CS-G0微球上的氨基与MA的摩尔比为1∶2.5-5；CS-G0微球的氨基含量为4.63mmol/g，CS-G0微球与MA的质量比约为1∶1-2；所述的CS-G0.5微球与HAD的质量比为1∶4.5-7.5。

通过重复交替进行Michael加成反应和酰胺化反应可以得到不同代数的PAMAM衍生化壳聚糖微球。

4)2.0代壳聚糖微球(CS-G2.0)的制备：以CS-G1.0微球为原料，方法同步骤3)。

5)3.0代壳聚糖微球(CS-G3.0)的制备：以CS-G2.0微球为原料，方法同步骤3)。

本发明提供的聚酰胺-胺树型高分子改性的大孔交联壳聚糖微球选用来源广泛的具有良好生物相容性的多羟基和氨基的天然高分子化合物壳聚糖为原料，制备了戊二醛交联的大孔壳聚糖微球，接着用富含氨基的低代数(Genaration≤3)聚酰胺-胺树枝状高分子为胺化试剂，对微球进行了改性，提高了微球的氨基含量，并用于水溶液中胆红素的吸附，对胆红素的吸附性能均高于未改性的壳聚糖微球。

附图说明

图1.胆红素结构式。

图2.聚酰胺-胺树枝状高分子结构示意图；(a)整代产品(PAMAM-G3.0)；(b)半代产品(PAMAM-G3.5)。

图3.壳聚糖微球的SEM图。

图4.不同代数壳聚糖微球的FT-IR谱图。a)整代产品(CS-Gn.0)；(b)半代产品(CS-Gn.5)。

图5不同代数微球对胆红素的吸附曲线。a)整代产品(CS-Gn.0)；(b)半代产品(CS-Gn.5)。

具体实施方式：

实施例1：CS微球的制备。在1000ml的三口瓶中，分别加入200ml四氯化碳、200ml液体石蜡和0.9g span-80，电动搅拌下，加入提前混和均匀的200ml 5％的壳聚糖(壳聚糖的分子量为10.6×10⁴，脱乙酰度为85％)乙酸(2％)水溶液和50％的蔗糖溶液(壳聚糖溶液和蔗糖溶液的体积比为3∶1)，调节搅拌速度，40分钟后壳聚糖溶液分散为合适大小的珠滴，室温下，滴加3ml、37％的甲醛溶液，1h后，升温至40℃，滴加10ml、50％的戊二醛溶液。2h后凝胶化完成，升温至60℃，滴加10％的NaOH溶液，调pH值至9-10，反应12h，使球固化，抽滤。乙醇和石油醚反复洗涤几次，水洗至中性，转至索式提取器中，用石油醚无水乙醇混合液(v/v＝1)提取8h，取出后用60-70℃的热水反复浸泡洗涤壳聚糖微球，除去蔗糖致孔剂。最后经40℃真空(0.1MPa)干燥24h，即得保护氨基的戊二醛交联壳聚糖微球。微球加入一定量0.5mol/l HCl，室温浸泡，脱去甲醛的保护。24h后水洗至中性，加入一定量5％NaOH溶液浸泡。3-4h后水洗至中性，经40℃真空(0.1MPa)干燥24h，即得到去甲醛保护的CS微球，微球上的氨基含量测定参照中华人民共和国国家标准GB 5760-86(阴离子交换树脂交换容量测定方法)，结果见表1。所得微球结构由扫描电子显微镜确定，见图3。由图可见，微球是大孔的且具有很好的球形，粒径比较均匀，平均粒径在100-170μm，具有较窄的粒径分散性，彼此没有发生粘连。

实施例2：HPCS微球的制备。三颈烧瓶中加入8g未脱甲醛的壳聚糖微球(粒径分布150-170μm，提前用去离子水充分溶胀)，40ml环氧氯丙烷，60℃下电动搅拌0.5h，恒压分液漏斗缓慢滴加24ml HClO₄，反应10h，抽滤，微球用去离子水、无水乙醇反复浸泡洗涤至中性，经40℃真空(0.1MPa)干燥24h，得到HPCS微球，其红外谱图见图4(b)。由图可见，C-Cl吸收峰出现在625cm-1附近，证明羟丙基氯化反应是成功的。

实施例3：CS-G0微球的制备。取8g HPCS微球(粒径分布150-170μm，提前用去离子水充分溶胀)于三颈烧瓶中，加入80ml己二胺，60℃，机械搅拌反应12h，抽滤，微球水洗至中性，按照实施例1方法脱去甲醛的保护，得到CS-G0微球。其氨基含量测定方法同实施例1，结果见表1。其红外谱图见图4(a)，由图可见，对比图4(b)中HPCS微球谱图，在625cm^-1附近的C-Cl吸收峰消失了，证明HDA已经成功的接到了HPCS微球上，而且反应很彻底；结合表1中HPCS与CS-G0微球的氨基含量可进一步证明此反应是成功的。

实施例4：CS-G0.5微球的制备。三颈烧瓶中加入9g脱甲醛的CS-G0微球(粒径分布150-170μm，提前用去离子水充分溶胀)，15ml MA和40ml乙醇，氩气保护，电动搅拌，室温下反应24h。抽滤，微球用甲醇浸泡洗涤，抽滤，所得产品一部分湿态保存，用于合成CS-G1.0微球，剩下的产品经40℃真空(0.1MPa)干燥24h，得到CS-G0.5微球。其氨基含量测定方法同实施例1，结果见表1。其红外谱图见图4(b)，由图可见，对比图4(a)中CS-G0微球谱图，在1737cm-1附近出现酯基的强特征吸收峰，证明MA已经成功的接到了CS-G1.0微球上。

实施例5：CS-G1.0微球的制备。三颈烧瓶中加入10g湿态CS-G0.5微球(粒径分布150-170μm)和60ml乙醇，电动搅拌，氩气保护，200ml HDA溶于100ml乙醇中冷却至室温后加入瓶中，冰水浴快速搅拌1h，升至室温，反应96h。抽滤，水洗至中性，乙醇浸泡洗涤数次，所得产品一部分湿态保存，用于合成CS-G1.5微球，剩下的产品经40℃真空(0.1MPa)干燥24h，得到CS-G1.0微球。其氨基含量测定方法同实施例1，结果见表1。其红外谱图见图4(a)，由图可见，在1650和1559cm^-1附近出现酰胺基中的C＝O特征吸收峰，对比图4(b)的CS-G0.5谱图，1737cm^-1附近酯基的强吸收消失了，说明CS-G0.5基本上全部转化成了CS-G1.0；结合表1中的氨基含量高于CS-G0.5，可以判断CS-G1.0微球的合成反应是成功的。

实施例6：CS-G1.5微球的制备。本实施例与实施例4的操作步骤相同，所不同的是采用湿态CS-G1.0微球。其氨基含量测定方法同实施例1，结果见表1。其红外谱图见图4(b)，由图可见，与CS-G0.5谱图相似，对比CS-G1.0谱图，在1737cm^-1附近出现酯基的强特征吸收峰，同时在1645和1550cm^-1附近也存在酰胺基中的C＝O特征吸收峰，结合表1中氨基含量低于CS-G1.0，可以判断CS-G1.5微球的合成反应是成功的。

实施例7：CS-G2.0微球的制备。本实施例与实施例5的操作步骤相同，所不同的是采用湿态CS-G1.5微球。其氨基含量测定方法同实施例1，结果见表1。其红外谱图见图4(a)，由图可见，与CS-G1.0谱图相似，对比图4(b)的CS-G1.5谱图，在1737cm^-1附近的酯基的强特征吸收峰消失了，说明CS-G1.5基本上全部转化成了CS-G2.0；同时在1650和1559cm^-1附近存在酰胺基中的C＝O特征吸收峰，结合表1中氨基含量高于CS-G1.5，可以判断CS-G2.0微球的合成反应是成功的。

实施例8：CS-G2.5微球的制备。本实施例与实施例4的操作步骤相同，所不同的是采用湿态CS-G2.0微球。其氨基含量测定方法同实施例1，结果见表1。其红外谱图见图4(b)，由图可见，与CS-G0.5、CS-G1.5谱图相似，对比CS-G2.0谱图，在1737cm^-1附近出现酯基的强特征吸收峰，同时在1645和1550cm^-1附近也存在酰胺基中的C＝O特征吸收峰，结合表1中氨基含量低于CS-G2.0，可以判断CS-G2.5微球的合成反应是成功的。

实施例9：CS-G3.0微球的制备。本实施例与实施例5的操作步骤相同，所不同的是采用湿态CS-G2.5微球。其氨基含量测定方法同实施例1，结果见表1。其红外谱图见图4(a)，由图可见，与CS-G1.0、CS-G2.0谱图相似，对比图4(b)的CS-G1.5谱图，在1737cm^-1附近的酯基的强特征吸收峰消失了，说明CS-G2.5基本上全部转化成了CS-G3.0；同时在1650和1559cm^-1附近存在酰胺基中的C＝O特征吸收峰，结合表1中氨基含量高于CS-G2.5，可以判断CS-G3.0微球的合成反应是成功的。

表1.各微球氨基含量(脱甲醛，粒径150-170μm)

  氨基含  量  mmol/g  CS  HPCS  CS-G0  CS-G0.5  CS-G1.0  CS-G1.5  CS-G2.0  CS-G2.5  CS-G3.0  3.06  2.91  4.63  3.83  5.30  4.01  5.41  3.84  4.84