衍生自纤溶酶原激活物抑制剂-1的肽和其应用

摘要

本发明涉及对应于人类纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)的氨基酸残基369-386的分离的18-mer肽和其片段、包含它们的组合物、及上述物质用于治疗血栓栓塞性疾病和与神经学损伤相关的病理状态的应用。

说明书

发明领域

本发明涉及衍生自人类纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)的肽、包含它们的组合物、和上述物质用于治疗血栓栓塞性疾病和与神经学损伤相关的病理状态的应用。

发明背景

每年在美国有大约750,000名患者发展缺血性中风，其中约150,000个发病是致命的。尽管努力了多于50年(Zivin，J.A.1999.Neurology 53，14-19)，血栓溶解剂组织型纤溶酶原激活物(tPA)仍是FDA批准的用于急性中风的唯一疗法。然而，其短的治疗窗和治疗后并发症包括颅内出血(ICH)的高发生率已经使tPA的临床使用限制于表现中风症状的所有患者的大约3％(Lapchak，P.A.2002.Curr Neurol Neurosci Rep.2，1-6；Nagai，N.等人2001.Blood 97，3086-3092)。阻止tPA对中枢神经系统(CNS)的副作用很可能会增强治疗益处并提供改善中风影响的新方法。

tPA的有害作用可能不专门地涉及其溶解蛋白活性。本发明的发明人和合作者此前已经报道，外源tPA减少大鼠(Nassar，T.等人2004.Blood 103，897-902)和幼猪(Armstead，W.M.等人2004.J Neurotrauma 21，1204-1211)中脑血管阻力；液压冲击脑损伤(FPI)后CNS中的tPA水平升高，液压冲击脑损伤被认为是模拟震荡性创伤性脑损伤(Gennarrelli，T.A.1994.JNeurotrauma 11，357-368)；且施用所检查浓度的tPA在未进行过试验的动物中引起脑血管舒张(Nassar，T.等人2004，同前；Armstead，W.M.等人2004，同前；Armstead，W.等人2005.Develop Brain Res，156，139-146)。

本发明发明人的国际专利申请公开WO 03/006042公开了具有氨基酸序列EEIIMD的衍生自纤溶酶原激活物-1(PAI-1)的六氨基酸肽，其能够减少由纤维蛋白溶解剂如，tPA、uPA、tcuPA、链激酶、rt-PA或阿替普酶、rt-PA衍生物或茴香酰链激酶复合物引起的不期望的副作用，诸如大脑内出血。在公开的实验方案中，在较晚阶段将肽引入溶解血栓治疗方案以阻止最初的纤维蛋白溶解剂的血管活性或副作用。进一步报道，PAI-1与PAI-1衍生的肽EEIIMD抑制tPA-介导的信号转导(Akkawi，S.等人2006.Am JPhysiol Heart Circ Physiol.291，H1351-1359)而不损害其催化活性。

本发明发明人的国际专利申请公开WO 03/095476教导联同一种或多种纤维蛋白溶解剂施用肽EEIIMD、或肽乙酰基-RMAPEEIIMDRPFLYVVR-酰胺、抗-LRP抗体或LRP拮抗剂以增强溶解纤维蛋白活性，减少由于纤维蛋白溶解剂导致的血管活性带来的副作用，和/或延长纤维蛋白溶解剂的半衰期。此发明进一步涉及包括多肽EEIIMD和/或Ac-RMAPEEIIMDRPFLYVVR-酰胺肽与一种或多种目前使用的纤溶酶原激活物的联合组合物和/或治疗方案。

本发明发明人的美国专利申请公开US2006/0069035公开，EEIIMD肽减少预防或治疗血栓栓塞性病症所需的血栓溶解剂的有效剂量。这反过来减少血栓溶解剂的副作用的风险，此副作用在治疗的晚期出现。

Higazi和Cines的国际申请公开WO 2008/018084公开了肽EEIIMD和其6-mer肽类似物在预防神经损伤和治疗脑损伤中的应用。

对用于治疗血栓栓塞性病症、尤其是关于缺血性中风和神经学疾病的血栓栓塞性病症的改进的、高度有效手段仍有未满足的需要。

发明概述

本发明提供由对应于人类PAI-1的氨基酸区段369-386的18氨基酸残基组成的分离的肽、和其由包含序列EEIIMD的7至17个氨基酸残基组成的片段。这些肽特别可用于治疗外源和/或内源组织型纤溶酶原激活物(tPA)相关的神经学损伤。

现在首次公开，具有对应于人类PAI-1的区段369-386的氨基酸序列R₁-Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp-Arg-Pro-Phe-Leu-Phe-Val-Val-Arg-R₂(SEQ ID NO：1)的18-mer肽、及其某些类似物和片段具有神经保护活性，所述18-mer肽、及其某些类似物和片段包括具有氨基酸序列乙酰基-RMAPEEIIMDRPFLYVVR-酰胺(SEQ ID NO：2)的已知的18-mer肽类似物。

本发明公开，18-mer肽在已经造成脑损伤的动物模型中高度有效地减少tPA-引起的脑水肿和tPA-引起的颅内出血。该18-mer肽在动物模型中还非常有效地减少机械性中风后tPA-引起的死亡率。发现本发明的18-mer肽比具有氨基酸序列Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp(SEQ ID NO：11)的6-mer肽施加更高的神经保护活性。

出乎意料地，本发明的肽阻碍与外源施用的tPA和内源tPA两者有关的有害作用。而且，发现本发明的18-mer肽阻碍与内源tPA有关的有害作用的效力比已知的6-mer肽施加的效力高。因此，无论是由外源和/或内源tPA引起，脑梗塞、大脑内出血、水肿和死亡率的程度可被本发明的肽减少或甚至消灭而不损害tPA的溶解纤维蛋白活性。因此在其中为了纤维蛋白溶解治疗例行施用tPA的情形以及其中内源分泌tPA的情形中，本发明的肽高度适用于治疗与中枢神经系统的损伤有关的病理病症。

根据一方面，本发明提供分离的肽或其片段，所述肽具有列在SEQ IDNO：3：

R₁-Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp-Arg-Pro-Phe-Leu-Phe-Val-Val-Arg-R₂

的氨基酸序列，其中R₁选自氢、乙酰基、烃基(alkyl)和氨基封闭基团组成的组；且R₂选自羧基、酰胺、醇、酯和羧基封闭基团组成的组；且其中所述片段由包含氨基酸序列Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp的7至17个氨基酸残基组成。

根据一些实施方案，该肽具有选自以下组成的组的氨基酸序列：

如列在SEQ ID NO：1的乙酰基

-Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp-Arg-Pro-Phe-Leu-Phe-Val-Val-Arg-酰胺；

如列在SEQ ID NO：4的

Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp-Arg-Pro-Phe-Leu-Phe-Val-Val-Arg；

如列在SEQ ID NO：5的乙酰基

-Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp-Arg-Pro-Phe-Leu-Phe-Val-Val-Arg；和

如列在SEQ ID NO：6的

Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp-Arg-Pro-Phe-Leu-Phe-Val-Val-Arg-酰胺。

根据某些实施方案，该肽是具有列在SEQ ID NO：1的氨基酸序列的18-mer肽。

根据另一方面，本发明提供包含分离的肽或其片段的药物组合物，所述肽具有列在SEQ ID NO：3：

R₁-Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp-Arg-Pro-Phe-Leu-Phe-Val-Val-Arg-R₂

的氨基酸序列，其中R₁选自氢、乙酰基、烃基和氨基封闭基团组成的组；且R₂选自羧基、酰胺、醇、酯和羧基封闭基团组成的组；且其中所述片段由包含氨基酸序列Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp的7至17个氨基酸残基组成，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

根据一些实施方案，该药物组合物中的肽具有选自以下组成的组的氨基酸序列：

如列在SEQ ID NO：1的乙酰基

-Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp-Arg-Pro-Phe-Leu-Phe-Val-Val-Arg-酰胺；

如列在SEQ ID NO：4的

Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp-Arg-Pro-Phe-Leu-Phe-Val-Val-Arg；

如列在SEQ ID NO：5的乙酰基

-Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp-Arg-Pro-Phe-Leu-Phe-Val-Val-Arg；和

如列在SEQ ID NO：6的

Arg-Met-AIa-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp-Arg-Pro-Phe-Leu-Phe-Val-Val-Arg-酰胺。

根据某些实施方案，该药物组合物中的肽是具有列在SEQ ID NO：1的氨基酸序列的18-mer肽。

根据进一步方面，本发明提供在患有神经学损伤或处于患有神经学损伤的风险的受治疗者中减少神经学损伤的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用包含治疗有效量的分离的肽或其片段的药物组合物，所述肽具有列在SEQ ID NO：7：

R₁-Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp-Arg-Pro-Phe-Leu-X₁-Val-Val-Arg-R₂

的氨基酸序列，其中R₁选自氢、乙酰基、烃基和氨基封闭基团组成的组；X₁选自Tyr和Phe组成的组；且R₂选自羧基、酰胺、醇、酯和羧基封闭基团组成的组；且其中所述片段由包含氨基酸序列Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp的7至17个氨基酸残基组成，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

根据又进一步方面，本发明提供在患有神经学损伤或处于患有神经学损伤的风险的受治疗者中减少神经学损伤的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用包含治疗有效量的纤维蛋白溶解剂和分离的肽或其片段的药物组合物，所述肽具有列在SEQ ID NO：7：

R₁-Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp-Arg-Pro-Phe-Leu-X₁-Val-Val-Arg-R₂

的氨基酸序列，其中R₁选自氢、乙酰基、烃基和氨基封闭基团组成的组；X₁选自Tyr和Phe组成的组；且R₂选自羧基、酰胺、醇、酯和羧基封闭基团组成的组；且其中所述片段由包含氨基酸序列Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp的7至17个氨基酸残基组成，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

根据一些实施方案，将用于减少神经学损伤的肽具有选自SEQ ID NO：1、2、4-6、8-10组成的组的氨基酸序列。根据某些实施方案，将使用的肽具有如列在SEQ ID NO：1的氨基酸序列。根据另一实施方案，将使用的肽具有如列在SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

根据另外的实施方案，该神经学损伤是中风、包括但不限于创伤性脑损伤(TBI)和缺血性脑损伤的脑损伤、脊髓损伤、脑手术、心脏手术和神经学疾病造成的。

根据进一步的实施方案，该神经学疾病选自阿尔茨海默病、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森病和肌萎缩侧索疾病组成的组。

根据又进一步的实施方案，该药物组合物通过静脉内、皮下、肌内、腹膜内、口服、局部、皮内、经皮、鼻内、硬膜外(epidural)、眼、阴道或直肠施用途径施用。根据某些实施方案，该药物组合物通过静脉内注射和/或输注施用。

根据一些实施方案，该纤维蛋白溶解剂选自tPA、uPA、scuPA、tcuPA、链激酶、rt-PA、阿替普酶、瑞替普酶、拉诺替普酶、TNK-rt-PA、茴香酰纤溶酶原链激酶复合物、阿尼普酶(anistreplase)和其衍生物组成的组。

根据另外的实施方案，该18-mer肽或其片段在施用纤维蛋白溶解剂之后施用。

根据进一步方面，本发明提供纤维蛋白溶解治疗方法，所述方法包括向有相应需要的受治疗者施用包含治疗有效量的纤维蛋白溶解剂和分离的肽或其片段的药物组合物，所述肽具有列在SEQ ID NO：7：

R₁-Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp-Arg-Pro-Phe-Leu-X₁-Val-Val-Arg-R₂

的氨基酸序列，其中R₁选自氢、乙酰基、烃基和氨基封闭基团组成的组；X₁选自Tyr和Phe组成的组；且R₂选自羧基、酰胺、醇、酯和羧基封闭基团组成的组，前提是排除如列在SEQ ID NO：2的肽；且其中所述片段由包含氨基酸序列Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp的7至17个氨基酸残基组成，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

根据一些实施方案，将用于纤维蛋白溶解治疗的肽具有选自SEQ IDNO：1、4-6、8-10的组成的组的氨基酸序列。根据某些实施方案，将使用的肽具有如列在SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

根据另外的实施方案，该纤维蛋白溶解剂选自tPA、uPA、scuPA、tcuPA、链激酶、rt-PA、阿替普酶、瑞替普酶、拉诺替普酶、TNK-rt-PA、茴香酰纤溶酶原链激酶复合物、阿尼普酶和其衍生物组成的组。

根据进一步的实施方案，该药物组合物通过静脉内、皮下、肌内、腹膜内、口服、局部、皮内、经皮、鼻内、硬膜外、眼、阴道或直肠施用途径施用。根据某些实施方案，该药物组合物通过静脉内注射和/或输注施用。

根据又进一步的实施方案，该肽或其片段在施用纤维蛋白溶解剂之后施用。

根据又进一步的方面，本发明提供分离的肽或其片段根据本发明的原则用于减少神经学损伤的应用，所述肽具有列在SEQ ID NO：7：

R₁-Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp-Arg-Pro-Phe-Leu-X₁-Val-Val-Arg-R₂

的氨基酸序列，其中R₁选自氢、乙酰基、烃基和氨基封闭基团组成的组；X₁选自Tyr和Phe组成的组；且R₂选自羧基、酰胺、醇、酯和羧基封闭基团组成的组；且其中所述片段由包含氨基酸序列Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp的7至17个氨基酸残基组成。

根据另一方面，本发明提供纤维蛋白溶解剂和分离的肽或其片段根据本发明的原则用于减少神经学损伤的应用，所述肽具有列在SEQ ID NO：7：

R₁-Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp-Arg-Pro-Phe-Leu-X₁-Val-Val-Arg-R₂

的氨基酸序列，其中R₁选自氢、乙酰基、烃基和氨基封闭基团组成的组；X₁选自Tyr和Phe组成的组；且R₂选自羧基、酰胺、醇、酯和羧基封闭基团组成的组；且其中所述片段由包含氨基酸序列Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp的7至17个氨基酸残基组成。

根据又进一步的方面，本发明提供纤维蛋白溶解剂和分离的肽或其片段用于纤维蛋白溶解治疗的应用，所述肽具有列在SEQ ID NO：7：

R₁-Arg-Met-Ala-Pro-Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp-Arg-Pro-Phe-Leu-X₁-Val-Val-Arg-R₂

的氨基酸序列，其中R₁选自氢、乙酰基、烃基和氨基封闭基团组成的组；X₁选自Tyr和Phe组成的组；且R₂选自羧基、酰胺、醇、酯和羧基封闭基团组成的组，前提是排除如列在SEQ ID NO：2的肽；且其中所述片段由包含氨基酸序列Glu-Glu-Ile-Ile-Met-Asp的7至17个氨基酸残基组成。

这些和进一步的实施方案将从以下的附图、详述和实施例变得明显。

附图简述

图1证实肽218O(序列Ac-RMAPEEIIMDRPFLYVVR-酰胺的18-mer肽类似物)、肽218N(对应于人类PAI-1的氨基酸残基369-386、具有序列Ac-RMAPEEIIMDRPFLFVVR-酰胺的18-mer肽)、和肽206(具有对应于人类PAI-1的氨基酸残基373-378的序列EEIIMD的6-mer肽)对猪中创伤性脑损伤(TBI)后脑含水量的作用。将动物暴露于液压冲击脑损伤(FPI)、FPI+肽206、肽218O、或肽218N(1mg/kg i.v.)、FPI+tPA(2mg/kg i.v.)、FPI+tPA+肽206、FPI+tPA+肽218O、或FPI+tPA+肽218N。显示每个组中7只动物的结果(平均值±SE)。

图2显示PAI-1衍生的肽：206、218O和218N在MCA机械性梗阻后用tPA治疗的大鼠中的神经保护作用的比较。对照大鼠接受盐水。显示的结果是每个组中10只大鼠梗塞大小(infarct size)的平均值±SE。

图3显示PAI-1衍生的肽：218O和218N在MCA机械性梗阻后用tPA治疗的大鼠中的神经保护作用的比较。对照大鼠接受盐水。

图4显示PAI-1衍生的肽：206、218O和218N在栓塞性中风后用tPA治疗的大鼠中的神经保护作用的比较。对照大鼠接受盐水。显示的结果是每组10只大鼠中梗塞大小的平均值±SD。

图5显示肽206、肽218O和肽218N对小鼠中tPA-引起的血脑屏障(BBB)打开的作用。

图6A-B显示肽218N对tPA相关的机械性中风后死亡率的作用。

图7显示在建立机械性中风后四小时用tPA与肽一起治疗的大鼠中，肽206、218O和218N对脑梗塞的作用。

发明详述

本发明部分地基于此发现：对应于人类PAI-1的氨基酸369-386的18-mer肽能够减少大鼠和猪的机械性中风模型中tPA-引起的脑梗塞体积或含水量增加。这一发现还表示，该肽能够减少未经受以外源tPA进行的任何治疗的猪中的创伤性脑损伤后的脑水肿。因此，本发明的肽有效地消除内源和/或外源tPA引起的有害副作用而不消除其有益的溶解纤维蛋白活性。

本发明的肽施加的神经保护活性高于以具有氨基酸序列EEIIMD的6-mer肽获得的神经保护活性。不希望受任何作用机理限制，这表示区段EEIIMD负责一些神经保护活性，然而相邻氨基酸残基对肽稳定性和/或肽构象的贡献是高度重要的，因为其显著地改进由6-mer肽施加的神经保护活性。

本发明提供具有如列在SEQ ID NO：3的氨基酸序列R₁-RMAPEEIIMDRPFLFVVR-R₂的分离的18-mer肽或其片段，其中该片段由包含序列EEIIMD的7至17个氨基酸残基组成。

具体地，本发明涉及如下肽：

1)Ac-RMAPEEIIMDRPFLFVVR-酰胺(SEQ ID NO：1)，下文称为218N*

2)Ac-RMAPEEIIMDRPFLYVVR-酰胺(SEQ ID NO：2)，下文称为218O**

3)RMAPEEIIMDRPFLFVVR(SEQ ID NO：4)

4)Ac-RMAPEEIIMDRPFLFVVR(SEQ ID NO：5)

5)RMAPEEIIMDRPFLFVVR-酰胺(SEQ ID NO：6)

6)RMAPEEIIMDRPFLYVVR(SEQ ID NO：8)

7)Ac-RMAPEEIIMDRPFLYVVR(SEQ ID NO：9)

8)RMAPEEIIMDRPFLYVVR-酰胺(SEQ ID NO：10)

9)EEIIMD(SEQ ID NO：11)，下文称为206

10)人类PAI-1的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：12)

*N是指新的；**O是指旧的。

本发明提供包含氨基酸序列EEIIMD的7至18-mer肽。然而，应理解的是在本发明范围内包括具有通式I：

R₁-Arg-Met-Ala-Pro-X₁-X₂-Ile-Ile-Met-X₃-Arg-Pro-Phe-Leu-X₄-Val-Val-Arg-R₂

的氨基酸序列的肽或其片段，其中R₁选自氢、乙酰基、烃基和氨基封闭基团组成的组；X₁选自Asp、Glu和Arg组成的组；X₂选自Asp和Glu组成的组；X₃选自Asp和Glu组成的组；X₄选自Phe和Tyr组成的组；且R₂选自羧基、酰胺、醇、酯和羧基封闭基团组成的组；且其中该片段由包含氨基酸序列X₁-X₂-Ile-Ile-Met-X₃的7至17个氨基酸残基组成，前提是排除具有列在SEQ ID NO：2的氨基酸序列乙酰基-RMAPEEIIMDRPFLYVVR-酰胺的肽。

因此，本发明提供包含序列EEIIMD的7至18-mer肽和其类似物。包括SEQ ID NO：2的肽的这些肽用于减少神经学损伤的应用涵盖在本发明中。还包括排除SEQ ID NO：2的肽的这些肽在纤维蛋白溶解治疗中的应用。

如遍及说明书和权利要求书使用的，术语“肽”表示由肽键彼此连接的氨基酸残基的线性段。遍及说明书和权利要求书，氨基酸残基由根据IUPAC协议的单字母代码或三字母代码表示。

术语“氨基酸”或“氨基酸残基”理解为包括20种天然产生的氨基酸。

本发明的肽由7至18个氨基酸残基组成。

本发明的肽可由本领域中已知的任何蛋白纯化方法分离。例如，可对PAI-1进行一种或多种溶解蛋白的酶处理以产生肽的混合物，可由本领域中已知的任何蛋白纯化方法进一步纯化该混合物以获得分离的肽。可选地或另外，可由化学剂诸如例如CNBr裂解PAI-1以产生肽的混合物，可进一步纯化该混合物以获得分离的肽。

本发明的肽还可由本领域公知的方法制备，包括化学合成或重组DNA技术。

合成本发明的肽的优选方法包括利用固相支持物的固相肽合成，如Merrifield(参见J.Am.Chem.Soc，85：2149，1964)所述。大规模的肽合成描述在例如Andersson等人(Biopolymers 55(3)：227-50，2000)。固相肽合成方法的实例包括BOC方法，其利用叔丁氧基羰基(tert-butyloxcarbonyl)作为α-氨基保护基团，和FMOC方法，其利用9-芴甲氧羰基(fluorenylmethyloxcarbonyl)来保护氨基酸残基的α-氨基，这两种方法都是本领域技术人员公知的。可选地，本发明的肽可由标准溶液合成方法合成(参见例如，Bodanszky，M.，Principles of Peptide Synthesis(肽合成原理)，Springer-Verlag，1984)。

根据本发明原理的肽不必由与列在SEQ ID NO：4的RMAPEEIIMDRPFLFVVR或列在SEQ ID NO：8的RMAPEEIIMDRPFLYVVR相同的氨基酸序列组成，只要每种肽类似物能够减少、阻止和/或抑制神经学损伤。

术语“类似物”包括包含对以上列出的肽通过氨基酸取代、缺失、或化学修饰而改变的序列且展现神经保护活性的任何肽。使用“氨基酸取代”表示，功能等价的氨基酸残基取代序列中的残基，从而导致沉默改变。例如，序列中的一个或多个氨基酸残基可被充当功能等价物的具有类似极性的另一氨基酸取代，从而导致沉默改变。序列中氨基酸的取代物可选自该氨基酸所属类别的其它成员。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。这种取代称为保守性取代。另外可进行非保守性取代，只要保持肽的神经保护活性。应理解的是本发明涵盖肽类似物，其中至少一个氨基酸被另一氨基酸取代以产生与以上列出的肽相比具有增加的稳定性或更长半衰期的肽类似物。

尽管本文以上列出的肽序列的氨基酸残基都是“L”异构体形式，“D”异构体形式的残基可取代任何L-氨基酸残基，只要该肽类似物保持神经保护活性。逆反(retro-inverso)D-氨基酸肽类似物的产生是本领域公知的，在逆反D-氨基酸肽类似物中，肽是以如公开的相同氨基酸制备的，但至少一个氨基酸以及可能所有氨基酸是D-氨基酸。当肽类似物中的所有氨基酸是D-氨基酸，且肽类似物的N-和C-末端逆转时，结果是具有在肽的L-氨基酸形式中相同位置的相同结构基团的类似物。然而，肽类似物对溶解蛋白性降解更稳定并因此可用于本文所述的应用中的许多应用。

本发明进一步涵盖以上列出的肽的肽衍生物。术语“衍生物”是指具有包含本发明的肽的氨基酸序列的氨基酸序列的肽，其中一个或多个氨基酸残基通过侧链或官能团反应而经受化学衍生化，其中所述衍生化不破坏肽衍生物的神经保护活性。氨基酸残基的化学衍生化包括但不限于乙酰化、酰胺化、糖基化、氧化、还原、十四烷基化、硫酸化、酰化、ADP-核糖基化、环化、二硫键形成、羟基化、碘化、和甲基化。

根据本发明原理的肽衍生物还包括键修饰，包括但不限于CH₂-NH、CH₂-S、CH₂-S＝O、O＝C-NH、CH₂-O、CH₂-CH₂、S＝C-NH、CH＝CH、CF＝CH和骨架修饰。肽中的肽键(-CO-NH-)可被以下取代，例如N-甲基化键(-N(CH₃)-CO-)；酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N)；南五味子酮键(-CO-CH₂-)；α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)，其中R是任何烃基基团如甲基；碳氮键(carbabond)(-CH₂-NH-)；羟基次乙基键(-CH(OH)-CH₂-)；硫酰胺键(-CS-NH-)；烯双键(-CH＝CH-)；和肽衍生物(-N(R)-CH₂-CO-)，其中R是碳原子上天然存在的“正常”侧链。这些修饰可发生在沿着肽链的任何键，甚至同时发生在多处(2-3)。

封闭基团是本领域技术人员公知的，将这种基团偶合到本发明的肽所包含的合适残基的方法也是本领域技术人员公知的(参见如，Greene等人，(1991)Protective Groups in Organic Synthesis(有机合成中的保护性基团)，第2版，John Wiley & Sons，Inc.Somerset，N.J.)。

在某些实施方案，本发明的肽的末端氨基酸被保护基团或封闭基团封闭。多种封闭基团适合于此目的。这种基团包括但不限于，乙酰基、酰胺和烃基基团，其中乙酰基和烃基基团特别优选用于N-末端保护，酰胺基团优选用于羧基末端保护。在某些实施方案，乙酰基基团用于保护氨基末端，酰胺基团用于保护羧基末端。在某些实施方案，保护基团可包括脂肪酸中的烃基链、丙酰基(propeonyl)、甲酰基及其它。特别优选的羧基封闭基团包括形成酰胺、酯、和醚的封闭基团。其它封闭基团包括但不限于Fmoc、叔丁氧基羰基(t-BOC)、9-芴乙酰基基团、1-芴羧基、9-芴羧基、9-芴酮-1-羧基、苄氧羰基、呫吨基(Xan)、三苯甲基(Trt)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、4-甲氧基三苯甲基(Mmt)、4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基(Mtr)、三甲基苯-2-磺酰基(Mts)、4，4-二甲氧二苯甲基(Mbh)、甲苯磺酰基(Tos)、2，2，5，7，8-五甲基色满-6-磺酰基(Pmc)、4-甲苄基(MeBzl)、4-甲氧苄基(MeOBzl)、苄氧基(BzlO)、苄基(Bzl)、苯甲酰基(Bz)、3-硝基-2-吡啶亚磺酰基(Npys)、1-(4，4-二薄荷基-2，6-二氧亚环己基)乙基(1-(4，4-dimentyl-2，6-diaxocyclohexylid-ene)ethyl，Dde)、2，6-二氯苄基(2，6-DiCl-Bzl)、2-氯苄氧基羰基(2-Cl--Z)、2-溴苄氧基羰基(2--Br-Z)、苄氧基甲基(Bom)、环己氧基(cHxO)、叔丁氧基甲基(Bum)、叔丁氧基(tBuO)、叔丁基(tBu)、乙酰基(Ac)和三氟乙酰基(TFA)。

还包括为化学衍生物的是包含二十种标准氨基酸残基的一种或多种天然产生的氨基酸衍生物的那些肽。例如：4-羟基脯氨酸可能取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可能取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可能取代组氨酸；高丝氨酸可能取代丝氨酸；且鸟氨酸可能取代赖氨酸。肽还可能包含非天然的氨基酸。非天然的氨基酸的实例是正亮氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、二氨基丁酸、高丝氨酸、异丙基Lys、3-(2’-萘基(naphtyl))-Ala、烟碱基Lys、氨基异丁酸和3-(3’-吡啶基-Ala)。肽还可包含非蛋白侧链。除了上述以外，本发明的肽还可包括一种或多种非氨基酸单体(如，脂肪酸、复合糖和类似非氨基酸单体)。

本发明包括本发明肽的共轭物。术语“共轭物”是指定义本发明的肽与另一蛋白或多肽偶合或共轭。这种共轭物可能具有超过肽本身的益处。这种共轭物可通过蛋白合成制备，例如通过使用肽合成仪，或通过将编码期望氨基酸序列的适当核酸序列在正确的编码框中由本领域已知的方法彼此连接，并由本领域公知方法表达嵌合蛋白。

本发明的肽还可与其自身共轭或以产生包含该肽的大复合物的方式聚集。这种大复合物可能是有利的，因为其可能具有新的生物性质，诸如循环中更长的半衰期或更大活性。

药物组合物和施用途径

本发明提供在患有神经学损伤或易受神经学损伤的受治疗者中阻止这种神经学损伤或神经学损伤进展的方法，所述方法包括向受治疗者施用包含治疗有效量的本发明的肽与药学上可接受的载体的药物组合物。

本文所用的术语“药物组合物”是指本文所述的一种或多种肽与其它化学成分诸如药学上可接受的载体和赋形剂的制品。药物组合物的目的是便于向生物体施用活性成分。

术语“药学上可接受的”是指联邦或州政府管理机构批准或列在美国药典或其它一般公认药典用于动物、和更具体地用于人类。

本发明的药物组合物可配制为本发明的肽的药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”是指从药学上可接受的非毒性碱或酸包括无机或有机碱和无机或有机酸制备的盐。衍生自无机碱的盐包括铝、铵、钙、铜、铁、亚铁、锂、镁、锰盐、亚锰、钾、钠、锌盐和类似盐。特别优选的是铵、钙、镁、钾和钠盐。衍生自药学上可接受的有机非毒性碱的盐包括以下物质的盐：伯胺、仲胺和叔胺，取代的胺包括天然产生的取代的胺，环状胺，和碱性离子交换树脂，诸如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N，N’-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙基氨乙醇、2-二甲基氨乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基-吗啉、N-乙基哌啶、葡糖胺、氨基葡糖、组氨酸、海巴明、异丙胺、赖氨酸、甲葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因、嘌呤类、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、缓血酸胺和类似有机非毒性碱。

当本发明的肽是碱性时，可从药学上可接受的非毒性酸制备盐，所述酸包括无机酸和有机酸。这种酸包括乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、扑酸、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸、和类似酸。特别优选的是柠檬酸、氢溴酸、盐酸、马来酸、磷酸、硫酸和酒石酸。

术语“载体”是指对生物体造成不严重刺激和不消除施用的化合物的生物活性和性质的稀释剂或运载体(vehicle)。佐剂包括在这些术语中。这种药物载体可以是无菌液体，诸如水；和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油和类似油；聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂。当静脉内施用药物组合物时，水是优选载体。盐水溶液、右旋糖水溶液和甘油水溶液也可用作液体载体，尤其是用于注射用溶液。

本发明的药物组合物还可包括赋形剂。本文中术语“赋形剂”是指加入到药物组合物以进一步便于施用活性成分的惰性物质。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇和类似赋形剂。如果期望，该组合物还可含有少量润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。还预期抗菌剂诸如苯甲醇或对羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂诸如乙二胺四乙酸；和用于调节张力的剂诸如氯化钠或右旋糖。

本发明的药物组合物可由本领域公知的工艺制备，如，借助常规混合、溶解、制粒、制锭、磨细、乳化、包封、包埋或冻干工艺。

通常，含有肽作为活性成分的药物组合物制备为液态溶液或悬浮液的注射液，然而，还可制备可在注射前悬浮或增溶的固态形式。组合物还可采取乳剂、片剂、胶囊、凝胶、糖浆剂、浆剂、粉剂、乳霜、长效药剂(depots)、缓释制剂和类似制剂的形式。

引入包括本发明的肽的药物组合物的方法包括但不限于，静脉内、皮下、肌内、腹膜内、口服、局部、皮内、经皮、鼻内、硬膜外、眼、阴道和直肠途径。药物组合物可经任何方便的途径施用，例如通过输注或快速浓注，通过经由上皮内层(如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等等)吸收，并可与其它治疗活性剂一起施用。施用可以是局部的，或可以是系统的。此外，可能期望通过任何适合的途径引入本发明的药物组合物到中枢神经系统，包括心室内和鞘内注射；心室内注射可以通过例如连接于储器的心室内导管而促进。还可采用肺部施用，如，通过使用吸入器或喷雾器(neubilizer)。

根据本发明使用的药物组合物可使用包括赋形剂和辅助剂(auxiliaries)的一种或多种生理上可接受的载体以常规方式配制，该载体便于将活性成分加工为可药学使用的制剂。适当的制剂取决于所选的施用途径。

对于注射，药物组合物的活性成分可配制为水溶液，优选地在生理上相容的缓冲液诸如汉克氏溶液、林格氏溶液、或生理盐缓冲液中。对于跨粘膜或经皮施用，在制剂中使用适于待渗透的屏障的渗透剂。这种渗透剂通常是本领域公知的。

对于口服施用，通过将活性成分与本领域公知的药学上可接受的载体组合可容易地配制药物组合物。这种载体使得药物组合物能配制为用于患者口服摄取的片剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、浆剂、悬浮液和类似制剂。用于口服应用的药物制剂可使用固态赋形剂制备，任选地研磨所得的混合物，并在如所期望地加入合适的辅助剂后，加工颗粒混合物以获得片剂或锭核。合适的赋形剂是，特别是填充剂诸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制品诸如例如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙甲基-纤维素、和羧甲基纤维素钠；和/或生理上可接受的聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果期望，可加入崩解剂，诸如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或藻酸或其盐诸如藻酸钠。

锭核设有合适的包衣。为此目的，可使用浓的糖溶液，该溶液可任选地包括阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆胶(carbopol gel)、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液、以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或色素可以加到片剂或锭剂包衣以鉴别或表征活性化合物剂量的不同组合。

可口服使用的药物组合物包括明胶制成的推合式胶囊、以及明胶和增塑剂诸如甘油或山梨醇制成的软密封胶囊。推合式胶囊可含有与填充剂诸如乳糖、粘合剂诸如淀粉、润滑剂诸如滑石或硬脂酸镁以及任选地稳定剂混合的活性成分。软胶囊中，活性成分可溶解或悬浮在合适液体诸如脂肪油、液态石蜡或液态聚乙二醇中。此外，可加入稳定剂。用于口服施用的所有制剂应处于适于所选施用途径的剂量。

对于口腔施用，组合物可采用以常规方式配制的片剂或糖锭剂形式。

对于通过鼻吸入施用，使用合适的推进剂如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯-四氟乙烷、或二氧化碳，根据本发明使用的活性成分方便地以从加压包或喷雾器(neubilizer)呈现的气溶胶喷雾形式递送。在加压气溶胶的情况，剂量可通过提供阀以递送计量的量来确定。用在配药器中的胶囊或药筒例如明胶的胶囊或药筒可配制为含有化合物与合适的粉末基质诸如乳糖或淀粉的粉末混合物。

本文描述的药物组合物可配制为用于肠胃外施用，如，通过快速浓注或连续输注。用于注射的制剂可以单位剂型呈现，如，以安瓿或多剂量容器，任选地带有加入的防腐剂。组合物可为油性或水性运载体中的悬浮液、溶液或乳液，并可包含配制剂诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

用于肠胃外施用的药物组合物包括水溶形式的活性制剂的水溶液。另外，活性成分的悬浮液可制备为合适的基于油或基于水的注射悬浮液。合适的亲脂溶剂或运载体包括脂肪油诸如芝麻油，或合成的脂肪酸酯诸如油酸乙酯、甘油三酯，或脂质体。水性的注射悬浮液可能含有增加悬浮液粘性的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或增加活性成分溶解度的剂以允许制备高度浓缩溶液。

可选地，活性成分还可以在使用前与合适的运载体如无菌、无热原、基于水的溶液重构的粉末形式。

本发明的药物组合物还可配制为直肠组合物诸如栓剂或保留灌肠剂，使用例如常规粘合剂和载体诸如甘油三酯、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶。

可能期望局部地施用本发明的药物组合物到需要治疗的部位；这可通过以下实现，例如而不是限制的方式，手术期间局部输注、手术后局部应用如联合伤口敷料、通过注射、借助导管、借助栓剂、或借助植入物，所述植入物为多孔、无孔或胶粘材料。施用还可通过在损伤部位直接注射如，经由注射器。

对于定向的内部局部应用，药物组合物可以片剂或胶囊的形式，其可含有任何如下成分或类似性质的化合物：粘合剂诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂诸如淀粉或乳糖；崩解剂诸如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂诸如硬脂酸镁或Sterotes；或助流剂诸如胶态二氧化硅。当单位剂型是胶囊时，除了上述类材料以外，其可包含液态载体诸如脂肪油。此外，单位剂型可包含改变单位剂型的物理形式的其它材料，例如糖包衣、虫胶、或其它肠溶剂。

本发明的肽可以受控的释放系统递送。例如，肽可联合生物可降解的、生物相容的聚合植入物施用，该植入物在所选部位经受控的时间阶段释放肽。优选聚合材料的实例包括聚酐类、多正酯类、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙烯乙酸乙烯酯(polyethylene vinyl acetate)、其共聚物和混合物(参见Medical applications of controlled release(受控释放的医疗应用)，Langer和Wise(编辑)，1974，CRC Pres.，Boca Raton，Fla.)。受控的释放系统可靠近治疗靶放置，因此只需要系统剂量的一部分。

适于用在本发明环境的药物组合物包括其中包含有效实现预期目标量的肽的组合物。更具体地，“治疗有效量”是指在被治疗的受治疗者中有效防止、减轻或改善与神经学损伤有关的疾患或疾病的症状的肽的量。

肽的应用

本发明提供本发明的肽在有相应需要的受治疗者中用于治疗、预防和/或抑制神经学损伤，用于治疗缺氧性或缺血性中风，用于治疗脑损伤，和/或用于治疗神经学疾病的应用。

应理解的是，本文所用的术语“治疗”包括包含本发明的肽的药物组合物的治疗和/或预防应用两者。本发明中，药物组合物的预防应用包括向有相应需要的受治疗者施用药物组合物以阻止神经学损伤的发作；并阻止神经学损伤的进展。

本发明的肽具有神经保护活性。术语“神经保护活性”是指在受治疗者中阻止神经学损伤的发作或阻止或抑制神经学损伤的进展。

遍及说明书和权利要求书所用的术语“神经学损伤”(neurologicaldamage)包括但不限于脑梗塞、脑水肿、出血和神经变性。

本发明的治疗可适用于导致神经学损伤的多种急性和慢性疾患。

因此，本发明可用于治疗缺血性疾患，例如脑缺血(血栓栓塞性或缺氧性或缺血性中风、作为创伤结果的出血或脑损伤)，其包括各种形式的脑损害，并可能导致对脑神经元的急性或长期损害，和导致神经变性，例如在头部创伤后。

本发明可用于治疗相对长期的非缺血性起源的神经变性(如，癫痫、阿尔茨海默病、亨廷顿氏舞蹈病、唐氏综合征、多发性硬化和帕金森病)和慢性感染导致的神经学损伤，例如HIV产生的AIDS综合征。

可造成神经学损伤的其它疾患是普通神经病科医生或类似的内科医生公知的，并包括：原发性神经变性疾病；脊髓损害；缺氧性过程诸如围产期缺氧或缺血性过程诸如心脏停搏继发的缺血；神经外伤诸如心脏搭桥手术或移植继发的神经外伤；代谢引起的神经学损伤；脑性发作；继发性神经变性疾病(代谢性或毒性的)；记忆障碍；溢血性痴呆、多发性梗死性痴呆、路易体痴呆或神经变性性痴呆。

治疗的时间也是关键的，并可能是重要的。施用可在发生神经学损伤或怀疑有神经学损伤之前或之后。在神经学损伤发生之前施用对于预防性治疗可为有价值的，例如当认为受治疗者处于患上缺血性疾患的风险中时。这种疾患可能是，例如在心脏搭桥手术中，其中患者的绝大部分可能患有小的脑损伤，或在分娩中，其中胎儿可能易于具有胎循环的问题，这可能会导致缺氧和大脑性瘫痪和类似问题。更通常的施用时间是在已发生神经学损伤或怀疑有神经学损伤之后，例如在治疗中风或颅脑损伤的情况，在这种情形期望在事件之后尽可能快地进行施用以获得最佳结果，优选地在一小时或更短时间内，尽管晚于该时间的施用仍然可以是有益的。

根据一些实施方案，该受治疗者是哺乳动物。根据某个实施方案，该哺乳动物是人类。

治疗有效量的确定在本领域技术人员能力范围内，尤其是考虑到本文提供的详细公开。

在本发明治疗方法中对具体受治疗者、优选地哺乳动物、更优选地人类施用肽的准确量将取决于多种因素，例如施用的具体肽；其施用方式和/或预期用途；被治疗的具体临床疾患和/或其严重度；和/或将被治疗的患者的年龄、体重和/或过往临床病史，并通常在于施用治疗和/或指导治疗的人士例如开业医师诸如护士和/或内科医生的合理判断。然而，用于施用于哺乳动物的肽的合适的每日剂量通常从每kg哺乳动物体重约0.01mg/天到约80mg/kg/天，更通常地0.2-40mg/kg/天，以单剂量和/或以一天一次或多次的分开剂量提供。药物组合物可含有从约0.1％到约99％重量比的肽，并通常制备为单位剂型，肽的单位剂量通常从约0.1mg到约500mg。

剂量的量和施用间隔可以单独地调整以提供肽的足够的血浆水平或局部水平来引起神经保护作用。

取决于被治疗的疾患的严重度和响应性，给药可以是单次或多次施用，治疗过程持续数天到数周，或直到实现治愈或实现疾病状态的消减。

如下实施例仅意为在本质上是示意性的，应以非限制性方式解释。

实施例

本文以下的实施例描述了PAI-1衍生的18-mer肽乙酰基-RMAPEEIIMDRPFLFVVR-酰胺对治疗中风期间外源tPA引起的神经毒性和脑外伤后释放的内源tPA的作用。

材料

重组tPA购自Genentech，Inc.，South San Francisco，CA。肽206、218 O和218N由Peptisyntha SA，Bruxelles-Belgique合成。

方法

液压冲击脑损伤(FPI)方法。该方法如Armstead等人，Nat.Neurosci.9：1150-1155(2006)描述的进行。

MCA阻塞。所有研究根据NIH实验动物饲养管理和使用手册进行。以规律食物喂养Sprague-Dawley大鼠(平均重量250g)，并允许自由地获得饮用水。i.p.注射氯胺酮(75mg/ml，Apharmo)和甲苯噻嗪(5mg/ml，Bayer)来麻醉大鼠。借助加热灯将体温保持在37±0.5℃。病灶脑缺血通过用管腔内的细丝闭塞左MCA来引起(Ding-Zhou，L.等人2002Eur J Pharmacol.457，137-146)。简单地说，左总动脉和颈外动脉经由在中线的颈部切开而分离并用4-0丝缝合线(Ethicon)结扎。动脉切开术在总颈动脉中紧靠颈动脉杈的地方进行。将4-0尼龙单丝(Ethicon)经过此切口引入颈内动脉并前进到颈动脉杈的远端以闭塞MCA的来源；2小时后小心地将这段线取出。取出这段线后2小时，i.v.注射所示浓度的仅tPA、tPA连同PAI-1衍生的肽206(EEIIMD)或肽218N(Ac-RMAPEEIIMDRPFLFVVR-酰胺)或肽218O(Ac-RMAPEEIIMDRPFLYVVR-酰胺)。从麻醉恢复后，将大鼠送回笼子。二十四小时后，以过量的戊巴比妥对大鼠实施安乐死并测量梗塞大小。

栓塞性中风根据此前报道的小栓塞模型(Bdeir，K.等人2000Blood 96，1820-1826)并为中风修改(Atochin，D.N.等人2004.Stroke 35，2177-2182)来引起栓塞性中风。如所述地制备微栓子、切开并均质化(Bdeir K等人2000，同前)。用于引起中风的微栓子悬浮液含有1.4×10⁶个微粒，平均直径是3μm。

如此前所述地对大鼠进行实验(Ding-Zhou，L.等人2002，同前)，并有一些修改。简单地说，通过i.p.注射氯胺酮(75mg/mL)和甲苯噻嗪(5mg/mL)来麻醉Sprague-Dawley大鼠(平均重量250g)。暴露颈动脉并进行动脉切开术。内径0.02mm的聚乙烯导管用于将微栓子溶液(1.4×10⁶个颗粒)直接注射到暴露的颈内动脉。用0.25ml生理盐水冲洗导管并小心地撤回。用含有1mM hexacapron的盐水洗涤手术部位后，闭合切口。

引起栓塞性中风后，将大鼠分为4个治疗组(每组n＝7)：撤回导管后2小时，i.v.注射生理盐水中的tPA(6mg/kg)或tPA(6mg/kg)加肽206、肽218O或肽218N(1mg/kg)。对照组接受由仅生理盐水组成的运载体或盐水中的肽206或218(1mg/kg)。50％的剂量以快速浓注提供，其余的剂量经60min输注。从麻醉恢复后，将大鼠送回笼子。实验方案二十四小时后，以过量的戊巴比妥对大鼠进行安乐死并测量梗塞大小。

测量梗塞体积  取出脑并冠向切片为2-mm切片。将脑切片浸入盐水中的2％2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)，在37℃培养30分钟并放在4％福尔马林/PBS中过夜。梗塞区域保持未染色，显示白色，使得清楚地将其与染色的活组织区分开。对切片拍照，使用NIH计算机图像分析程序测量梗塞面积。梗塞体积定义为所有切片的未染色面积乘以其厚度的总和，并以立方毫米表示。数据表示为平均值±SE。由ANOVA随后是t-检验分析差异，使用post-hoc分析和Bonferroni检验校正显著性水平。统计显著性设置在P＜0.05。

脑含水量  通过测量脑组织的湿重和干重并通过使用算式BWC＝湿重-干重/湿重X 100来确定脑含水量(BWC)。通过用Student-Newman-Keulspost-hoc检验分析方差来分析数据。P＜0.05认为是显著的。

统计分析：当提到时，由ANOVA随后是t-检验分析差异。幼猪FPI研究中用Student-Newman-Keuls检验确定方差分析。使用post-hoc分析和Bonferroni检验校正显著性水平。统计显著性设置在P＜0.05，数值表示为平均值±SEM。

实施例1

tPA与PAI-1衍生的肽对液压冲击脑损伤(FPI)后脑含水量的作用

已经显示内源tPA在脑外伤模型中有害并增加创伤后脑水肿。为了检查PAI-1衍生的肽对内源tPA-引起的脑含水量增加的作用，在FPI(损伤水平1.9±0.1atm)之前30min，对幼猪提供肽206、肽218O、肽218N(1mg/kg，i.v.)或作为对照的运载体(0.9％盐水)。在其它组实验中，对幼猪提供仅tPA(2mg/kg，i.v.)、tPA加肽206、tPA加肽218O、或tPA加肽218N(1mg/kg，i.v.)，如图1所示。

通过测量脑组织的湿重和干重并通过使用算式BWC＝湿重-干重/湿重X 100来确定脑含水量(BWC)。通过用Fischer′s post-hoc检验分析方差来分析数据。P＜0.05认为是显著的。

通过测量脑含水量来评估创伤后脑水肿。运载体治疗的动物中损伤后正常含水量(78.87±0.75％)增加(到84.1±0.45％)(P＜0.05)。脑含水量的这种创伤后增加被肽206大大地抑制(81.379±0.3％；P＜0.05；图1)。图1还显示，标为218O的18-mer肽类似物与肽206同样有效，而标为218N的18-mer天然肽比肽206或肽218O显著更有效地抑制创伤后脑水肿，减少TBI后BWC到79.343±0.25(P＜0.05)。

而且，肽218N比肽206或肽218O显著更有效地抑制在tPA存在下由FPI引起的脑含水量加剧的增加。肽218N使脑含水量从87.12±0.6减少到79.643±0.51，而肽206仅减少到82.351±0.55(P＜0.05；图1)。

实施例2

tPA与PAI-1衍生的肽在大鼠中机械性梗阻和栓塞性中风后的作用

检查了PAI-1衍生的肽对大鼠中短暂的机械性梗阻MCA后用tPA治疗的梗塞大小的作用。确立再灌注后两小时tPA静脉内注射将梗塞大小从16±4.6增加到48.333±8.7mm³(图2)。共注射肽206、肽218O或肽218N显著地减少与tPA治疗有关的梗塞大小(图2)(P＜0.01)。而且，图2显示，肽218N比肽206或肽218O更有效地阻止tPA引起的梗塞大小扩大。在肽206存在下测量的梗塞大小是20.333±4.8，而在肽218N存在下其大小仅为13.3±3.6mm³(P＜0.05；图2)。

其中50％的tPA剂量由快速浓注提供，其余剂量经过60min输注的类似实验显示，肽218O比肽218N更有效地减少梗塞体积(图3)。

还检查了PAI-1衍生的肽对通过直接注射微血栓到MCA而引起的栓塞性中风后tPA治疗的大鼠的作用。栓塞形成后两小时，用仅tPA、tPA加肽206、tPA加肽218O、tPA加肽218N、生理盐水或仅肽206、218O、218N i.v.治疗大鼠。注射tPA减少梗塞体积的大约48％(图4)，这与其在机械性中风后的有害作用相反(图2和3)。然而，用tPA和PAI-1衍生的肽治疗的动物比仅用tPA治疗的动物有显著地(P＜0.01)更小的梗塞体积(图4)。而且，用tPA加肽218N治疗的动物比用tPA加肽206或tPA加肽218O治疗的动物有更小的梗塞体积(P＜0.05)(图4)。

还如图4中所示的，仅施用肽218N显著地减少中风后梗塞大小(P＜0.05)。这与肽206或218O不同，肽206或218O本身在tPA不存在下作用对梗塞大小几乎无作用。

实施例3

PAI-1衍生的肽对由tPA打开BBB的作用

在伊文思蓝评价之前，C57/B16小鼠静脉内接受盐水、含有10mg/kgtPA加或不加10μM肽206、肽218O或肽218N的盐水。伊文思蓝的脑含量通过在620nm的吸光度定量。

图5显示tPA显著地增加BBB通透性。向tPA加入肽218N阻止BBB这种完整度丧失的约90％，而肽206或218O无作用。不希望受限于特定机制或理论，肽218N阻止tPA对BBB有害作用的能力可能归因于该肽对tPA施加的构象变化。

实施例4

PAI-1衍生的肽对tPA相关的死亡率的作用

检查了PAI-1衍生的肽对大鼠中短暂的机械性梗阻MCA后用tPA治疗的死亡率的作用。确立再灌注后两小时tPA静脉内注射将死亡率从仅以盐水治疗的对照组中的7.7％增加到28.6％(p＝0.029)(图6)。

共注射tPA与肽218N显著地减少绝对死亡率，从28.6％降低到15.4％(图6A)。

而且我们的数据显示，肽218N减少tPA相关的死亡率(mortally)增加的63％(图6B)。

表1显示与肽218O比较，肽218N对死亡率和颅内出血的作用。

表1.PAI-1衍生的肽对大鼠中tPA-引起的死亡的作用。

  对照  tPA  tPA+218O  tPA+218N  死亡率  1/12  6/21  7/18  1/11  颅内出血  0  3  0  0

如表1所示，tPA引起21只大鼠中的6只死亡(～29％死亡率)。虽然肽218O使tPA-引起的死亡率增加到39％，肽218N显著地减少死亡率(9％死亡率)。此外，一些tPA-治疗的大鼠表现出颅内出血。然而，以tPA和肽治疗的大鼠都没有这种出血。

实施例5

PAI-1衍生的肽对脑梗塞的作用

PAI-1衍生的肽对梗塞大小的作用在经历MCA和再灌注并在四小时后用仅tPA或与PAI-1衍生的肽一起治疗的大鼠中确定。确立再灌注后四小时静脉内注射tPA将梗塞大小从68±7增加到77±9mm³(图7)。共注射肽218O显著地减少与tPA治疗有关的梗塞大小(图7)(P＜0.01)。肽218N的作用显著地比218O和206的作用强(P＜0.05；图7)。这些结果表示，两种肽，并且特别是218N改进tPA的治疗窗。

实施例6

PAI-1衍生的肽对tPA-引起的血管活性的作用

仅tPA或tPA与肽2180或218N一起对苯肾上腺素引起的大鼠主动脉环收缩的体外作用由Haj-Yehia等人，FASEB J.14：1411-1422(2000)描述的实验方案确定。

简要地说，通过放血法杀死雄性Sprague Dawley大鼠(250-275g)。小心地除去胸主动脉以避免损伤内皮，切去脂肪和结缔组织，并切成长5mm的横断面环。将这些组织保持在Krebs-Henseliet(KH)缓冲液的氧合(95％O₂、5％CO₂)溶液。固定环以记录在含有KH溶液的10ml浴中在连续通气下的等长张力。将环在37℃平衡1.5h并贯穿实验保持2g静息张力。随后通过以逐步增量(从0.1nM至10μM)加入苯肾上腺素(phenylepherine)(PE)使每个主动脉环收缩。在其它实验中，在加入PE之前15min加入不同浓度的仅tPA或tPA与218O或218N。用力位移探测换能器测量等长(isometric)张力，并使用计算机化系统在线记录。

对具体实施方案的上述描述如此完全地揭示了本发明的一般性质，以至于其它人通过应用现有知识，可容易对各种应用修改和/或改变这种具体实施方案而不需过度实验，且不偏离一般概念，因此这种改变和修改应当且意为包括在公开的实施方案的等同实施方案的含义和范围中。应理解的是，本文采用的措辞或术语是为了描述而不是限制的目的。用于实现各种公开的化学结构和功能的工具、材料和步骤可采用多种替代方式而不偏离本发明。

序列表

<110>斯罗姆博泰克有限公司

 

<120>衍生自纤溶酶原激活物抑制剂-1的肽和其应用

<130>TRMB/008PCT

 

<150>US 60/951,485

<151>2007-07-24

 

<160>12

 

<170>PatentIn 3.3版本

 

<210>1

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>乙酰基-Arg

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(18)..(18)

<223>Arg-酰胺

 

<400>1

 

Xaa Met Ala Pro Glu Glu Ile Ile Met Asp Arg Pro Phe Leu Phe Val

1               5                   10                  15

Val Xaa

<210>2

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>乙酰基-Arg

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(18)..(18)

<223>Arg-酰胺

 

<400>2

 

Xaa Met Ala Pro Glu Glu Ile Ile Met Asp Arg Pro Phe Leu Tyr Val

1               5                   10                  15

Val Xaa

 

<210>3

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>Arg，乙酰基-Arg，烃基-Arg，或氨基封闭的Arg

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(18)..(18)

<223>Arg，Arg-酰胺，Arg-醇，Arg-酯，或羧基封闭的Arg

<400>3

 

Xaa Met Ala Pro Glu Glu Ile Ile Met Asp Arg Pro Phe Leu Phe Val

1               5                   10                  15

Val Xaa

 

<210>4

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>4

 

Arg Met Ala Pro Glu Glu Ile Ile Met Asp Arg Pro Phe Leu Phe Val

1               5                   10                  15

Val Arg

 

<210>5

<211>18

<212>PRT

<213>人工肽

 

<220>

<223>合成肽

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>乙酰基-Arg

 

<400>5

Xaa Met Ala Pro Glu Glu Ile Ile Met Asp Arg Pro Phe Leu Phe Val

1               5                   10                  15

Val Arg

 

<210>6

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(18)..(18)

<223>Arg-酰胺

 

<400>6

 

Arg Met Ala Pro Glu Glu Ile Ile Met Asp Arg Pro Phe Leu Phe Val

1               5                   10                  15

Val Xaa

 

<210>7

<211>18

<212>PRT    

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>Arg，乙酰基-Arg，烃基-Arg，氨基封闭的Arg

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(15)..(15)

<223>Phe或Tyr

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(18)..(18)

<223>Arg，Arg-酰胺，Arg-醇，Arg-酯，羧基封闭的Arg

 

<400>7

 

Xaa Met Ala Pro Glu Glu Ile Ile Met Asp Arg Pro Phe Leu Xaa Val

1               5                   10                  15

Val Xaa

 

<210>8

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>8

 

Arg Met Ala Pro Glu Glu Ile Ile Met Asp Arg Pro Phe Leu Tyr Val

1               5                   10                  15

Val Arg

 

<210>9

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

<220>

 

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>乙酰基-Arg

 

<400>9

 

Xaa Met Ala Pro Glu Glu Ile Ile Met Asp Arg Pro Phe Leu Tyr Val

1               5                   10                  15

Val Arg

 

<210>10

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(18)..(18)

<223>Arg-酰胺

 

<400>10

 

Arg Met Ala Pro Glu Glu Ile Ile Met Asp Arg Pro Phe Leu Tyr Val

1               5                   10                  15

Val Xaa

<210>11

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成肽

 

<400>11

 

Glu Glu Ile Ile Met Asp

1               5

 

<210>12

<211>402

<212>PRT

<213>人类

 

<400>12

 

Met Gln Met Ser Pro Ala Leu Thr Cys Leu Val Leu Gly Leu Ala Leu

1               5                   10                  15

Val Phe Gly Glu Gly Ser Ala Val His His Pro Pro Ser Tyr Val Ala

            20                  25                  30

His Leu Ala Ser Asp Phe Gly Val Arg Val Phe Gln Gln Val Ala Gln

        35                  40                  45

Ala Ser Lys Asp Arg Asn Leu Val Phe Ser Pro Tyr Gly Val Ala Ser

    50                  55                  60

Val Leu Ala Met Leu Gln Leu Thr Thr Gly Gly Glu Thr Gln Gln Gln

65                  70                  75                  80

Ile Gln Ala Ala Met Gly Phe Lys Ile Asp Asp Lys Gly Met Ala Pro

                85                  90                  95

Ala Leu Arg His Leu Tyr Lys Glu Leu Met Gly Pro Trp Asn Lys Asp

            100                 105                 110

Glu Ile Ser Thr Thr Asp Ala Ile Phe Val Gln Arg Asp Leu Lys Leu

        115                 120                 125

Val Gln Gly Phe Met Pro His Phe Phe Arg Leu Phe Arg Ser Thr Val

    130                 135                 140

Lys Gln Val Asp Phe Ser Glu Val Glu Arg Ala Arg Phe Ile Ile Asn

145                 150                 155                 160

Asp Trp Val Lys Thr His Thr Lys Gly Met Ile Ser Asn Leu Leu Gly

                165                 170                 175

Lys Gly Ala Val Asp Gln Leu Thr Arg Leu Val Leu Val Asn Ala Leu

            180                 185                 190

Tyr Phe Asn Gly Gln Trp Lys Thr Pro Phe Pro Asp Ser Ser Thr His

        195                 200                 205

Arg Arg Leu Phe His Lys Ser Asp Gly Ser Thr Val Ser Val Pro Met

    210                 215                 220

Met Ala Gln Thr Asn Lys Phe Asn Tyr Thr Glu Phe Thr Thr Pro Asp

225                 230                 235                 240

Gly His Tyr Tyr Asp Ile Leu Glu Leu Pro Tyr His Gly Asp Thr Leu

                245                 250                 255

Ser Met Phe Ile Ala Ala Pro Tyr Glu Lys Glu Val Pro Leu Ser Ala

            260                 265                 270

Leu Thr Asn Ile Leu Ser Ala Gln Leu Ile Ser His Trp Lys Gly Asn

        275                 280                 285

Met Thr Arg Leu Pro Arg Leu Leu Val Leu Pro Lys Phe Ser Leu Glu

    290                 295                 300

Thr Glu Val Asp Leu Arg Lys Pro Leu Glu Asn Leu Gly Met Thr Asp

305                 310                 315                 320

Met Phe Arg Gln Phe Gln Ala Asp Phe Thr Ser Leu Ser Asp Gln Glu

                325                 330                 335

Pro Leu His Val Ala Gln Ala Leu Gln Lys Val Lys Ile Glu Val Asn

            340                 345                 350

Glu Ser Gly Thr Val Ala Ser Ser Ser Thr Ala Val Ile Val Ser Ala

        355                 360                 365

Arg Met Ala Pro Glu Glu IleIle Met Asp Arg Pro Phe Leu Phe Val

    370                 375                 380

Val Arg His Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Phe Met Gly Gln Val Met

385                 390                 395                 400

Glu Pro