一种检测枣酊中酸枣仁皂苷和当药黄酮素含量的方法

摘要

本发明公开了一种检测枣酊中酸枣仁皂苷和当药黄酮素含量的方法，其特征在于：以乙腈与0.1%甲酸水溶液的混合液为流动相，采用高效液相色谱法进行检测，其中高效液相色谱所采用的检测器为蒸发光散射检测器（ELSD）。本发明的检测枣酊中酸枣仁皂苷和当药黄酮素含量的方法，乙腈和甲酸水溶液可以同时作为流动相和样品的萃取剂，使样品的前处理较为简单，而且高效液相色谱的检测器采用蒸发光散射检测器（ELSD），被测目标物在该检测器上的信号较强，有较好的匹配性，而且形成了较好的函数对应关系，提高了检测的准确度。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测枣酊中酸枣仁皂苷和当药黄酮素含量的方法，属于痕量分析技术领域。

背景技术

红枣是一种营养丰富的果实，其中含有多种营养物质，比如皂苷类，黄酮类，生物碱类，糖类，氨基酸类。枣仁中可以分离得到酸枣仁皂苷A和B；红枣的种子中还能提取出黄酮C-葡萄糖甙（即当药黄酮素或当药黄素），当药黄酮素和酸枣仁皂苷都是具有提高免疫等保健功效的活性物质。枣酊是常见的烟用香精香料，在烟草制品的加香、矫味中经常使用。当前随着烟用香精香料品质控制日益收到关注，香原料的主要成分及特有成分，尤其是具有这些具有免疫保健功效的成分的分析检测也成为热点。

目前针对酸枣仁皂苷A和B常用的是高效液相色谱结合二极管阵列检测器（DAD检测器）的检测方法，但是经过对比酸枣仁皂苷A和B在DAD检测器上的相应强度并不理想，从而影响检测精准度。而且同时检测酸枣仁皂苷及当药黄酮素的方法未见报导。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测准确度且能够同时检测枣酊中酸枣仁皂苷和当药黄酮素含量的方法。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种检测枣酊中酸枣仁皂苷和当药黄酮素含量的方法，其是以乙腈与0.1%甲酸水溶液的混合液为流动相，采用高效液相色谱法进行检测，其中高效液相色谱所采用的检测器为蒸发光散射检测器（ELSD）。

所述流动相中乙腈与0.1%甲酸水溶液的体积比为60：40~75：25。

本发明的检测方法具体步骤如下：

1）标准工作曲线制定：在0.014-0.19mg/ml范围内用流动相配制含有当药黄酮素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的三种标准品的至少三个浓度的混合标准溶液，再利用高效液相色谱仪分别对上述所有浓度的混合标准溶液中的三种标准品的含量进行检测，并根据三种标准品的峰面积和相应的浓度分别绘制三种标准品的标准工作曲线并计算得到其回归方程；

2）样品的预处理：称取枣酊样品于加入流动相，经过超声萃取后离心处理，取上层清液，过滤得到样品溶液；再利用高效液相色谱仪采用与步骤1）相同的条件分别对样品溶液进行检测，并根据得到的峰面积分别带入标准工作曲线的回归方程中，计算出样品中的当药黄酮素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的含量；

步骤1）、2）中的高效液相色谱条件为：色谱柱：C18（4.6×150mm）；流速：0.8ml/min；

蒸发光散射检测器条件：漂移管温度79~81.5℃；气流量：2.0~2.2L/min。

所述混合标准溶液中当药黄酮素的浓度范围为0.038-0.19mg/ml，酸枣仁皂苷A的浓度范围为0.01-0.1mg/ml，酸枣仁皂苷B的浓度范围为0.014-0.14mg/ml。

本发明的检测枣酊中酸枣仁皂苷和当药黄酮素含量的方法，乙腈和甲酸水溶液可以同时作为流动相和样品的萃取剂，使样品的前处理较为简单，而且高效液相色谱的检测器采用蒸发光散射检测器（ELSD），被测目标物在该检测器上的信号较强，有较好的匹配性，而且形成了较好的函数对应关系，提高了检测的准确度。另外，本发明通过优化流动相中有机相比例，及ELSD漂移管的温度和载气流量，提高了被测目标物在色谱柱上的分离度，减少了色谱基线噪音，获得了将为明显的色谱峰，提高了检测准确度。

附图说明

图1为混合标准溶液的色谱图；

图2为当药黄酮素的标准工作曲线图；

图3为酸枣仁皂苷A的标准工作曲线图；

图4为酸枣仁皂苷B的标准工作曲线图；

图5为当药黄酮素的标准双对数曲线图；

图6为酸枣仁皂苷A的标准双对数曲线图；

图7为酸枣仁皂苷B的标准双对数曲线图；

图8为对比实验示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的方法做详细的介绍：

本发明的检测枣酊中酸枣仁皂苷和当药黄酮素含量的方法具体包括如下步骤：

高效液相色谱条件：

色谱柱：YMC-ODS-AC18（4.6×150mm，5μm）；

流动相：乙腈-0.1％甲酸水溶液＝60∶40；

流速：0.8ml/min；

进样量：5μl；

蒸发光散射检测器条件：

漂移管温度81.5℃；

气流量：2.2L/min。

1）标准工作曲线的制定：

分别准确称取当药黄酮素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B标准品4.8mg、2.5mg、3.5mg于同一25ml容量瓶中，用流动相溶解稀释并定容至刻度线，得到三种标准品的标准溶液储备液，采用该储备液用流动相稀释配制系列浓度的混合标准溶液，使得当药黄酮素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的浓度范围分别是0.038－0.19mg/ml，0.01－0.1mg/ml，0.014－0.14mg/ml，对此系列浓度的标准混合溶液进行高效液相色谱检测，具体混合标准溶液的配制及相应检测的峰面积如表1和图1所示：图1中峰1和峰2为当药黄酮素的色谱峰，峰3和峰4分别为酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的色谱峰，图1中的色谱峰明显且锐利，基线平稳且无噪音，说明本发明采用的ELSD检测器在优化条件后产生了较好的分析效果。

表1  标准混合溶液的浓度及相应检测结果

。

根据表1中的浓度及相应峰面积数据作图，其中当药黄酮素同时出峰1和峰2，工作曲线根据两个峰面积之和进行计算。具体的计算结果如图2-4及表2所示。

表2  标准工作曲线参数

。

当药黄酮素、酸枣仁皂苷A和B在各自浓度范围内，浓度/峰面积呈现幂指数函数关系，如图2、3、4所示。对酸枣仁皂苷A和B标准品各浓度和峰面积分别取自然对数，然后作图，如图5、6、7所示，酸枣仁皂苷A和B在ELSD检测器上的信号与标准品浓度之间符合双对数线性关系，被测目标物与ELSD检测器具有较好的匹配性。

2）样品的检测：

取枣酊样品0.1克左右置于具塞三角瓶中，移取40ml流动相至三角瓶中，置于超声辅助萃取器中超声萃取30分钟以上，取溶液10ml至离心管中于4000rpm离心10分钟，取上层清液，经0.45μm针式滤头过滤，得到样品溶液。

将样品溶液采用步骤1）相同条件的高效液相色谱仪进行检测，将得到的当药黄酮素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的色谱峰分别带入相应的回归方程中，得到样品溶液中当药黄酮素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的浓度，从而计算出样品中当药黄酮素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的含量。

本发明的检测效果：

1、检测限及定量限

取各标准品工作曲线最低浓度重复检测，计算标准偏差和相对标准偏差。分别以3倍和10倍标准偏差作为检测限和定量限。具体数据如表3所示。

表3 检测限及定量限

。

2、精密度及加标回收率：

取已知浓度枣酊样品，按照不同水平分别添加三种标准品，测定方法加标回收率。加标水平和实际检测的结果如表4所示。

表4加标水平和加标回收率

。

3、对比实验

本发明以酸枣仁皂苷A为例，以相同的条件分别采用ELSD检测器和DAD检测器进行对比实验，其结果如图8所示，ELSD所获得的色谱图中4分钟左右有峰型良好的色谱峰出现，而相同保留时间在DAD检测器获得的色谱图中却没有发现有效的色谱峰。可见，对于被测目标物酸枣仁皂苷A，ELSD是比DAD更适用的检测器，而且DAD必须要求被测目标物在紫外可见光波段有吸收才适用，使用条件较为苛刻。

4、对实际样品的检测

采用具体实施方式所描述的方法，对某公司枣酊样品进行了检测，检测出当药黄酮素、酸枣仁皂苷A和B的含量如表5所示。

 表5 实际样品的检测结果