测定银杏叶或其相关制剂中槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷含量的方法

摘要

本发明公开了一种用于测定银杏叶或其相关制剂中槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷含量的方法。该方法是在无阴性干扰的情况下，以槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷为对照品，利用高效液相色谱对作为供试品的所述银杏叶或其相关制剂中的槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷进行测定，由外标法计算得到所述银杏叶或其相关制剂中槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的含量。该方法在制备供试品溶液时，不需要水解，克服了现有测定方法中测定结果不准确、水解过程费时费力等缺点，能够准确测定银杏叶或其制剂中槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的真实含量，有利于有效控制相关产品的质量。

说明书

技术领域

本发明属于药品质量控制领域，涉及一种测定银杏叶或其相关制剂中槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷含量的方法。

背景技术

银杏叶又名白果叶，来源于银杏科植物银杏(Ginkgo biloba L.)的干燥叶，在我国有悠久的药用历史，主要用于治疗肺虚咳喘和心悸怔忡等症。

现代药理学研究表明，银杏叶具有清除氧自由基、降血脂、增强中枢神经系统功能、调节神经递质和激素水平、改善血液流变状态、抗炎、抗过敏等作用。因而用银杏叶研制开发的制剂品种越来越多，临床应用越来越广泛。目前在临床上应用的有斯泰隆、金纳多、天保宁、银可络、舒血宁、络欣通，冠心酮等多种品牌的片剂、颗粒剂、注射剂。主要用于治疗各种心脑血管疾病、糖尿病、神经系统疾病、呼吸系统疾病等。

银杏叶及其制剂中主要有效成分为黄酮类和内酯类两类成分，到目前为止，国内外关于银杏叶及其制剂的质量控制方法普遍是测定这两类成分的含量。关于银杏叶及其制剂中黄酮类含量测定的方法，虽然已经有高效液相色谱法和薄层扫描法，但其测定原理都是在水解的基础上，以槲皮素、山柰素和异鼠李素三种黄酮苷元为对照，经过折算而进行测定的，这两种方法的主要缺点是：(1)需要水解。在水解过程中，由于操作等多方面的原因，可能发生水解不够或水解过度等现象，导致测定结果不准确；而且水解过程费时费力，严重影响工作效率。(2)测定的是黄酮苷元的含量。由于测定的是水解后的黄酮苷元的含量，不能准确反映银杏叶及其制剂中黄酮苷类成分的真实含量，不能达到真正控制银杏叶及其制剂质量均一性的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种测定银杏叶及相关制剂中槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷含量的方法。

本发明提供的测定银杏叶及相关制剂中槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷含量的方法，包括如下步骤：

在无阴性干扰的情况下，以槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷为对照品，利用高效液相色谱对作为供试品的所述银杏叶或其相关制剂中的槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷进行测定，由外标法计算得到所述银杏叶或其相关制剂中槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的含量。

该方法中，在所述测定步骤之前，先将所述对照品和所述供试品溶于溶剂中；溶解所述对照品的溶剂选自甲醇、甲醇的水溶液、乙醇、乙醇的水溶液和流动相中的任意一种；溶解所述供试品的溶剂选自甲醇、甲醇的水溶液、乙醇、乙醇的水溶液和流动相中的任意一种。

所述测定步骤中，检测波长为190nm～400nm，优选360nm。流动相为下述溶剂a～溶剂c中的任意一种：所述溶剂a为甲醇的水溶液，所述溶剂b为乙腈的水溶液，所述溶剂c为甲醇、乙腈和水组成的混合液。所述流动相还可为溶剂a-溶剂c中的任意一种与修饰剂、缓冲溶液、离子抑制剂和pH值调节剂中的至少一种组成的混合液；其中，所述溶剂a为甲醇的水溶液，所述溶剂b为乙腈的水溶液，所述溶剂c为甲醇、乙腈和水组成的混合液；所述修饰剂选自四氢呋喃、异丙醇和二氧六环中的任意一种；所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液和柠檬酸盐缓冲溶液中的任意一种；所述离子抑制剂选自十二烷基磺酸钠、十一烷基磺酸钠、己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠和壬烷磺酸钠中的任意一种；所述pH值调节剂选自甲酸、乙酸、磷酸和柠檬酸中的任意一种。所述修饰剂的加入量为所述溶剂a或溶剂b或溶剂c体积的0.5％～10.0％，优选3.0％～5.0％；所述缓冲溶液的加入量为所述溶剂a或溶剂b或溶剂c体积的0.5％～10.0％，优选3.0％～5.0％；所述离子抑制剂的加入量为所述溶剂a或溶剂b或溶剂c体积的0.1％～3.0％，优选0.5％～1.0％；所述pH值调节剂的加入量为所述溶剂a或溶剂b或溶剂c体积的0.05％～5.0％，优选0.2％～1.0％。所述相关制剂为银杏叶药材、银杏叶提取物、含有银杏叶的固体制剂或含有银杏叶的液体制剂，其中，所述固体制剂为丸剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、滴丸剂、散剂或茶剂，所述液体制剂为注射剂、口服液、酊剂或煎膏剂。

本发明提供的测定银杏叶或其相关制剂中槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷含量的方法，可为下述方法a-方法c中的任一方法：

所述方法a为：

1)制备对照品的溶液：称取槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.07mg的溶液，得到所述对照品的溶液；

2)制备供试品溶液：

(1)制备银杏叶的溶液：取银杏叶，粉碎，称取2g，加入质量百分浓度为75％的乙醇水溶液100ml，称定重量，置于水浴中加热回流提取40分钟，取出，放冷，再称定重量，用质量百分浓度为75％的乙醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，量取续滤液25ml，蒸干，残渣加水2ml使其溶解，置于已处理好的聚酰胺柱中，用水50ml洗脱，弃去水液，再用质量百分浓度为75％的乙醇水溶液100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使其溶解，定量转移至5ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，得到所述银杏叶的溶液；其中，所述聚酰胺柱按照下述方法进行处理：取聚酰胺颗粒用60目筛筛除细粉，加2～3倍重量的水浸泡使其润湿，装入色谱柱中，用2～5倍柱体积的质量百分浓度为2％～5％的盐酸水溶液洗脱，再用去离子水洗脱至中性，接着用2～5倍柱体积的质量百分浓度为2％～5％的盐酸水溶液洗脱，再用去离子水洗脱至中性；

(2)制备银杏叶提取物的溶液：称取购自浙江康恩贝植物提取物有限公司生产的产品批号为070301的银杏叶提取物0.035g，加入甲醇10ml，超声处理10分钟，用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，得到所述银杏叶提取物的溶液；

(3)制备舒血宁注射液的溶液：用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过舒血宁注射液，取续滤液，得到所述舒血宁注射液的溶液；

3)测定所述供试品溶液中槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的含量：

选用型号为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18、规格为50mm×4.6mm、填充剂粒径为1.8μm的高效液相色谱柱，所述色谱柱中的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，以乙腈和质量百分浓度为0.4％的磷酸水溶液组成的混合液为流动相，分别精密吸取所述对照品溶液与所述供试品溶液各2μl，分别注入所述高效液相色谱仪中，按照表1所示进行梯度洗脱，每次所述梯度洗脱的平衡时间为10分钟，所述流动相的流速为每分钟0.6ml，所述检测波长为360nm，所述色谱柱的柱温为40℃，理论板数按槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷峰计算不低于8000，所述表1中，A代表乙腈，B代表质量百分浓度为0.4％的磷酸水溶液，％代表体积百分比；

表1、梯度洗脱条件

根据所得所述供试品和对照品的高效液相色谱图计算得到所述槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的峰面积及所述对照品的峰面积，按照下式所示的外标法进行计算：

得到所述供试品溶液中槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的浓度；

所述方法b为：

1)制备对照品的溶液：称取槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.07mg的溶液，得到所述对照品的溶液；

2)制备供试品溶液：

(1)制备银杏叶的溶液：取银杏叶，粉碎，称取2g，加入质量百分浓度为75％的乙醇水溶液100ml，称定重量，置于水浴中加热回流提取40分钟，取出，放冷，再称定重量，用质量百分浓度为75％的乙醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，量取续滤液25ml，蒸干，残渣加水2ml使溶解，置于已处理好的聚酰胺柱中，用水50ml洗脱，弃去水液，再用质量百分浓度为75％的乙醇水溶液100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使其溶解，定量转移至5ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，得到所述银杏叶的溶液；其中，所述聚酰胺柱按照下述方法进行处理：取聚酰胺颗粒用60目筛筛除细粉，加2～3倍重量的水浸泡使其润湿，装入色谱柱中，用2～5倍柱体积的质量百分浓度为2％～5％的盐酸水溶液洗脱，再用去离子水洗脱至中性，接着用2～5倍柱体积的质量百分浓度为2％～5％的盐酸水溶液洗脱，再用去离子水洗脱至中性；

(2)制备银杏叶提取物的溶液：称取购自浙江康恩贝植物提取物有限公司生产的产品批号为070301的银杏叶提取物0.035g，加入甲醇10ml，超声处理10分钟，用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，得到所述银杏叶提取物的溶液；

(3)制备舒血宁注射液的溶液：用孔径为0.45μm微孔滤膜滤过舒血宁注射液，取续滤液，得到所述舒血宁注射液的溶液；

3)测定所述供试品溶液中槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的含量：

选用型号为HP 1100型InertsilODS-3 C18、规格为250mm×4.6mm、填充剂粒径为5μm的高效液相色谱柱，所述色谱柱中的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，以流动相A和流动相B组成的混合液为流动相，分别吸取所述对照品溶液与所述供试品溶液各10μl，分别注入所述高效液相色谱仪中，按照表2所示进行梯度洗脱，每次洗脱的平衡时间为10分钟，流动相的流速为每分钟1.0ml，所述检测的波长为360nm，所述色谱柱的柱温为30℃，理论板数按槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷峰计算不低于8000；所述流动相A为由水、乙腈、异丙醇和柠檬酸以体积比1000∶470∶50∶6.08混合而得的混合液，所述流动相B为水、乙腈、异丙醇和柠檬酸以体积比1400∶200∶30∶6.88混合而得的混合液；所述表2中，A代表所述流动相A，B代表所述流动相B，％代表体积百分比；

表2、梯度洗脱条件

根据所得所述供试品和对照品的高效液相色谱图计算得到所述槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的峰面积及所述对照品的峰面积，按照下式所示的外标法进行计算：

得到所述供试品溶液中槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的浓度；

所述方法c为：

1)制备对照品的溶液：称取槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.07mg的溶液，得到所述对照品的溶液；

2)制备供试品溶液：

(1)制备银杏叶提取物的溶液：称取购自浙江康恩贝植物提取物有限公司生产的产品批号为070301的银杏叶提取物0.035g，加入甲醇10ml，超声处理10分钟，用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，得到所述银杏叶提取物的溶液；

(2)制备舒血宁注射液的溶液：用孔径为0.45μm微孔滤膜滤过舒血宁注射液，取续滤液，得到所述舒血宁注射液的溶液；

3)测定所述供试品溶液中槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的含量：

选用型号为Inertsil ODS-3C18、规格为250mm×4.6mm、填充剂粒径为5μm的高效液相色谱柱，所述色谱柱中的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，以乙腈和质量百分浓度为0.4％的磷酸水溶液组成的混合液为流动相，分别吸取所述对照品溶液与所述供试品溶液各10μl，分别注入所述高效液相色谱仪中，按照表3所示进行梯度洗脱，每次洗脱的平衡时间为10分钟，流动相的流速为每分钟1.0ml，所述检测的波长为360nm，所述色谱柱的柱温为30℃，理论板数按槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷峰计算不低于8000；所述表3中，A代表乙腈，B代表质量百分浓度为0.4％的磷酸水溶液，％代表体积百分比；

表3、梯度洗脱条件

根据所得所述供试品和对照品的高效液相色谱图计算得到所述槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的峰面积及所述对照品的峰面积，按照下式所示的外标法进行计算：

得到所述供试品溶液中槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的浓度。

上述测定方法中，所述无阴性干扰的情况是指处方中含银杏叶的复方制剂中，取去除银杏叶以后的其他所有药味，按照原加工工艺和供试品溶液的制备方法制得的阴性样品溶液，按照同样的色谱条件，进样后，在色谱图中无与对照品色谱峰保留时间一致的色谱峰。所述外标法是指在规定的色谱条件下，分别取对照品溶液和供试品溶液进样，根据对照品色谱峰的保留时间确定供试品色谱图中被测成分的色谱峰，再以该色谱峰的面积或峰高与对照品色谱峰的面积或峰高及其浓度进行比较，计算得到供试品中被测成分的浓度，即为得到供试品中被测成分的含量。

本发明提供的测定银杏叶制剂中槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷含量的方法，在制备供试品溶液时，不需要水解，克服了现有测定方法中测定结果不准确、水解过程费时费力等缺点，能够准确测定银杏叶及其制剂中黄酮苷类成分的真实含量，有利于有效控制相关产品的质量。

附图说明

图1为实施例1中对照品的HPLC图谱。

图2为实施例1中作为供试品的银杏叶药材的HPLC图谱。

图3为实施例1中作为供试品的银杏叶提取物的HPLC图谱。

图4为实施例1中作为供试品的舒血宁注射液的HPLC图谱。

图5为实施例2中对照品的HPLC图谱。

图6为实施例2中作为供试品的银杏叶药材的HPLC图谱。

图7为实施例2中作为供试品的银杏叶提取物的HPLC图谱。

图8为实施例2中作为供试品的舒血宁注射液的HPLC图谱。

图9为实施例3中对照品的HPLC图谱。

图10为实施例3中作为供试品的银杏叶提取物的HPLC图谱。

图11为实施例3中作为供试品的舒血宁注射液的HPLC图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。本发明中所述浓度如无特别说明，均为质量百分浓度，所述溶液如无特别说明，均为水溶液。

槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的结构确认数据：

英文名：quercetin 3-O-2″-(6″′-p-coumaroyl)glucosylrhamnoside

结构式：

取干燥银杏叶10kg，用乙醇40升回流提取2次，提取液合并，减压浓缩，与柱层析硅胶(100目～200目)20kg拌样后，置索氏提取器中，依次用石油醚、乙酸乙酯和甲醇各4升回流提取，乙酸乙酯提取物经硅胶(200目～300目)柱色谱分离，三氯甲烷-甲醇(95∶5～50∶50)梯度洗脱，收集相应馏分，经硅胶柱反复色谱分离、纯化，即得。该化合物的核磁检测结果如下：

¹HNMR(200MHz，DMSO-d₆)：δ0.91(3H，d，J＝6Hz Me rhamnose)，3.03-4.15(m，sugars protons)，4.28(1H，d，J＝8Hz，H-1glc)，5.52(1H，d，J＝2Hz，H-1rha)，6.16(1H，d，J＝2Hz，H-6)，6.24(1H，d，J＝16Hz，H-8coum)，6.31(1H，d，J＝2Hz，H-8)，6.70(2H，d，J＝8.6Hz，H-3coum and H-5coum)，6.88(1H，d，J＝8.4Hz，H-5′)，7.25(1H，dd，J＝2Hz and8.4Hz，H-6′)，7.36(1H，d，J＝2Hz，H-2′)，7.41(2H，d，J＝8.6Hz，H-2coum and H-6coum)，7.45(1H，d，J＝16Hz，H-7coum)；CIMS 70eV m/z(rel.int.)757[M+H]⁺(0.3)，611(1)，595(0.5)，472(6.6)，449(66.7)，303(100)。

¹³CNMR(50MHz，DMSO-d₆)：δ18.3(C-6rha)，63.8(C-6glc)，70.5(C-2rha，C-5rha)，71.1(C-4glc)，72.7(C-3rha)，74.7(C-2glc，C-5glc)，76.9(C-3glc)，82.6(C-4rha)，94.5(C-8)，99.6(C-1rha)，101.6(C-1glc)，104.9(C-10)，107.1(C-6)，114.8(C-8coum，C-2′)，116.5(C-5′，C-3coum and C-5coum)，121.5(C-1′)，121.8(C-6′)，125.9(C-1coum)，130.9(C-2coum，C-6coum)，135.3(C-3)，145.5(C-3′)，146.1(C-4′)，149.5(C-7coum)，157.3(C-9)，157.5(C-2)，160.6(C-4coum)，162.2(C-5)，165.0(C-7)，167.3(C-9coum)，178.6(C-4)。

由上可知，该化合物结构正确。

实施例1、

色谱条件与系统适用性试验：色谱柱的型号为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18，规格为50mm×4.6mm，1.8μm，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，以乙腈和浓度为0.4％的磷酸水溶液的混合液为流动相，按照表1所示进行梯度洗脱，每次洗脱的平衡时间为10分钟，流动相的流速为每分钟0.6ml；检测波长为360nm，柱温为40℃，理论板数按槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷峰峰计算应不低于8000。表1中，A代表乙腈，B代表浓度为0.4％的磷酸水溶液，所列A和B的百分比(％)均为体积百分比。对于表1中所列时间段内，流动相的体积百分比由小到大或由大到小进行变化的洗脱区间，可直接设定该洗脱区间内体积百分比的两端值，色谱仪中的既定程序会进行自动调整。

表1、梯度洗脱条件

对照品溶液的制备：精密称取槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.07mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：

(1)银杏叶：取银杏叶本品，粉碎，精密称取2g，精密加入75％乙醇100ml，称定重量，置水浴中加热回流提取40分钟，取出，放冷，再称定重量，用75％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣加水2ml使溶解，置于已处理好的聚酰胺柱(30～60目，3g，内径1cm)，用水50ml洗脱，弃去水液，再用75％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，定量转移至5ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。

其中，所用聚酰胺柱按照下述方法进行处理：取新购置的聚酰胺颗粒，用60目筛筛除细粉，加2～3倍重量的水浸泡使其润湿，装入色谱中，用2～5倍柱体积的2％～5％的盐酸溶液洗脱，再用去离子水洗脱至中性，接着用2～5倍柱体积的2％～5％的氢氧化钠溶液洗脱，再用去离子水洗脱至中性，即可。

(2)银杏叶提取物：精密称取购自浙江康恩贝植物提取物有限公司生产的产品批号为070301的银杏叶提取物0.035g，精密加入甲醇10ml，超声处理10分钟，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。

(3)舒血宁注射液：取注射液，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。

测定：分别精密吸取对照品溶液与上述三种供试品溶液各2μl，注入高效液相色谱仪中进行测定，所得高效液相色谱结果如图1-图4所示。其中，图1为对照品的HPLC图谱，槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的保留时间为23.084分钟，图2为作为供试品的银杏叶药材的HPLC图谱，槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的保留时间为22.964分钟，图3为中作为供试品的银杏叶提取物的HPLC图谱，槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的保留时间为23.092分钟，图4为作为供试品的舒血宁注射液的HPLC图谱，槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的保留时间为22.926分钟。

按照外标法计算槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的含量，具体计算过程如下：

得到所述供试品为银杏叶时，其中槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的浓度为0.033mg/g；

按照与上相同的方法，计算得到所述供试品为银杏叶提取物时，其中槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的浓度为12.24mg/g；所述供试品为舒血宁注射液时，其中槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的浓度为0.021mg/ml。

实施例2、

色谱条件与系统适用性试验：

色谱柱的型号为HP 1100型InertsilODS-3 C18，规格为250mm×4.6mm，5μm，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，以流动相A和流动相B组成的混合液为流动相，按照表2所示进行梯度洗脱，每次洗脱的平衡时间为10分钟，流动相的流速为每分钟1.0ml；检测波长为360nm，柱温为30℃，理论板数按槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷峰计算应不低于8000。所述流动相A为由水、乙腈、异丙醇和柠檬酸以体积比1000∶470∶50∶6.08混合而得的混合液，所述流动相B为水、乙腈、异丙醇和柠檬酸以体积比1400∶200∶30∶6.88混合而得的混合液。表2中，A代表所述流动相A，B代表所述流动相B，所列A和B的百分比(％)均为体积百分比。对于表2中所列时间段内，流动相的体积百分比由小到大或由大到小进行变化的洗脱区间，可直接设定该洗脱区间内体积百分比的两端值，色谱仪中的既定程序会进行自动调整。

表2、梯度洗脱条件

对照品溶液的制备：精密称取槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.07mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：

(1)银杏叶：取银杏叶本品，粉碎，精密称取2g，精密加入75％乙醇100ml，称定重量，置水浴中加热回流提取40分钟，取出，放冷，再称定重量，用75％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣加水2ml使溶解，置于已处理好(该处理方法同实施例1)的聚酰胺柱(30～60目，3g，内径1cm)，用水50ml洗脱，弃去水液，再用75％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，定量转移至5ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。

(2)银杏叶提取物：精密称取购自浙江康恩贝植物提取物有限公司生产的产品批号为070301的银杏叶提取物0.035g，精密加入甲醇10ml，超声处理10分钟，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。

(3)舒血宁注射液：取注射液，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。

测定：分别精密吸取对照品溶液与上述三种供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪中进行测定，所得高效液相色谱结果如图5-图8所示。其中，图5为对照品的HPLC图谱，槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的保留时间为63.869分钟，图6为作为供试品的银杏叶药材的HPLC图谱，槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的保留时间为63.156分钟，图7为作为供试品的银杏叶提取物的HPLC图谱，槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的保留时间为62.464分钟，图8为作为供试品的舒血宁注射液的HPLC图谱，槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的保留时间为62.296分钟。

按照外标法计算槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的含量，具体计算过程如下

得到所述供试品为银杏叶时，其中槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的浓度为0.033mg/g；

按照与上相同的方法，计算得到所述供试品为银杏叶提取物时，其中槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的浓度为12.24mg/g；所述供试品为舒血宁注射液时，其中槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的浓度为0.021mg/ml。

实施例3、

色谱条件与系统适用性试验：

色谱柱的型号为Inertsil ODS-3 C18，规格为250mm×4.6mm，5μm，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，以乙腈和浓度为0.4％的磷酸水溶液的混合液为流动相，按照表3所示进行梯度洗脱，每次洗脱的平衡时间为10分钟，流动相的流速为每分钟1.0ml；检测波长为360nm，柱温为30℃，理论板数按槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷峰计算应不低于8000。表3中，A代表乙腈，B代表浓度为0.4％的磷酸水溶液，所列A和B的百分比(％)均为体积百分比。对于表3中所列时间段内，流动相的体积百分比由小到大或由大到小进行变化的洗脱区间，可直接设定该洗脱区间内体积百分比的两端值，色谱仪中的既定程序会进行自动调整。

表3、梯度洗脱条件

对照品溶液的制备：精密称取槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.07mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：

(1)银杏叶提取物：精密称取购自浙江康恩贝植物提取物有限公司生产的产品批号为070301的银杏叶提取物0.035g，精密加入甲醇10ml，超声处理10分钟，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。

(2)舒血宁注射液：取注射液，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。

测定：分别精密吸取对照品溶液与上述三种供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪中进行测定，所得高效液相色谱结果如图9-11所示。其中，图9为对照品的HPLC图谱，槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的保留时间为52.285分钟，图10为作为供试品的银杏叶提取物的HPLC图谱，槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的保留时间为52.222分钟，图11为作为供试品的舒血宁注射液的HPLC图谱，槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的保留时间为52.225分钟。

按照外标法计算槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的含量，具体计算过程如下：

得到所述供试品为银杏叶提取物时，其中槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的浓度为12.24mg/g；所述供试品为舒血宁注射液时，其中槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷的浓度为0.021mg/ml。