一个大豆MADS-box基因及其在花器官改造中的应用

摘要

本发明公开了一个大豆MADS-box基因及其在花器官改造中的应用及其在花器官改造中的应用，属于生物技术领域。GmMADS1是定位于细胞核内的转录因子，在四轮花器官中都有所表达，但花瓣和雄蕊中表达量较大，过量表达GmMADS1的烟草，增加了萼片、雄蕊和花瓣的数目，产生了萼片、雄蕊向花瓣的转变，出现了开裂的花瓣和弯曲的雄蕊等，导致雄蕊无法触及雌蕊，而不能正常授粉以及花药不能正常开裂，花粉的活力降低。以上结果表明GmMADS1在花瓣位置和数目的确定以及雄性器官发育方面发挥了重要的调控作用。利用GmMADS1基因获得的花器官发生变异的新材料可用于农作物和观赏园艺植物的育种应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一个大豆MADS-box基因GmMADS1的应用，属于植物基因工程领域。

背景技术

人们已经从处于不同进化地位的整个庞大的植物各类群中分离得到了大量的MADS-box基因，MADS-box基因在花发育中起着重要作用，无论是从营养生长向生殖生长的转换；还是在生殖生长的初始阶段，花分生组织决定基因启动花分生组织的发育；以及在生殖生长后期，花器官原基的发育中都发挥着重要的作用。

大豆作为重要的粮油作物，有关其花发育的研究还相对滞后。大豆花多，花器较小，花粉粘重，花朵开放时翼瓣和龙骨瓣紧紧包住雄蕊和柱头，花药和柱头不外露，异花间的风媒传粉等花器特点造成大豆异花传粉非常难，也使大豆杂种优势很难利用，如果能定向改变大豆的花器结构，使之更利于吸引传粉昆虫或有利于风媒传粉，这将大大降低不育系繁殖或杂交制种的成本，使大豆杂交种应用于大面积生产。Feng(2006)通过对LjCYC2的遗传操作，在百脉根中已经实现对花瓣的改造。对大豆这样的严格自花授粉作物而言，或许可以以基因操作为基础的分子设计，实现其传粉方式的改变。因此，弄清花发育的分子机制，进而为改造花器官提供基础，具有重要的理论和现实意义。本发明从大豆中克隆了1个与在花瓣位置和数目的确定性上发挥了重要的调控作用的基因GmMADS1，提出了利用该基因进行植物花器官改造的基因工程改良方法。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于公开大豆MADS-box基因GmMADS1在花器官改造中的基因工程应用，该基因可作为目的基因导入植物，改变植物的花型，以进行植物品种改良。

技术方案

本发明所提供的大豆MADS-box基因GmMADS1，其序列为：SEQ ID NO.1。

大豆MADS-box基因GmMADS1的基因工程应用，包括：

1)大豆MADS-box基因GmMADS1的克隆

根据大豆MADS-box基因GmMADS1的全长序列，设计两端引物：

上游引物：5′-GAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3′

下游引物：5′-CAAGGAAGAGGCTAGCTAGG-3′

取大豆品种Jackson花和花芽的混合物，提取总RNA，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性4分钟，94℃变性30s，55℃复性1min，72℃延伸2min，33个循环后，72℃10min，将PCR产物进行克隆至pMD18-T载体，测序后获得具有完整编码区的大豆MADS-box基因GmMADS1的cDNA序列SEQ ID NO.1；

2)植物表达载体的构建

根据大豆MADS-box基因GmMADS1的cDNA序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物上引入BamHI限制性内切酶位点，下游引物引入SacI限制性内切酶位点(单下划线标示的是BamHI的酶切位点；双下划线标示的是SacI的酶切位点)：

上游引物：5-AGGATCCGAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3

下游引物：5-AGAGCTCCAAGGAAGAGGCTAGCTAGG-3

以步骤1)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将GmMADS1的cDNA克隆至中间载体pMD18-T，进一步克隆到双元表达载体pBI121；

3)转基因植株的获得

将步骤2)获得的表达载体转入农杆菌菌株LBA4404，进一步转入植物，对获得的转基因植株进行PCR，RT-PCR验证后进行植物的表型分析，获得将步骤2)获得的表达载体转入农杆菌菌株LBA4404，进一步转入烟草，对获得的转基因植株进行PCR，RT-PCR验证后进行植物的表型分析，获得的GmMADS1转基因植株提前开花、矮化，萼片、雄蕊和花瓣的数目增加，产生了萼片、雄蕊向花瓣的转变，出现子房状萼片、开裂的花瓣和弯曲的雄蕊，而且由于雄蕊弯曲和缩短，导致雄蕊无法触及雌蕊，而不能正常授粉；此外，GmMADS1转基因植株的花药不能正常开裂，花粉的活力降低，最终导致转基因植株育性下降甚至完全不育。

有益效果

GmMADS1mRNA表达分析表明其有可能参与花瓣和雄蕊的发育。进一步的过量表达GmMADS1的烟草的花器官变化表明GmMADS1在花瓣位置和数目的确定以及雄性器官发育方面可能发挥了重要的调控作用。本发明公开了该基因进行植物花器官改造的基因工程改良方法。该方法对培育花器官改变的植物品种特别是大豆品种具有一定的作用，可以通过定向地改造作物的花器形态，为农作物提高制种效率服务，进而为提高农作物特别是大豆的产量服务。

利用植物表达载体，将本发明的GmMADS1导入植物细胞，可获得花器官改变的转基因细胞系及转基因植株。

使用GmMADS1构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)。从转基因植物的安全性考虑，也可不加任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植株。

携带有本发明GmMADS1的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、玉米等单子叶植物，也可以是大豆、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等双子叶植物。

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1GmMADS1基因的组织表达分析。

采用半定量RT-PCR技术进行不同大豆组织GmMADS1的组织表达研究，Actin1基因的表达为内参图2 335S：GmMADS1转基因烟草萼片、花瓣和雄蕊的数目增加。

A，D，F表示野生型烟草(WT)的花瓣、雄蕊和萼片均为5枚；B，C，E，G表示野生型烟草的花瓣、雄蕊和萼片均为6枚；D-E中标尺代表1mm

图3 35S：GmMADS1转基因烟草异常的花器官。

(A)WT的花型；(B)35S：GmMADS1转基因烟草萼片开裂；(C)35S：GmMADS1转基因烟草花瓣开裂；(D)35S：GmMADS1转基因烟草萼片转变为花瓣；(E-G)35S：GmMADS1转基因烟草雄蕊转变为花瓣。

图4 35S：GmMADS1转基因烟草的花丝变短卷曲。

(A)WT的花型；(B)WT的花丝；(C)WT花丝外表皮扫描电镜图片；(D)35S：GmMADS1转基因烟草的花型；(E)35S：GmMADS1转基因烟草的花丝；(F)35S：GmMADS1转基因烟草的花丝外表皮扫描电镜图片；A.B.D.E中标尺代表1mm，C中标尺代表3μm，F中标尺代表5μm。图535S：GmMADS1转基因烟草的花药不开裂、花粉萌发活力下降。

(A-B)WT的花药；(C-D)35S：GmMADS1转基因烟草的花药；(E)WT和35S：GmMADS1在显微镜下1个视野内花粉数目的平均值(n＝10)；(F)WT和35S：GmMADS1在显微镜下1个视野内花粉萌发率的平均值(n＝10)；(A)中标尺代表100μm，(B)中标尺代表100μm，(C)中标尺代表100μm，(D)中标尺代表50μm。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、大豆MADS-box基因GmMADS1的cDNA克隆与鉴定

根据GmMADS1的全长序列设计引物，

上游引物：5′-GAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3′

下游引物：5′-CAAGGAAGAGGCTAGCTAGG-3′

应用RT-PCR方法，从大豆品种Jackson(公知公用，国家大豆改良中心可购买)中克隆了GmM舒畅ADS1基因。取大豆花和花芽的混合物，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(TRIzol Reagents，Invitrogen，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。以获得的总RNA为模板，按照美国Promega公司提供的反转录试剂盒的说明书进行反转录，合成cDNA第一链。进行PCR扩增反应。PCR程序如下：94℃预变性4分钟，94℃变性30s，55℃复性1min，72℃延伸2min，33个循环后，72℃10min，将931bp的PCR产物进行克隆至pMD18-T载体，测序后获得具有完整编码区的大豆MADS-box基因GmMADS1的cDNA序列SEQ ID NO.1；

实施例2、大豆GmMADS1基因在不同组织中的表达特征

大豆品种Jackson于正常季节种植于南京农业大学网室中。取大豆六复叶期的根、茎和叶，大豆盛花期(R1)取花和花芽的混合物，大豆初荚期(R3)的荚，开花后20天幼嫩的种子，液氮速冻存于-80℃备用。大豆盛花期取完整的花无菌分割成萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊，液氮速冻存于-80℃备用。

总RNA的提取同实施例1。以大豆组成型表达的Actin基因(GenBank accessionNo.V00450)为内部参照，以来自大豆不同组织的总RNA为模板，进行RT-PCR分析。RT-PCR分析表明GmMADS1在包括花、种子和荚等生殖器官表达，在营养器官(根、茎和叶)不表达，在茎生长点中表达(图1)，说明该基因在调节该组织细胞增殖上可能也起到一定的作用。进一步我们分析了GmMADS1在花瓣、雄蕊、心皮和萼片中的表达情况，结果显示该基因在四轮花器官中都表达，但花瓣和雄蕊中表达量较大(图1)，说明该基因最有可能参与花瓣和雄蕊的发育。

实施例3、GmMADS1的基因工程应用

根据GmMADS1的cDNA序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物上引入BamH I限制性内切酶位点，下游引物引入SacI限制性内切酶位点：

上游引物：5-AGGATCCGAGATGGGAAGGGGAAGAGT-3

下游引物：5-AGAGCTCCAAGGAAGAGGCTAGCTAGG-3

以1)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将GmMADS1的cDNA克隆至中间载体pMD18-T，进一步克隆到双元表达载体pBI121；用冻融法将获得的表达载体转入农杆菌菌株LBA4404，通过农杆菌介导法转化烟草，对获得的转基因植株进行表型和细胞学分析，发现GmMADS1的异位表达促使烟草提前开花、矮化，增加了萼片、雄蕊和花瓣的数目(图2)，产生了萼片、雄蕊向花瓣的转变，出现子房状萼片、开裂的花瓣和弯曲的雄蕊等(图3)，而且由于雄蕊弯曲和缩短，导致雄蕊无法触及雌蕊(图4)；此外，GmMADS1转基因植株的花药不能正常开裂，花粉的活力降低，最终导致转基因植株育性下降甚至完全不育(图5)。因此我们认为GmMADS1在花瓣位置和数目的确定以及雄性器官发育方面发挥了重要的调控作用。利用GmMADS1基因获得的花器官发生变异的新材料可用于农作物和观赏园艺植物的育种应用。

SEQUENCE LISTING

<110>南京农业大学

<120>一个大豆MADS-box基因及其在花器官改造中的应用

<130>GmMADS1.prj

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>931

<212>DNA

<213>大豆(Glycine max)

<220>

<221>CDS

<222>(4)..(735)

<223>

<220>

<221>5’primer bind

<222>(1)..(20)

<223>

<220>

<221>3’primer bind

<222>(912)..(931)

<223>

<220>

<221>mRNA

<222>(1)..(931)

<223>

<400>1

gag atg gga agg gga aga gtg gag ttg aag aga att gag aac aag atc    48

    Met Gly Arg Gly Arg Val Glu Leu Lys Arg Ile Glu Asn Lys Ile

    1               5                   10                  15

aac agg caa gtg acc ttt gca aaa cga agg aac ggg ctt ttg aag aaa    96

Asn Arg Gln Val Thr Phe Ala Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys

                20                  25                  30

gct tat gag ctt tcc gtt ctt tgt gat gcc gag gtt gct ctc atc atc    144

Ala Tyr Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Ile

            35                  40                  45

ttc tcc aat aga gga aag cag tac gag ttt tgc agc ggt tca agc atg    192

Phe Ser Asn Arg Gly Lys Gln Tyr Glu Phe Cys Ser Gly Ser Ser Met

        50                  55                  60

ctc aaa acg ctg gag agg tac cag aaa tgc aac tat gga gcg cct gag    240

Leu Lys Thr Leu Glu Arg Tyr Gln Lys Cys Asn Tyr Gly Ala Pro Glu

    65                  70                  75

gac aat gtg gca aca aag gaa gcc ttg gta ttg gag tta agc agt caa    288

Asp Asn Val Ala Thr Lys Glu Ala Leu Val Leu Glu Leu Ser Ser Gln

80                  85                  90                  95

caa gaa tac ttg agg ctg aaa gca cgt tat gaa gct cta caa cgt tct    336

Gln Glu Tyr Leu Arg Leu Lys Ala Arg Tyr Glu Ala Leu Gln Arg Ser

                100                 105                 110

caa agg aac ctt atg gga gaa gat ctt ggc cct cta agc agc aaa gag    384

Gln Arg Asn Leu Met Gly Glu Asp Leu Gly Pro Leu Ser Ser Lys Glu

            115                 120                 125

ctt gaa tca ctt gaa agg cag cta gat tcg tct ttg aag caa atc aga    432

Leu Glu Ser Leu Glu Arg Gln Leu Asp Ser Ser Leu Lys Gln Ile Arg

        130                 135                 140

tca ata agg acc caa ttc atg ctg gat cag ctt tct gat cta caa cgt    480

Ser Ile Arg Thr Gln Phe Met Leu Asp Gln Leu Ser Asp Leu Gln Arg

    145                 150                 155

aag gaa cac ttt cta ggt gag tca aac aga gat ctc aga caa agg ttg    528

Lys Glu His Phe Leu Gly Glu Ser Asn Arg Asp Leu Arg Gln Arg Leu

160                 165                 170                 175

gaa gag ttt caa ata aat cca ctc caa ctg aat ccc agt gct gaa gat    576

Glu Glu Phe Gln Ile Asn Pro Leu Gln Leu Asn Pro Ser Ala Glu Asp

                180                 185                 190

atg ggg tat gga cgc cat cca ggt cag ccc caa ggc cat gct ctc ttt    624

Met Gly Tyr Gly Arg His Pro Gly Gln Pro Gln Gly His Ala Leu Phe

            195                 200                 205

caa cca ttg gag tgt gag cca acc tta caa att gga tat cat cct gat    672

Gln Pro Leu Glu Cys Glu Pro Thr Leu Gln Ile Gly Tyr His Pro Asp

        210                 215                 220

cca gta tca gtg gtg aca gaa ggc cca agc atg aat aat tac atg gca    720

Pro Val Ser Val Val Thr Glu Gly Pro Ser Met Asn Asn Tyr Met Ala

    225                 230                 235

gga tgg tta cca tga aaagagtgtc aagtgtggag cgtaattaag atcctgccgt    775

Gly Trp Leu Pro

240

ttaatttcaa atttatttga agttaggaaa cggaaatttg taatagcacg taatggactt  835

acactagact ctaccttcta attaagctag gaacaatata agcagtgatt ttgtgtgtga  895

gctttcataa acagtaccta gctagcctct tccttg                            931

 

<210>2

<211>243

<212>PRT

<213>大豆(Glycine max)

<400>2

Met Gly Arg Gly Arg Val Glu Leu Lys Arg Ile Glu Asn Lys Ile Asn

1               5                   10                  15

Arg Gln Val Thr Phe Ala Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala

            20                  25                  30

Tyr Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Ile Phe

        35                  40                  45

Ser Asn Arg Gly Lys Gln Tyr Glu Phe Cys Ser Gly Ser Ser Met Leu

    50                  55                  60

Lys Thr Leu Glu Arg Tyr Gln Lys Cys Asn Tyr Gly Ala Pro Glu Asp

65                  70                  75                  80

Asn Val Ala Thr Lys Glu Ala Leu Val Leu Glu Leu Ser Ser Gln Gln

                85                  90                  95

Glu Tyr Leu Arg Leu Lys Ala Arg Tyr Glu Ala Leu Gln Arg Ser Gln

            100                 105                 110

Arg Asn Leu Met Gly Glu Asp Leu Gly Pro Leu Ser Ser Lys Glu Leu

        115                 120                 125

Glu Ser Leu Glu Arg Gln Leu Asp Ser Ser Leu Lys Gln Ile Arg Ser

    130                 135                 140

Ile Arg Thr Gln Phe Met Leu Asp Gln Leu Ser Asp Leu Gln Arg Lys

145                 150                 155                 160

Glu His Phe Leu Gly Glu Ser Asn Arg Asp Leu Arg Gln Arg Leu Glu

                165                 170                 175

Glu Phe Gln Ile Asn Pro Leu Gln Leu Asn Pro Ser Ala Glu Asp Met

            180                 185                 190

Gly Tyr Gly Arg His Pro Gly Gln Pro Gln Gly His Ala Leu Phe Gln

        195                 200                 205

Pro Leu Glu Cys Glu Pro Thr Leu Gln Ile Gly Tyr His Pro Asp Pro

    210                 215                 220

Val Ser Val Val Thr Glu Gly Pro Ser Met Asn Asn Tyr Met Ala Gly

225                 230                 235                 240

Trp Leu Pro