一种酵母表达的长效重组人组织因子途径抑制物

摘要

本发明属生物技术领域，涉及长效组织因子途径抑制物(LTFPI)的高效表达。经对LTFPI序列中的糖基化位点和C末端中4个与受体低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)结合中发挥重要作用的位点进行突变，根据酵母利用密码子的偏爱性对突变后的蛋白编码基因进行系列优化，采用重叠PCR方法，获得优化后的LTFPI基因。与真核表达载体重组，转化毕赤酵母，筛选高表达毕赤酵母工程菌株。经发酵、诱导表达、收集上清、浓缩、离子交换和肝素亲和层析纯化获得高纯度的LTFPI，活性测定显示该LTFPI具有良好的抗凝功能。可进一步制备抗凝血药物。

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及长效组织因子途径抑制物(LTFPI)的高效表达。更具体地，本发明涉及野生型组织因子途径抑制物(TFPI)的糖基化和C末端4个关键受体结合位点进行突变，以及全长LTFPI基因密码子优化、基因克隆、基因表达、蛋白纯化和功能测定。

背景技术

组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)是丝氨酸蛋白酶抑制物，主要由微血管内皮细胞合成，具有较强的抗凝活性，分子量42～48KD，含有3个N-糖基化位点和一个潜在的在酵母中可能糖基化的位点，分别是117N、167N、228N、174S和175T。由于糖基侧链的差异，TFPI分子量不尽相同。研究证实糖基化及糖基化程度的差异并不影响其抗凝活性。由于酵母的糖基化与人体有差异，因此如果应用酵母表达TFPI，则应去除糖基化位点，以免引起免疫反应。

TFPI前体含有28个氨基酸残基组成的信号肽，成熟蛋白质分子含276个氨基酸残基，由富含酸性氨基酸的N端、3个串联的Kunitz型结构域和富含碱性氨基酸的C端组成。3个Kunitz型结构域依次称为K1、K2和K3，K2可以与FXa直接结合并抑制其活性，FXa/TFPI复合物通过K1与FVIIa/TF结合，形成FVIIa/TF/FXa/TFPI四元复合物，从而抑制FVIIa/TF的活性，发挥抗凝活性。

TFPI的C末端能与肝细胞低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)结合，然后进入肝细胞后代谢分解，因此TFPI与LRP的结合与其清除半衰期短有关。野生型TFPI由于半衰期甚短，严重地限制了它的使用。现有技术研究发现，TFPI C末端269、282、288和289位赖氨酸在两者的结合中发挥关键作用，这四个位点被中性的丙氨酸替换后，TFPI与LRP的结合能量显著下降，血浆清除半衰期延长了4倍左右，这种突变后的TFPI称为长效TFPI(long half-time TFPI，LTFPI)。

应用大肠杆菌表达的LTFPI以包涵体形式存在，获得有活性的目的蛋白需要经过变复性等繁杂过程，最终得率很低。而使用CHO、BHK和C127等哺乳动物细胞表达LTFPI，存在操作烦琐、表达量低和成本昂贵等缺点，不能满足实验室研究、临床前研究和将来临床应用的需要。

毕赤酵母是一种高效蛋白表达系统，但是否表达目的蛋白，以及表达蛋白的水平与目的蛋白的结构密切相关，有些蛋白能够获得高效表达，而有些蛋白完全不能表达。有关基础研究的实验显示LTFPI不能在毕赤酵母中获得表达。

发明内容

本发明的目的是提供一种酵母表达的长效重组人组织因子途径抑制物。

本发明应用基因工程和蛋白质工程对LTFPI(ZL 03151203.8)糖基化位点和羧基端位点进行突变；利用生物信息学软件，根据毕赤酵母密码子特点对LTFPI基因序列进行优化，从而使毕赤酵母高效表达有良好抗凝活性的LTFPI。

本发明的另一目的是建立毕赤酵母高效表达无糖基化、半衰期长、具有抗凝血活性的LTFPI制备方法。

按照此种方法获得的LTFPI具有序列1的结构，在毕赤酵母中能获得高效表达，纯化后的LTFPI具有良好的抗凝功能。

本发明实验证实，只有对LTFPI的编码基因进行毕赤酵母密码子偏好性改变后，才能获得高效表达。

本发明在现有技术的基础上，保留将TFPI的羧基末端赖氨酸替换为丙氨酸可以延长其半衰期的方法不变，进一步突变3个糖基化位点和一个可能的在酵母中被糖基化的位点。

本发明在LTFPI序列改变的基础上，对编码基因密码子序列进行了一系列的优化。

本发明利用重叠PCR法，以野生型TFPI基因为模板，设计了能够优化密码子的10对引物，分别具有序列3-22的结构，获得具有酵母密码子偏好性的序列2的LTFPI基因。

本发明将优化后的LTFPI基因与相关质粒重组，DNA限制性内切酶酶切鉴定筛选阳性克隆，核苷酸序列分析验证修改后的LTFPI基因是否正确。

本发明将优化TFPI基因序列与表达载体重组，形成重组表达质粒。本发明不限于特定的表达质粒。在一优选实施方案中，本发明使用的是pPIC9K。

本发明将构建成功的表达载体转化毕赤酵母，重组表达载体可按常规方法导入适宜宿主细胞，本发明不局限于任何特定的酵母细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。在一优选实施方案中，本发明使用的是GS115。

本发明的表达的产物以可溶的形式分泌到上清中，分离纯化，可得有活性的LTFPI。

本发明应用基因工程方法对LTFPI进行生产，所得产品具有高效的抗凝血功能，制备工艺简便，为LTFPI注射剂和非注射剂研究提供了原料，可用于预防和治疗血栓栓塞性疾病等。

附图说明

图1是重叠PCR获取各TFPI片段，其中，

1：DNA标准品

2：第一步反应

3：第二步反应

4：第三步反应

11.第十步反应。

图2.PCR鉴定毕赤酵母阳性转化子，其中，

1.DNA标准品；2-3..8-10.Mut^S转化子；4-7.Mut⁺转化子

图3.LTFPI的诱导表达，其中，

1：蛋白标准品；2-3：诱导前，

4-8：诱导后。

图4.不同诱导时间对LTFPI表达的影响，其中，

1：蛋白标准品；2：诱导12小时；

3：诱导24小时；4：诱导36小时；

5：诱导48小时。

图5.dPT测定LTFPI活性。

图6.dPT测定不同浓度的LTFPI活性。

具体实施方式

实施例1全长TFPI的位点突变和基因序列的优化

将TFPI的117、167和228位氨基酸糖基化位点天冬酰氨替换为谷氨酰胺，将174位点的丝氨酸和175的苏氨酸替换为丙氨酸，将TFPI羧基末端的241、254、260和261位赖氨酸替换为丙氨酸，突变后的TFPI序列如序列1。

把突变后的TFPI序列，利用Synthetic gene designer软件，根据酵母利用遗传密码子的偏爱性，对TFPI基因进行一系列的优化，优化后基因序列如序列2。

实施例2LTFPI的制备和性质鉴定

(1)LTFPI基因的获得

利用重叠PCR法，以野生型TFPI基因为模板，设计能够优化密码子的10对引物，在引物两端加入限制性内切酶EcoRI和NotI序列，引物设计见如表3。

从中间向两端延伸，共进行10轮PCR，除第一轮PCR中10a和10b互为引物和模板外，接下来的PCR，按上一轮PCR的产物作为下轮的模板，依次以9a和9b，8a和8b等进行扩增延长获得基因序列。其过程见图1。回收PCR终产物连接T载体，测序。最终获得了具有酵母密码子偏好性的LTFPI基因。

(2)构建酵母表达质粒pPIC9K-LTFPI

酵母表达载体使用Invitrongen公司的pPIC9K。对测序正确的T载体克隆进行摇菌培养，提取质粒。用EcoRI和NotI双酶切，表达载体也同样用EcoRI和NotI双酶切，分别用1％琼脂糖凝胶电泳回收。将两者连接，构建的重组质粒命名为pPIC9K-LTFPI。

(3)电转化毕赤酵母GS115

用SalI酶切重组质粒pPIC9K-TFPI，使其完全线性化，经酚/氯仿抽提、乙醇沉淀纯化后溶于无菌双蒸水中。取10μL上述线性化重组质粒(10～20μg)，加入80μL感受态毕赤酵母GS115，混匀后转入冰冷的0.2cm电转化杯中，冰浴5min，设置电击参数：电压1500V，电容25μF，电阻200Ω；电击一次，立即加入1mL冰冷的1mol/L Sorbitol，混匀后取600μL转化液，涂布MD平板(1.34％YNB，4×10^-5％Biotin，2％Dextrose，1.5％Agar)，30℃静置培养48h待其长出单克隆菌落。

(4)筛选多拷贝阳性酵母转化子

在MD平板上挑单克隆接种至96孔细胞培养板，每孔200μL YPD培养液，30℃静置培养24h。取10μL菌液接种至新的96孔细胞培养板，每孔190μL YPD培养液，30℃静置培养24h。重复上步操作1次。取2μL菌液分别接种至含0、0.5、1.0、2.0、4.0g/L G418的YPD平板上，30℃静置培养至长出单克隆菌落。

(5)鉴定转化子表型

在高浓度G418-YPD平板上挑取单克隆(约10⁷个细胞)至20μL 0.25％SDS溶液中，混匀后90℃加热3min，离心后取1μL上清作模板，用上、下游引物进行PCR反应。反应体系50μL，含1％Triton X-100。反应条件：95℃变性2min；95℃变性60s，55℃退火60s，72℃延伸120s，进行30个循环；最后72℃延伸5min，4℃保温。根据PCR结果鉴定转化子表型，仅出现一条带(492bp加外源基因片段852bp＝1344bp)者为甲醇利用慢型(Mut^S)，出现两条带(上述条带及2.2kb条带)者为甲醇利用快型(Mut⁺)，结果见图2。

(6)在毕赤酵母中诱导表达重组LTFPI

挑在高浓度G418-YPD平板上生长的含多拷贝阳性单克隆，接种至5mL不BMGY培养液中，振荡培养30℃×250r/min×12h，生长至OD₆₀₀＝5～6，收集离心，并用无菌水细菌两次，转接到BMMY培养液中诱导表达，每8小时补加甲醇0.3％。甲醇诱导培养48小时。诱导表达见图3，目的蛋白的表达与时间的对应关系见图4。

(7)LTFPI的发酵表达

挑Mut⁺型多拷贝阳性单克隆接种至5mL YPD培养液中，振荡培养30℃×250r/min×12h，此为一级种子液。将一级种子液接种至200mL BMGY培养液(1％Yeast Extract，2％Peptone，100mmol/L Potassium Phosphate，1.34％YNB，4×10^-5％Biotin，1％Glycerol)中，振荡培养30℃×250r/min×16h，至OD₆₀₀＝5～6，此为二级种子液。将二级种子液接种至4L低盐发酵培养液中，每升含0.93g CaSO₄·2H₂O，18.2g K₂SO₄，7.27g MgSO₄，26.7mL 85％H₃PO₄，4.13g KOH，40g Glycerol，1.47g二水合柠檬酸钠，2mL PTM1溶液，用28％氨水调节pH至5.0。设置发酵培养条件：温度30℃，搅拌速度600r/min，溶氧度35％，自动补加氨水维持pH5.0。继续培养18h至OD₆₀₀＝70～80，待溶氧度快速上升，培养液中甘油耗尽时开始补加50％甘油溶液，速度80mL/h，时间2～3h，至OD₆₀₀＝150～160时停止补加甘油，待其完全耗尽时立即开始补加甲醇，速度30mL/h，时间24h。

甲醇诱导40h以后，停止发酵，从发酵罐中立即放出菌液进行离心，分离沉淀菌体，收集上清进行纯化。上清中rhTFPI-AP1对TF/FVIIa的抑制常数达Ki＝0.12uM，rhTFPI-AP2对FXa的抑制常数达Ki＝0.09uM。发酵参数为：温度30℃，氧容量控制在35±5％，pH＝5，搅拌速度与DO连动。

实施例3纯化工艺

(1)超滤浓缩脱盐

离心收集18L发酵培养液上清，经Millipore 50KD超滤膜堆反超，然后将超滤液用8KD超滤膜堆浓缩至0.5L，超滤浓缩约40倍。

(2)凝胶过滤

利用Sephadex X-100柱用20mmol/L PB(pH7.0)平衡后，将超滤浓缩液上样，然后用PB洗脱，流速8ml/min，收集活性峰。

(3)Q-Sepharose Fast Flow柱层析

把凝胶过滤层析的活性峰，收集上用20倍柱体积平衡液(20mmol/L PBpH7.0)预平衡的50mmol/L PB(pH 7.0)平衡Q-Sepharose F.F.(Pharmacia公司)柱，凝胶过滤后收集的抗凝活力部分。

(4)Heparin Sepharose CL-6B层析

收集目的峰，利用肝素亲和层析柱进行纯化，分析洗脱峰组份，用BCA法进行蛋白定量，做12％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，扫描分析纯度。分装，冷冻干燥，-70℃保存。

本发明的色谱操作均为常规操作。

实施例4LTFPI活性测定

(1)稀释凝血酶原时间法测定LTFPI活性

采用稀释凝血酶原时间法(dilute prothrombin time，dPT)测定LTFPI的抗凝血活性。用生理盐水将凝血活酶标准溶液分别稀释10、100、200和500倍，置37℃备用。取100μL正常人混合血浆，分别加100μL不同浓度的凝血活酶溶液，加10μL不同浓度的蛋白溶液，37℃孵育1min，加10μL 250mmol/LCaCl₂溶液，开始计时血浆凝固时间。取3次实验平均值记为实验结果，所有试剂均需37℃预热，全部操作2h内完成。图5为稀释凝血酶原时间法测定的纯化LTFPI蛋白和对照的活性，而图6为在稀释PT试剂10倍和50倍下，凝血酶原时间随纯化LTFPI蛋白的浓度依赖关系。

(2)发光试剂法检测LTFPI活性

TFPI的第一个结构域可以和FVIIa/TF结合，第二个结构域与FXa结合，从而形成失活的FVIIa/TF/TFPI/FXa复合物。当LTFPI与TF/FVIIa和FX孵育后，残余的TF/FVIIa活性可以通过发色底物Spectrozyme FXa测定，从而间接反映LTFPI的活性。纯化后的LTFPI活性为0.6unit/ml，相当于标准品的3倍。

序列表(马端)

SEQUENCE LISTING

 

<110>复旦大学

 

<120>一种酵母表达的长效重组人组织因子途径抑制物

 

<130>13

 

<160>22

 

<170>PatentIn version 3.5

 

<210>1

<211>831

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>基因工程方法获得

 

<400>1

gactctgaag aagatgagga acacacaatc atcaccgata ccgaattgcc tccccttaag

60

ttgatgcatt ctttctgtgc tttcaaagct gacgacggtc catgtaaggc cattatgaag  120

agattcttct ttaatatctt tactagacag tgtgaagaat ttatttacgg aggttgtgaa  180

ggtaaccaga ataggttcga atcgttggaa gaatgtaaga aaatgtgtac ccgtgataac

240

gccaacagaa ttattaaaac aactttgcag caggaaaagc cagacttttg cttcttggaa

300

gaggatccag gaatttgtcg tggttacatc acaagatact tctataatca gcagactaaa

360

caatgcgaaa gattcaagta tggaggatgc ttgggaaata tgaacaattt tgaaacgttg

420

gaggaatgca agaatatatg tgaagatgga ccaaatggat tccaggttga caattatggt

480

acccaattaa atgctgtaca gaactcattg actccccagg ctgcaaaggt cccatccttg

540

tttgagttcc atggaccatc ctggtgtttg acccctgccg atcgtggatt gtgtagagct  600

aatgaaaaca gattctatta caattctgtt atcgggaaat gtagaccgtt taagtattct  660

ggatgtggag gaaacgagaa ccagttcacc tctaagcagg agtgtttaag ggcttgtaaa

720

gctggattta ttcagcgtat cagtaaaggt ggtcttattg ctacaaaacg taaaagagca

780

gcccaaagag tcaagattgc ctatgaagag atctttgtta agaacatgta a    831

 

<210>2

<211>276

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>基因工程方法获得

 

<400>2

Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu

1          5             10               15

Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp

        20            25             30

Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr

     35              40             45

Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn

  50             55              60              65

Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn

            70             75            80

Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe

          85            90               95

Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg

        100           105             110

Tyr Phe Tyr Asn Gln Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly

     115            120             125

Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys

  130             135           140

Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly

145             150           155            160

Thr Gln Leu Asn Ala Val Gln Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ala Ala Lys

          165             170             175

Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro

         180            185           190

Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn

      195           200            205

Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly

  210              215            220

Asn Glu Asn Gln Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys

225           230            235             240

Ala Gly Phe Ile Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Ala Thr Lys

           245             250             255

Arg Lys Arg Ala Ala Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe

        260             265              270

Val Lys Asn Met

      275

 

<210>3

<211>58

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>人工合成

 

<400>3

tacgtagaat tcgactctga agaagatgag gaacacacaa tcatcaccga taccgaat    58

 

 

<210>4

<211>56

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>人工合成

 

<400>4

tcaccgatac cgaattgcct ccccttaagt tgatgcattc tttctgtgct ttcaaa    56

 

<210>5

<211>56

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>人工合成

 

<400>5

ttctgtgctt tcaaagctga cgacggtcca tgtaaggcca ttatgaagag attctt    56

 

<210>6

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<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>人工合成

 

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tatgaagaga ttcttcttta atatctttac tagacagtgt gaagaattta tttacg    56

 

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<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>人工合成

 

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aagaatttat ttacggaggt tgtgaaggta accagaatag gttcgaatcg ttggaa    56

 

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<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>人工合成

 

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ttcgaatcgt tggaagaatg taagaaaatg tgtacccgtg ataacgccaa cagaat    56

 

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<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>人工合成

 

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aacgccaaca gaattattaa aacaactttg cagcaggaaa agccagactt ttgctt    56

<210>10

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<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>人工合成

 

<400>10

ccagactttt gcttcttgga agaggatcca ggaatttgtc gtggttacat cacaag    56

 

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<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

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ggttacatca caagatactt ctataatcag cagactaaac aatgcgaaag attcaa    56

 

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<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>人工合成

 

<400>12

tgcgaaagat tcaagtatgg aggatgcttg ggaaatatga acaattttga aacgttg    57

 

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<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>人工合成

 

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attcgcggcc gcttacatgt tcttaacaaa gatctcttca taggcaatct tgactctt    58

 

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<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

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<223>人工合成

 

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gcaatcttga ctctttgggc tgctctttta cgttttgtag caataagacc accttt    56

 

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<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

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<223>人工合成

 

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<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>人工合成

 

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tacaagccct taaacactcc tgcttagagg tgaactggtt ctcgtttcct ccacat    56

 

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<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

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<223>人工合成

 

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tcgtttcctc cacatccaga atacttaaac ggtctacatt tcccgataac agaatt    56

 

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<213>Artificial Sequence

 

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<223>人工合成

 

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ccgataacag aattgtaata gaatctgttt tcattagctc tacacaatcc acgat    55

 

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<213>Artificial Sequence

 

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<223>人工合成

 

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tacacaatcc acgatcggca ggggtcaaac accaggatgg tccatggaac tcaaaca

57

 

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<213>Artificial Sequence

 

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<223>人工合成

 

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atggaactca aacaaggatg ggacctttgc agcctgggga gtcaatgagt tctgta

56

 

<210>21

<211>56

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>人工合成

 

<400>21

caatgagttc tgtacagcat ttaattgggt accataattg tcaacctgga atccat    56

 

<210>22

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<212>DNA

<213>Artificial Sequence

 

<220>

<223>人工合成

 

<400>22

aacctggaat ccatttggtc catcttcaca tatattcttg cattcctcca acgtttca    58