miR-182作为胶质瘤发生分子标志物的应用及其检测试剂盒

摘要

本发明公开了miR-182作为胶质瘤发生分子标志物的应用及其检测试剂盒，在提出miR-182可以作为神经胶质瘤早期诊断的分子标志物的基础上，本发明制备出检测试剂盒，并提出检测外周血miR-182的方法：1)收集待测个体外周血样本，抽提总RNA；2)以总RNA为模板将miR-182特异性逆转录为cDNA；3)用miR-182特异性引物进行实时定量PCR扩增，获得相对定量ΔCT值，当ΔCT≤7.61时提示miR-182表达阳性。本发明的方法及试剂盒可以检测各种人群外周血中miR-182的表达状况，从而预测胶质瘤的患病风险，用于胶质瘤高危人群的筛查，并对胶质瘤患者做出早期、快速的无创性诊断。

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤发生分子标志物，具体涉及微小RNA(miRNA)作为分子标志物在胶质瘤诊断中的应用。

背景技术

胶质瘤包括各种神经上皮来源的肿瘤，是中枢神经系统肿瘤中最常见的恶性肿瘤，约占全部颅内肿瘤的40％～50％。由于大多数胶质瘤呈浸润性生长且与周围脑组织边界不清，即使是最现代的神经外科技术也难以做到病理学上的全切除，因而胶质瘤术后复发率非常高，且随着手术和复发次数的增加，其恶性程度有增加的趋势。运用现代显微外科技术、放疗、化疗等综合治疗措施后，胶质瘤患者预后仍不理想，高度恶性的多形性胶质母细胞瘤(GBM)患者，1年和2年生存率仅为58％和31％。胶质瘤的诊断仍然处于以临床、病理学和影像学信息为基础的经验性阶段，而且一经诊断，绝大多数均为晚期，远远不能适应对胶质瘤进行高危人群筛查和早期诊断的需求。因此，寻找无创伤性的胶质瘤早期诊断标志物对高危人群进行筛查，以便对脑瘤患者进行早期诊断、早期治疗。

microRNA(miRNA)为长度约21-25个核苷酸的非编码RNA，miRNA能够识别特定的目标mRNA并在转录后水平通过促进靶mRNA的降解和/或抑制翻译过程而发挥负调控基因表达的作用，目前miRNA在胶质瘤中的研究仍处于起步阶段，但胶质瘤中特异miRNA表达谱的确定，为神经胶质瘤的诊断与治疗提供了新的方向，最早的相关研究是由Ciafre等人采用microarray chip技术，在9对临床肿瘤样品(癌及癌旁组织)以及10种恶性胶质瘤细胞系(以正常的成人及胚胎脑样品为对照)中，对245种miRNA进行了检测，芯片结果分析显示，miR-221、miR-21等9种miRNAs在恶性胶质瘤中的表达显著上调，其中miR-221上调程度最高，而miR-128，miR-181a，miR-181b及miR-181c等在脑组织中含量丰富的miRNAs则表达下调，这些表达水平改变的miRNAs可能与恶性胶质瘤发生发展密切相关。此外，最新的研究发现，来源于各种组织或器官中的miRNA可以分泌到微血管的外周血中，在血清和血浆中存在等量的miRNA，并且这些miRNA十分稳定，不容易被血液内源性和外源性RNases降解，这种稳定存在的特性，足以显示出miRNA在探寻肿瘤早期诊断分子标志物方面的巨大潜力。

发明内容

本发明目的在于提出miR-182(miRBase登录号：MI0000272)能作为胶质瘤的发生风险的分子标志物之一应用于医药领域，从而提供一种性价比高、易于推广应用的胶质瘤外周血诊断试剂盒。

在前期的研究工作中，发明人发现miR-182在不同级别的胶质瘤组织中存在明显的差异，且随着胶质瘤的病理级别增加，miR-182的表达明显升高。通过进一步研究证实：miR-182是一个与胶质瘤发生发展密切相关的瘤基因，在各种胶质瘤组织中表达明显上调，而在其它脑瘤组织(包括脑膜瘤、听神经瘤、神经鞘瘤、垂体腺瘤、髓母细胞瘤等)变化不明显，这提示miR-182可以作为胶质瘤的特异性诊断标志物。研究还发现，miR-182在肿瘤发病的极早期阶段既可以从肿瘤组织中分泌至微血管的外周血中，且不受RNA酶的降解而稳定存在。因此，发明人提出外周血miR-182可以作为胶质瘤早期诊断的分子标志物，制备胶质瘤外周血诊断试剂盒。

本发明的检测外周血miR-182方法：1)收集待测个体外周血样本，抽提总RNA；2)以总RNA为模板将miR-182特异性逆转录为cDNA；3)用miR-182特异性引物进行实时定量PCR扩增，获得相对定量ΔCT值，ΔCT值＝miR-182于内参基因平均CT值的差值，进行判断，当ΔCT≤7.61时提示miR-182表达阳性。

本发明的检测试剂盒包括：1)从外周血中抽提总RNA所用试剂，包括EDTA抗凝管、淋巴细胞分离液、Trizol、三氯甲烷、异丙醇、无酶水；2)以总RNA为模板将miR-182特异性逆转录为cDNA所用试剂，包括逆转录缓冲液、氯化镁、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、逆转录酶以及miR-182特异性逆转录引物；3)将cDNA实时定量PCR所用试剂，包括缓冲液、miR-182实时定量PCR特异性引物、SYBR-Green染料、Taq聚合酶和双蒸水；所述miR-182的特异性引物为：hsa-miR-182正向引物：ACTTTTGGCAATGGTAGAACTCAC；hsa-miR-182反向引物：AATCCATGAGAGATCCCTAGCG；所述U6snRNA特异性PCR引物其正向引物为5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向引物为5′-GGAACGCTTCACGAATT TG-3′。

本发明的方法及试剂盒可以检测各种人群外周血中miR-182的表达状况，从而预测胶质瘤的患病风险，用于胶质瘤高危人群的筛查，并对胶质瘤患者做出早期、快速的无创性诊断。此外，由于miR-182的表达随着胶质瘤病理级别的进展而增加，因此，外周血miR-182的表达量的检测也可以作为胶质瘤患者预后判断的重要指标。

附图说明

图1原位杂交检测miR-182在正常脑组织和不同病理级别的胶质瘤组织中的表达的组织切片图；

图2实时定量PCR方法检测miR-182在正常脑组织和脑瘤组织中的表达结果图；

图3实时定量PCR方法检测miR-182在正常人和脑瘤患者外周血中的表达结果图。

具体实施方式

在前期研究工作中，发明人利用miRNA芯片和SAM软件分析筛查10例正常脑组织和10例胶质瘤组织中差异表达的miRNA时，发现miR-182在正常脑组织和胶质瘤组织中存在明显差异。

通过进一步miR-182探针原位杂交检测研究，发明人发现：miR-182在不同级别的胶质瘤组织中存在明显的差异，且随着胶质瘤的病理级别增加，miR-182的表达明显升高(参见附图1)，图1中A、B、C、D、E分别为正常脑组织和胶质瘤I、II、III、IV级病理组织原位杂交检测miR-182探针表达的组织切片图。miR-182探针原位杂交检测结果显示：细胞膜或胞浆呈棕黄色颗粒为miR-182阳性，阴性则细胞膜和胞浆均无棕黄色颗粒。其阳性表达程度采用PIPS-2020高清晰度彩色病理图文分析系统进行定量分析，每张切片随机选取5个高倍镜视野(×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度值作为该例的测量值。该实验结果显示：I、II、III、IV级胶质瘤的miR-182表达的平均光密度值分别为0.24±0.03、0.38±0.06、0.56±0.04和0.65±0.05，随着病理级别升高而增加，与正常脑组织(0.09±0.01)比差异均有显著性(P＜0.05)。

同时miR-182是一个与胶质瘤发生发展密切相关的瘤基因，在各种胶质瘤组织中表达明显上调(参见附图2)，而在其它脑瘤组织(包括脑膜瘤、听神经瘤、神经鞘瘤、垂体腺瘤、髓母细胞瘤等)表达变化不明显，这提示miR-182可以作为胶质瘤的特异性分子诊断标志物。

研究还发现，miRNA在肿瘤发病的极早期阶段既可以从肿瘤组织中分泌至微血管的外周血中，且不受RNA酶的降解而稳定存在。

根据上述发现，发明人进一步检测了miR-182在正常人和脑瘤患者外周血中的表达情况，发现miR-182在胶质瘤患者外周血中表达明显升高，与正常人外周血中的表达存在明显差异(p＜0.01)(参见附图3)。即使在胶质细胞增生(胶质瘤发生的极早期阶段)患者的外周血中，仍然可以检测到miR-182与正常人患者外周血中的表达差异(p＜0.05)，而在其他被检测脑瘤患者(包括垂体瘤、脑膜瘤、听神经瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤和髓母细胞瘤等)中miR-182表达变化不明显，与正常人外周血miR-182表达相比，没有显著性差异(p＞0.05)。提示外周血miR-182可以作为胶质瘤早期诊断的特异性分子标志物。

实施例1 制备胶质瘤外周血诊断试剂盒(50次反应)

1.淋巴细胞分离液300ml，

2.Hank’s液或PBS 300ml，

3.异丙醇100ml，

4.三氯甲烷100ml，

5.Trizol 50ml，

6.DEPC水或无酶水10ml，双蒸水10ml，

7.5×逆转录缓冲液1ml，

8.25mM氯化镁1ml，

9.10mM三磷酸碱基脱氧核苷酸1ml，

10.5U/μl RAN酶抑制剂500μl，

11.200U/μl MMLV逆转录酶50μl或25U/μlAMV酶50μl，

12.2×实时定量PCR缓冲液2ml，

13.5U/μl Taq聚合酶50μl，

14.5μM hsa-miR-182特异性PCR引物50μl，

其正向引物为5′-ACTTTTGGCAATGGTAGAACTCAC-3′，

其反向引物为5′-AATCCATGAGAGATCCCTAGCG-3′。

15.5μM U6snRNA特异性PCR引物30μl

其正向引物为5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′

其反向引物为5′-GGAACGCTTCACGAATT TG-3′

16.10μM hsa-miR-182特异性逆转录引物20μl(上海吉玛生物技术有限公司，QPM010)。

17.10μM U6snRNA特异性逆转录引物20μl(上海吉玛生物技术有限公司，QPM010)。

实施例2 外周血样本中miR-182的检测

1、外周血RNA的抽提：采用EDTA抗凝管，采集待测个体外周血样本5ml。采血后需来回轻晃抗凝管，让血液与管壁的抗凝剂充分接触，动作轻柔以防溶血，立即抽提外周血总RNA。

1)外周血单核细胞提取：取EDTA抗凝血5ml，1000rpm离心6min，吸取上层血浆于EP管中-70℃保存，向下层的外周血细胞加入等体积的Hanks液颠倒混匀；取淋巴细胞分离液6ml于离心管中，将混匀的血细胞沿管壁缓慢注入分离液中，使两液体间保持清晰的界面，2000rpm离心20min；吸取血浆和分离液之间的单个核细胞层于EP管中，4℃ 6000rpm离心10min；弃上清液，加入Hanks液1ml吹打混匀，4℃ 6000rpm离心10min；弃上清，加Trizol 1ml吹打混匀，冰上静置5-10min，提取RNA或-70℃保存。

2)Trizol提取细胞总RNA：加氯仿200μl/mlTrizol于Tube中，用手震荡15-30s，冰上放置5min，4℃ 12000g离心15min；小心取上层水相入新tube中，加入预冷的异丙醇0.5ml/mlTrizol混匀，-20℃冰箱静置20min，4℃ 12000g离心10min；弃上清，加入75％ DEPC水稀释的乙醇1-2ml混匀，4℃ 7500g离心5min，尽量弃上清，室温干燥5-10min，加入DEPC水10-20μl溶解RNA。分光光度计测RNA的浓度及质量，OD260/280比值在1.6-1.8之间并进行EB胶电泳检测RNA质量，-70℃保存。

2、miR-182特异性逆转录：使用普洛麦格Promega公司的逆转录试剂盒(A3500)和上海吉玛生物技术有限公司生产的Hairpin-itTM miR-182逆转录特异性引物(QPM010)进行逆转录。20μL逆转录反应的体系如下：

成分                          剂量/管

5×逆转录缓冲液               4μl

镁离子(25mM)                  3μl

三磷酸碱基脱氧核苷酸(10mM)    0.75μl

MiR-182逆转录引物(1μM)       1.20μl

RNA酶抑制剂(40U/μl)          0.25μl

MMLV逆转录酶(200U/μl)        0.2μl

RNA样本(1μg总1RNA)           Xμl

无酶水                        To 20μl

在进行逆转录反应之前须将除了逆转录酶外的各种试剂混合成逆转录混合液，用手指轻弹装试剂的管子，将逆转录混合液用移液器吸打几次，不能用振荡器。

miR-182逆转录程序：16℃ 30分钟，42℃ 30分钟，85℃ 10分钟。

3、miR-182特异性实时定量PCR：先将逆转录产物稀释至2倍，然后混匀。20μL反应体系如下：

成分                    剂量/管

2×实时定量PCR缓冲液    10μl

miR-182特异性引物(5μM) 0.4μl

cDNA产物                2μl

Taq聚合酶(5U/μl)          0.2μl

双蒸水                     To 20μl

miR-182实时定量PCR反应程序：95℃ 3分钟，40个循环，95℃ 12秒，62℃ 35秒。

使用SYBR-Green染料进行实时定量PCR扩增。

miR-182的特异性引物为：

hsa-miR-182正向引物：ACTTTTGGCAATGGTAGAACTCAC

hsa-miR-182反向引物：AATCCATGAGAGATCCCTAGCG

U6 SnRNA作为内参基因，其引物序列为：

正向引物：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′

反向引物：5′-GGAACGCTTCACGAATT TG-3′

4、ΔC_T指标的测定：ΔC_T指同一样品中，待检miRNA与内参U6 SnRNA平均Ct值的差值。即miRNA ΔC_T＝miRNA MeanC_T-control MeanC_T，本发明中，ΔC_T为miR-182与U6snRNA的平均C_T值的差值，获得相对定量ΔCT值，并进行判断，当ΔCT≤7.61时，预示胶质瘤发生。

实施例3 外周血样本中miR-182检测方法的临床验证

以上述检测方法，检测了22例正常人外周血和106例疑似脑瘤患者外周血(新入院的初始病人，手术前)中miR-182的表达。

与正常人外周血miR-182的表达相比，其中33例患者外周血中miR-182的表达升高，其ΔCT均≤7.61，33例患者在手术后经病理证实：胶质瘤31例，垂体腺瘤1例，神经鞘瘤1例，另73例患者在外周血miR-182实时定量PCR检测时，miR-182变化不明显，其ΔCT值均＞7.61，差异没有显著性(p＞0.05)。经手术后病理诊断证实：颅咽管瘤5例，髓母细胞瘤4例，脑膜瘤17例，垂体腺瘤21例，神经鞘瘤13例，听神经瘤10例，交通动脉瘤1例，毛细血管瘤2例。

以上研究表明，外周血miR-182可以作为胶质瘤患者诊断的特异性分子标志物，当ΔCT值≤7.61时，预示胶质瘤发生的可能性为93.94％，检测外周血miR-182的表达，具有很好的稳定性，可以用于胶质瘤高危人群筛查和早期诊断。