纤维素水解酶β-1,4葡聚糖内切酶基因

摘要

本发明涉及纤维素水解酶β-1，4葡聚糖内切酶基因，属于应用工业微生物领域。本发明提供了纤维素水解酶系中关键酶之一的β-1，4葡聚糖内切酶基因及其所推导的水解酶蛋白质。该基因全长为1332bp，G+C含量为43.77％，编码443个氨基酸，为新的纤维素水解酶基因资源。利用该基因构建的工程菌株能高效表达β-1，4葡聚糖内切酶，该酶在以羧甲基纤维素钠为底物时的Km值和Vmax分别是19.92mg/ml和1941μmolmin-1mg-1，生产的酶制剂可用于食品，医药，饲料，纺织、洗涤等工业，不仅可以解决纤维素的再利用问题，还可以取得可观的经济效益。

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种纤维素水解酶β-1，4葡聚糖内切酶基因，属于应用工业微生物领域，生产的酶制剂用于食品，医药，饲料，纺织、洗涤等工业，不仅可以解决纤维素的再利用问题，还可以取得可观的经济效益。

二、背景技术

纤维素是高等植物细胞壁的主要成分，占植物总干重的30％～50％，是地球上分布最广、含量最丰富的可再生性碳源化合物，占地球总生物量的40％。据报道，我国每年光作物秸杆、稻梗等含纤维素较丰富的物质就有5亿吨之多，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达1.55×10⁹吨，其中尚有89％未被人们利用，而大量的秸杆、稻梗等含纤维素丰富的物质的利用率也很低，大多采用燃烧的方法来处理，这样就造成了环境污染，破坏了土壤的理化性质和丧失了有机质成分。所以，纤维素的充分利用与有效的转化对于解决当前的能源危机、粮食短缺、环境污染等有重大的意义。

纤维素酶是分解纤维素的一类酶，它能将纤维素分解为葡萄糖，充分的利用了纤维素。自1906年Sellieres在蜗牛消化液中发现纤维素酶以来，纤维素酶的研究和应用受到了国内外学者的极大关注，取得了很大进展。目前，国内外学者通过筛选产酶菌株来发酵产酶，再应用纤维素酶到食品、医药、饲料、纺织、洗涤和能源等工业中，不仅解决了纤维素的再利用问题还取得了很可观的经济效益。

纤维素酶是多酶组分的一个复杂酶系，主要来自于真菌和细菌。根据纤维素各酶功能的不同，分为三大类：葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶。采用基因工程手段构建高效表达菌株可以实现纤维素酶的大量表达，目前有近100多个纤维素酶基因可在大肠杆菌中克隆和表达，主要是葡聚糖内切酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素酶基因的获得在纤维素利用领域有巨大的应用潜力，同时可通过基因改造提高纤维素酶的作用能力，并通过基因工程实现各纤维素水解酶基因的协同作用，以期更好得开发利用纤维素物质资源，实现生物量的转化利用，这对人类的可持续发展具有非常重要的意义。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是提供纤维素水解酶基因，属于应用工业微生物领域，生产的酶制剂用于食品，医药，饲料，纺织、洗涤等工业，不仅可以解决纤维素的再利用问题，还可以取得可观的经济效益。

技术方案

β-1，4葡聚糖内切酶基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为1332bp，G+C含量为43.77％，编码443个氨基酸，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。

β-1，4葡聚糖内切酶基因片段与酶切好的pET-29a(+)进行酶连获得含β-1，4葡聚糖内切酶基因的PET-29a(+)重组质粒。

酶连好的含β-1，4葡聚糖内切酶基因的pET-29a(+)重组质粒转化到表达宿主菌E.coli BL21(DE3)，获得重组微生物E.coli BL21(DE3)。其构建流程如下：

用分别含NdeI和XhoI的正反向PCR引物从阳性克隆子中扩增出β-1，4葡聚糖内切酶基因片段；经NdeI和XhoI双酶切后和同样用这两种酶切好的pET-29a(+)进行酶连，酶连好的含β-1，4葡聚糖内切酶基因的pET-29a(+)重组质粒转化到表达宿主菌E.coliBL21(DE3)获得重组微生物E.coli BL21(DE3)，转接到含有质量比1.5％羧甲基纤维素钠、50mg/L卡那霉素和24mg/L IPTG的平板，37℃培养16h后经0.25％刚果红溶液染色30min和1M NaCl溶液脱色10min，挑取有透明水解圈的阳性转化子，经测序验证基因序列无误后，保存。

上述β-1，4葡聚糖内切酶基因可以在食品，医药，饲料，纺织、洗涤等工业中得到应用。其所涉及的β-1，4葡聚糖内切酶可以在食品、医药、饲料、纺织、洗涤和能源等工业中应用。

有益效果

1.以江西鹰潭菜地红壤为材料构建其中的微生物功能基因组BAC文库，并成功从该文库中克隆出β-1，4葡聚糖内切酶(纤维素降解过程中的关键酶之一)基因。

2.该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为1332bp，G+C含量为43.77％，编码443个氨基酸。

3.通过PCR技术扩增末端含NdeI和XhoI酶切位点的完整的β-1，4葡聚糖内切酶基因片段，将它连接到大肠杆菌高表达载体pET-29a(+)(购自Novegen公司)的NdeI和XhoI酶切位点上，转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3)(购自Invitrogen公司)，进行IPTG诱导表达。

4.本发明对β-1，4葡聚糖内切酶基因表达的产物，做了酶活性测定，能高效的水解羧甲基纤维素钠，在以羧甲基纤维素钠为底物时的Km值和Vmax分别是19.92mg/ml和1941μmol min^-1mg^-1。

5.利用该基因构建的工程菌株能高效表达β-1，4葡聚糖内切酶(活性β-1，4葡聚糖内切酶蛋白的含量约占细胞总蛋白含量的30％)，生产的酶制剂可用于食品、医药、饲料、纺织、洗涤和能源等工业。

四、附图说明

图1β-1，4葡聚糖内切酶基因克隆的策略图

图2β-1，4葡聚糖内切酶基因在E.coli BL21(pET-29a(+))中高效表达实验方案图

五、具体实施方式

1.β-1，4葡聚糖内切酶基因的克隆

1.1红壤微生物功能基因组BAC文库的构建

以0.2％焦磷酸钠水溶液作为分散剂水土比3∶1悬浮土壤颗粒、匀浆为分散方式(九阳JYL-350，22,000rpm，3s，12次)使菌体细胞从土壤颗粒中释放出来，经过蔗糖密度梯度离心初步分离菌体和土壤颗粒后，再用Nycodenz(Axis-Shield，Norway)为介质经密度梯度离心纯化微生物菌体(大部分细菌及一些真菌和放线菌孢子)，将得到的菌体细胞用低熔点琼脂糖(BBI)包埋裂解获得大小超过400kb的大片段DNA，用限制性内切酶Sau3AI将其部分酶切，再经交变脉冲场电泳(BIO-RAD)分离和电洗脱收集50kb～100kb的DNA片段，与用质粒pCUGIBACI(见Meizhong Luo，Yi-Hong Wang，David Frisch，Tarek Joobeur，Rod A.Wing，and Ralph A.Dean.2001.Melon bacterial artificial chromosome(BAC)libraryconstruction using improved methods and identification of clones linked to the locusconferring resistance to melon Fusarium wilt(Fom-2).Genome.44：154-162.)制备的脱磷载体连接后，电转化导入制备的E.coli DH10B感受态细胞(菌株购自Invitrogen公司)，通过蓝白斑筛选挑选阳性克隆，构建红壤微生物功能基因组BAC文库。

1.1.1限制性内切酶Sau3AI酶切总DNA体系如下：

总DNA：5μg

10×buffer H：50μl    

Sau3AI：2ul

双蒸水补齐体系至500μl，4℃平衡置换4h后，37℃酶切30min。

酶切产物经交变脉冲场电泳(缩写PFGE)筛选50kb～100kb的DNA片段(电泳条件：6V/cm，10s～25s，12.5℃，14hr，1％PFGE agarose，0.5*TBE缓冲液)，将目的片段切胶后用普通电泳(TAE缓冲液)电洗脱回收DNA片段。

1.1.2载体的制备、酶切和脱磷

质粒pCUGIBACI的大量提取：碱裂解法(见分子克隆)。

质粒酶切、回收、脱磷：：

1)限制性内切酶BamHI酶切质粒，酶切体系如下：

质粒DNA：5μg

10×bufferK：50μl

BamHI：15ul

双蒸水补齐体系至500μl，30℃水浴过夜，电泳检测酶切效果。

2)试剂盒(Axygen biosciences company，China)回收酶切后的7.4Kb大小的片段，方法按产品说明书进行，电泳检测回收片段。

3)质粒载体的去磷酸化反应：

①在微量离心管中建立以下的反应体系，全量定容至50μl。

酶切回收后的质粒片段：3ug

10×碱性磷酸酯酶buffer：5μl

CIAP(16U/μl TAKARA)：0.5ul稀释至5ul，每管加1ul

重蒸水：补足至50μl

②50℃反应30min，加1/10体积0.5M的EDTA终止反应；合并四管反应体系用ddHO2补足至500ul；

③加400ul酚/氯仿抽提1次，吸出上清；

④加1/10V的3M NaAc，2V预冷的乙醇，在-20度沉淀60min；

⑤离心收集沉淀，200μl 70％乙醇洗涤后吹干，溶解于20μl TE(pH8.0)。

⑥电泳定量，50-100ng/tube分装保存于终浓度为50％的灭菌甘油中，备用。

1.1.3 E.coli DH10B电转感受态的制备

从-70℃冰箱中取菌种E.coli DH10B划线于新鲜的LB平板上，培养过夜，挑取直径约2mm菌落接入没有添加Mg²⁺的SOB试管，37℃培养至OD600到达1.0后，以1/100的接种量接入装有100ml SOB培养基的0.5L摇瓶，18℃，220rpm培养至OD600到达0.7～0.8之间；将摇瓶置于冰浴中，冷却10min之后，4℃4000rpm离心5min收集菌体沉淀；等体积的灭菌超纯水重悬、洗涤菌体后，4℃4000rpm离心5min收集菌体沉淀；重复洗涤一次；100ml10％甘油重悬菌体，4℃4000rpm离心5min收集菌体沉淀；重复洗涤一次；小心弃上清，倒置离心瓶于灭菌吸水纸上沥干约1min。每1000ml培养物用2ml 10％甘油小心重悬，每管100μl分装于离心管后迅速放入-70℃冰箱保存备用。

1.2含β-1，4葡聚糖内切酶基因阳性克隆子的筛选

将BAC文库克隆子转接到含有1.5％羧甲基纤维素钠、30mg/L氯霉素的LB平板，37℃培养24h，用0.25％刚果红水溶液染色30min后再用1M NaCl水溶液脱色10min，挑取有透明水解圈的菌落，即是含β-1，4葡聚糖内切酶基因的阳性克隆，记为RSB8-75。

1.3含β-1，4葡聚糖内切酶基因阳性克隆子的亚克隆。

因阳性克隆子RSB8-75的插入片段达60kb，不便于测序分析，故将该克隆子进行亚克隆。将该克隆子中的质粒pRSB8-75用碱裂解法大量提取后用限制性内切酶BamHI部分酶切，酶切后的DNA条带通过电泳(TAE缓冲液)进行纯化，采用axygenbiosciences(China)胶回收试剂盒进行回收，回收的DNA溶于10mmol/L的Tris·Cl(pH8.0)中，与用质粒pCUGIBACI制备的脱磷载体连接后，转化导入制备的E.coli DH10B感受态细胞，通过蓝白斑筛选挑选阳性克隆构建亚克隆文库。

限制性内切酶BamHI酶切质粒体系如下：

质粒DNA：5μg

10×bufferK：50μl

BamHI：15ul

双蒸水补齐体系至500μl，30℃水浴3h。

酶切产物进行0.75％的琼脂糖凝胶电泳切胶回收5kb～10kb目的片段。

1.4含β-1，4葡聚糖内切酶基因亚克隆子的筛选

将亚克隆文库克隆子转接到含有1.5％羧甲基纤维素钠、100mg/L氨苄青霉素的LB平板，37℃培养24h，用0.25％刚果红水溶液染色30min后再用1M NaCl水溶液脱色10min，挑取有透明水解圈的菌落，即是含β-1，4葡聚糖内切酶基因的阳性克隆，记为CMC3-18。1.5基因核苷酸序列测定

北京华大基因技术有限公司对阳性克隆子所含质粒CMC3-18进行序列测定，β-1，4葡聚糖内切酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，根据β-1，4葡聚糖内切酶基因核苷酸序列所推到的443个氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

2.β-1，4葡聚糖内切酶基因在E.coli BL21(pET-29a(+))中的高效表达

2.1β-1，4葡聚糖内切酶基因的PCR扩增

以正向引物：5’-CATATGGCAAGTCCAACCGTGACGAA-3’和反向引物：

5’-CTCGAGTTTCTGATACCCCATTCACC-3’为引物，用PCR从克隆子CMC3-18中扩增出β-1，4葡聚糖内切酶基因片段。

扩增体系：

Primer star酶(5U/μl)         0.5μl

5×PCR Buffer II(Mg²⁺Plus)    10μl

dNTP Mixture(各2.5mM)         5μl

模板DNA                       10ng

引物1(20μM)                  1μl

引物2(20μM)                  1μl

灭菌蒸馏水                    至50μl

PCR扩增程序：

a.98℃变性10sec，55℃退火10sec，72℃延伸1.5min，进行30个循环；

b.72℃延伸10min；

c.15℃冷却10min。

2.2PCR产物用NdeI和XhoI双酶切。

酶切体系：

Nde I                        1μl

Xho I                        1μl

DNA                          ≤1μg

灭菌的蒸馏水                加至20μl

在37℃水浴中，反应3h以上。

酶切产物进行0.75％的琼脂糖凝胶电泳切胶回收。

2.3pET-29a(+)用NdeI和XhoI双酶切(参考2.2)。

2.4转化和表达

2.2中的回收片段和2.3中酶切好的pET-29a(+)进行酶连。酶连好的含β-1，4葡聚糖内切酶基因的pET-29a(+)重组质粒转化到表达宿主菌E.coli BL21(DE3)获得重组微生物E.coli BL21(DE3)。涂布含有1.5％羧甲基纤维素钠、50mg/L卡那霉素和24mg/L IPTG的平板，经染色脱色后(方法同1.2)，挑取有透明水解圈的阳性转化子，经测序验证基因序列无误。

2.5验证阳性转化子表达的酶对羧甲基纤维素钠的水解功能

阳性克隆子在LB培养基中37℃培养至OD₆₀₀0.5-0.6之间，加IPTG至浓度0.2mM，18℃继续培养24h。收集菌体用柠檬酸缓冲液(pH4.8)重悬后，用超声处理破碎菌体细胞，20000g离心15min，所得上清即为粗酶液。取2ug粗酶加至1ml含有0.5％羧甲基纤维素钠的柠檬酸缓冲液中，于50℃反应15min后，用DNS法测产物葡萄糖的生成量。酶活单位定义为每分钟产生1umol葡萄糖即为一个单位，测得粗酶的比活力为85.19μmol min^-1mg^-1，即1mg该粗酶以0.5％羧甲基纤维素钠为底物在最适条件下反应每分钟可获得85.19umol葡萄糖。后将该酶纯化后测得该酶在以羧甲基纤维素钠为底物时的Km值和Vmax分别是19.92mg/ml和1941μmol min^-1mg^-1，即1mg该酶在以羧甲基纤维素钠为底物时的最大反应速度为每分钟产生1941umol葡萄糖。该阳性克隆子能高效表达β-1，4葡聚糖内切酶(该酶纯化后的比酶活力约为粗酶的3倍，即活性β-1，4葡聚糖内切酶蛋白的含量约占破碎液上清中总蛋白含量的30％)，生产的酶制剂可用于食品、医药、饲料、纺织、洗涤和能源等工业。

序列表

<110>南京农业大学

<120>纤维素水解酶β-1，4葡聚糖内切酶基因

<130>说明书

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1332

<212>DNA

<213>红壤微生物功能基因组BAC文库

<220>

<221>β-1，4葡聚糖内切酶基因

<222>(1)..(1332)

<223>

<400>1

atggcaagtc caaccgtgac gaattatctg gggacgggtg taaacccgca tctctatctc    60

acgctttccg ataaccaacc caactgggga tcctacacca ttgactatca aaaatcggga    120

aacattcctt acgatacgaa gaatcccaca aaaaaacaat ggagcacgtg gaatgtccat    180

gatcaaaata atggcgaagg caactattac ggcacgatta cgctagaagc cacctccaca    240

ggtgcaacct gggttaaata cgtgggtggt gaaggttatt atctagaagg tctgcatttc    300

acctataaaa ataatacgta tcaattaacc gtcgataaaa tcgttggcgc acctagtggc    360

gaatcaccct tccccaatac accgctggct acaccggcag tttatgaaaa cacgaataca    420

cccgttgtac tgcgtgtcga aggaaatcgc attgtgaatg atcgtggaaa tacggttatt    480

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atcgacaaaa atgtttggtt gcatggcaat tctacgtatg ctgggcatca ggaactctat    900

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tacaacttaa gctttgtcaa tagctccttc catgtaacag gtgaaaacat tgcttatggc    102

tcgcatcctt ataaccgcac cagtttcggt aataattttg atggcgtatt gggtgtgtat    1080

ccgctcatat tcacagagtt tggcaccaac caattgagca actttccgaa tggatatcaa    1140

caatattatc aagctgtgat tgatttcatt gtcgcccatg atgtcagcta cacgggcttt    1200

gcctggtggg tagaagcgag caaccctgct tttcccgcat tgatcaaaga ttgggatggt    1260

acacctcaat acggtggaca aatgatccat gacgatctga aagcaaatcc ggtgaatggg    1320

gtatcagaat ag                                                        1332

<210>2

<211>443

<212>PRT

<213>红壤微生物功能基因组BAC文库

<220>

<221>β-1，4葡聚糖内切酶

<222>(1)..(443)

<223>

<400>2

Met Ala Ser Pro Thr Val Thr Asn Tyr Leu Gly Thr Gly Val Asn Pro

1               5                       10                  15

His Leu Tyr Leu Thr Leu Ser Asp Asn Gln Pro Asn Trp Gly Ser Tyr

            20                      25                  30

Thr Ile Asp Tyr Gln Lys Ser Gly Asn Ile Pro Tyr Asp Thr Lys Asn

        35                      40                  45

Pro Thr Lys Lys Gln Trp Ser Thr Trp Asn Val His Asp Gln Asn Asn

    50                 55                   60

Gly Glu Gly Asn Tyr Tyr Gly Thr Ile Thr Leu Glu Ala Thr Ser Thr

65                  70                  75                  80

Gly Ala Thr Trp Val Lys Tyr Val Gly Gly Glu Gly Tyr Tyr Leu Glu

                85                  90                  95

Gly Leu His Phe Thr Tyr Lys Asn Asn Thr Tyr Gln Leu Thr Val Asp

            100                 105                 110

Lys Ile Val Gly Ala Pro Ser Gly Glu Ser Pro Phe Pro Asn Thr Pro

        115                 120                 125

Leu Ala Thr Pro Ala Val Tyr Glu Asn Thr Asn Thr Pro Val Val Leu

    130                 135                 140

Arg Val Glu Gly Asn Arg Ile Val Asn Asp Arg Gly Asn Thr Val Ile

145                 150                 155                 160

Leu Lys Gly Met Val Arg Pro Ser Leu Glu Trp Asn Pro Gln Gly Glu

                165                 170                 175

Tyr Leu Ser Glu Lys Asp Ile Leu Asn Met Val Lys Trp Gly Ile Asn

            180                 185                 190

Thr Ile Arg Leu Asp Leu Asn Gln Asn Tyr Trp Phe Gln Ser Gly Pro

        195                 200                 205

Val Asp Glu Met Gly Ser Tyr Lys Gln Ile Ile Asn Ala Ile Val Tyr

    210                 215                 220

His Ala Ile Glu His Asp Met Ala Ile Ile Leu Asp Leu His Trp Thr

225                 230                 235                 240

Glu Asn Gly His Gln Ser Asn Met Ala Asn Lys Asp Ser Ile Arg Phe

                245                 250                 255

Trp Lys Glu Val Ala Ala Asp Tyr Lys Asp Phe Gly Thr Val Ile Phe

            260                 265                 270

Glu Leu Phe Asn Glu Pro Val Asn Ile Asp Lys Asn Val Trp Leu His

        275                 280                 285

Gly Asn Ser Thr Tyr Ala Gly His Gln Glu Leu Tyr Asp Ala Val Arg

    290                 295                 300

Ser Thr Gly Ala Gln Asn Ile Cys Leu Val Asn Gly Ile Asp Trp Gly

305                 310                 315                 320

Tyr Asn Leu Ser Phe Val Asn Ser Ser Phe His Val Thr Gly Glu Asn

                325                 330                 335

Ile Ala Tyr Gly Ser His Pro Tyr Asn Arg Thr Ser Phe Gly Asn Asn

            340                 345                 350

Phe Asp Gly Val Leu Gly Val Tyr Pro Leu Ile Phe Thr Glu Phe Gly

        355                 360                 365

Thr Asn Gln Leu Ser Asn Phe Pro Asn Gly Tyr Gln Gln Tyr Tyr Gln

    370                 375                 380

Ala Val Ile Asp Phe Ile Val Ala His Asp Val Ser Tyr Thr Gly Phe

385                 390                 395                 400

Ala Trp Trp Val Glu Ala Ser Asn Pro Ala Phe Pro Ala Leu Ile Lys

                405                 410                 415

Asp Trp Asp Gly Thr Pro Gln Tyr Gly Gly Gln Met Ile His Asp Asp

            420                 425                 430

Leu Lys Ala Asn Pro Val Asn Gly Val Ser Glu

        435                 440

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>β-1，4葡聚糖内切酶基因的PCR扩增正向引物

<222>(1)..(26)

<223>

<400>3

catatggcaa gtccaaccgt gacgaa                     26

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>β-1，4葡聚糖内切酶基因的PCR扩增反向引物

<222>(1)..(26)

<223>

<400>4

ctcgagtttc tgatacccca ttcacc                      26