红壤宏基因组BAC文库构建及β-1,4-葡聚糖内切酶新基因的克隆和表达

摘要

红壤是我国南方典型的土壤资源类型,因其所处的特殊地理环境和气候特征,红壤具有pH值较低、水热条件充足和生物多样性程度高等特点,其中可能蕴含着新的、有应用价值的基因资源.土壤样品的宏基因组学(metagenomics)是对土壤样品中微生物群体基因组进行的一种分析,这种方法可以超越培养手段而直接从土壤中获得新的基因资源,因此在众多用于获得未培养微生物的生理和遗传特性的方法中,逐渐显示出强大的优势。通过构建红壤的宏基因组文库,对红壤微生物群落结构进行研究,能揭示出红壤微生物群落结构与红壤理化性质之间的内在联系,从而为改善红壤当前的生态环境提供理论依据,并获得新的、有价值的基因资源。
　　 本文以两种不同的土壤类型江西红壤和南京沙质粘土为研究材料,通过对土壤微生物菌体回收的各影响因素的比较分析,确定了土壤中微生物菌体的提取纯化方法；并利用从红壤中分离提取的菌体细胞为材料,将其包埋裂解获得了大片段总DNA,以BAC为载体构建了大片段宏基因组文库；对文库进行基于功能的筛选,获得一β-1,4葡聚糖内切酶基因,并实现了该基因在大肠杆菌中的过量表达,且对其酶学性质进行了分析研究,确定其为纤维素水解酶家族的新成员。
　　 通过对土壤中微生物菌体回收的各影响因素诸如分散方式、离心力、分散剂、混合酶液消化处理、蔗糖和Nycodenz密度梯度离心的比较分析,确定了从土壤中提取纯化微生物菌体的方法。以焦磷酸钠作为分散剂匀浆作为分散方式分散土壤颗粒后,用蔗糖密度梯度离心代替传统的差速离心来提取微生物菌体,经过一次离心可以获得70％以上的菌体细胞。再用0.8％氯化钠溶液重悬菌体进行Nycodenz密度梯度离心,获得了纯化的菌体细胞。与传统的以0.8％氯化钠作为分散剂分散土壤后直接进行Nycodenz离心提取菌体的方法相比,该提取流程不但有效地去除了菌体提取物中的杂质,还将菌体提取率从不到l0％提高到了30％以上。利用核糖体DNA间区分析(RISA)技术分析所提取细菌菌体的群落结构,发现其与原始土壤里的细菌群落结构组成类似,说明该菌体提取纯化流程对土壤微生物群落结构组成没有造成较大的改变。
　　 将从红壤中提取的菌体细胞反复洗涤后,用低熔点琼脂糖将菌体包埋起来进行裂解,获得了大小超过400 kb的大片段总DNA。利用限制性内切酶Sau3AI部分酶切总DNA后,经脉冲场凝胶电泳分离和电洗脱收集50～100 kb的DNA片段,与用质粒pCUGIBACI经限制性内切酶BamHI处理并经去磷酸化制备的pIndigoBac536载体连接后导入E.coli DH10B中,构建了土壤宏基因组BAC文库。该文库含3,024个阳性克隆子,外源插入片段大小在25～165 kb之间,70％的克隆子所含外源插入片段在50～100 kb之间,平均插入片段大小约为75 kb。该文库库容约为200 Mb,绝大部分克隆子中所携带的外源DNA片段中富含GC。随机挑选10个克隆子进行BAC末端测序的结果表明,9个克隆子中所包含的外源片段目前为止不存在于现有的基因组数据库中,应为新序列,其对应的氨基酸序列与已知的功能蛋白的同源性也很低。
　　 对文库进行基于活性的筛选,发现一克隆子RSB-1227能够在羧甲基纤维素钠-刚果红平板上产生较大水解圈。将该克隆子中的质粒pRSB-1227提取出来,经限制性内切酶NotⅠ酶切验证无误并确定外源片段大小在60 kb左右后。重新将该质粒用电转化导入E.coli DH10B中,所得阳性克隆子皆具备该水解活性,确定了该纤维素水解酶基因确实由质粒pRSB-1227携带。对克隆子RSB-1227进行亚克隆并测序的结果显示,其中含有能够编码β-1,4葡聚糖内切酶(纤维素降解过程中的关键酶之一)的基因。该基因序列与已发现同类基因没有同源性,其编码的氨基酸序列同源性亦低于40％,属于糖苷水解酶第五家族,将该基因命名为cel5G。
　　 将基因cel5G扩增出来,与载体pET29a(+)连接后构建表达载体pET29a-cel5G,并导入宿主菌E.coli BL21中,构建表达菌株。用IPTG诱导表达该基因,获得了大量的重组酶Cel5G,经SDS-PAGE验证其分子量约为50kDa,与用氨基酸序列预测的分子量49.8 kDa一致。经热处理、硫酸铵沉淀及分子筛纯化该蛋白后,用于其酶学性质及水解特性研究。Cel5G最适反应pH值为4.8,最适反应温度为50℃,其pH稳定性和热稳定性良好,在高盐条件下稳定且可以显示较高的酶活力,并对蛋白酶有较强的耐受性。该酶可以水解多种以β-1,4-,β-1,3/β-1,4-或β-1,3/β-1,6-糖苷键连接的多聚物,也可以水解无定形纤维素、滤纸和微晶纤维素,以CMC-Na为底物时的Km值和Vmax分别为19.92mg/ml和1941μmol min-1 mg-1,综合β-1,4葡聚糖内切酶Cel5G的这些特征,确定其是一个新的纤维素水解酶,且具有较大的工业应用潜质。