一种用于植物激素前处理的分散液液微萃取法

摘要

本发明提供一种用于植物激素前处理的分散液液微萃取法，即将DLLME用于植物激素前处理的方法，处理步骤包括：加样、混合萃取剂和分散剂、振荡形成乳浊体系、离心分离、吸取有机相直接进行HPLC分析。本发明的方法富集能力高，操作简单，有机溶剂用量少和萃取时间短，集采样、萃取和浓缩于一体的同时，避免了固相微萃取中可能存在的交叉污染的问题，是一种简单、快速、成本低、高效且环境友好的样品前处理新技术，在痕量分析领域具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于分析化学领域，更具体涉及一种用于植物激素前处理的分散液液微萃取方法。

背景技术

植物激素是指一些在植物体内合成，对生长发育能产生显著作用的微量有机物。生长素(Auxin)是最早发现的一种植物激素，能调控植物体的伸长生长、顶端优势、果实发育等多种生理过程。建立植物生长素的灵敏、快速、准确的分析方法，对于阐明生长素在植物生长过程中的作用和功能是非常重要的。然而，植物体内激素含量低(通常在0.1-50ng/g鲜重范围内)，并存在许多植物激素类似物和次级代谢物，给植物激素的鉴别和定量带来困难。因此，寻找有效、快速的前处理方法一直是植物激素检测的瓶颈和研究热点。

植物激素检测的前处理，目前多采用传统的液液萃取(liquid-liquid extraction，LLE)法和固相萃取(solid-phase extraction，SPE)法。其中，LLE法操作繁琐、耗时、使用大量高毒有机溶剂，成本高，回收率较低，且不易实现自动化。SPE技术以高效、可靠以及溶剂用量少等优势逐渐取代了经典的LLE技术，成为植物激素分析的主流前处理方法。然而，SPE仍存在商品柱价格昂贵，过柱时间长等不足。2007年，固相微萃取法(solid-phase microextraction，SPME)首次被用于植物激素的预处理，此方法集采样、萃取、浓缩于一体，具有简单、快速、环境友好等特点，但SPME存在萃取头昂贵，使用寿命短，易交叉污染等局限性。因此，发展高效、稳定、低成本且环境友好的样品前处理新技术仍是亟待解决的问题。

分散液液微萃取(Dispersive Liquid-liquid Microextraction，DLLME)于2006年首次提出，是一种新型的样品预处理技术。DLLME结合了LLE和SPME的特点，所需有机溶剂少，操作单快速，集萃取、纯化、浓缩于一体，回收率高，富集效果好。目前，DLLME已能与多种仪器如气相色谱、气相色谱-质谱、液相色谱、液相色谱-质谱、原子吸收光谱等联用，成功用于水样、土壤、尿样和水果中不同物质的测定，分析对象涉及农药残留、临床药物、痕量金属等。将DLLME用于植物激素的前处理，具有富集能力高，操作简单，有机溶剂用量少和萃取时间短等优点，是一种简单可靠、环境友好的样品预处理技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物激素的前处理新方法，用于净化和富集样品，该方法富集能力高，操作简单，有机溶剂用量少和萃取时间短。

本发明用于植物激素前处理的分散液液微萃取方法，处理步骤包括：

1)首先在10mL带塞的尖底离心管中，加入5.0mL待测样品溶液和0.375g NaCl，所述待测样品溶液的pH为4.0；

2)预先将50.0μL萃取剂三氯甲烷和1.0mL分散剂丙酮混匀；

3)用2.0mL注射器吸取步骤(2)的混合液，迅速注射入步骤(1)装有待测样品溶液和0.375g NaCl的尖底离心管中，轻轻振荡，形成乳浊体系；

4)将离心试管以4500r/min离心3min；

5)用微量液相进样针吸取离心管底部的有机相直接进行HPLC分析。

本发明的显著优点是：

本方法能够有效地对植物样品进行净化、浓缩，减少植物基质对检测信号的干扰；

本方法富集效果好，处理后的样品用高效液相色谱-荧光检测法分离测定，待测物质的检测限降低了两个数量级；

此方法未经过柱，减少了样品中待测物的损失；

植物样品中的IAA不稳定，易分解，本方法操作时间短，有利于减少IAA的分解；

此方法消耗有机溶剂少，是一种环境友好的前处理技术；

该方法装置简单，成本低；

该方法可与气相色谱、液相色谱和原子吸收分光光谱等仪器联用，适用范围广；

该方法无交叉污染问题。

附图说明

图1是结合本发明的DLLME装置的流程图。其中，1、2.0mL注射器，2、具塞尖形离心试管，3、微量液相进样针；(A)将萃取剂和分散剂混合后注入样品溶液；(B)萃取剂迅速被分散成细小液滴，形成乳浊体系；(C)经离心分离，有机相沉积于具塞尖形离心管底部；(D)用微量进样针吸取离心管底部有机相进行仪器分析。

具体实施方式

本发明采用的DLLME(分散液液微萃取)装置包括：具塞尖形离心试管、2.0mL注射器和微量液相进样针。

处理步骤包括：

1)首先在10mL带塞的尖底离心管中，加入5.0mL待测样品溶液和0.375g NaCl，所述待测样品溶液的pH为4.0；

2)预先将50.0μL萃取剂三氯甲烷和1.0mL分散剂丙酮混匀；

3)用2.0mL注射器吸取步骤(2)的混合液，迅速注射入步骤(1)装有待测样品溶液和0.375g NaCl的尖底离心管中，轻轻振荡，形成乳浊体系；振荡时间为0.1-1min，平衡时间极短是该新型前处理方法的显著优点。

4)将离心试管以4500r/min离心3min；

5)用微量液相进样针吸取离心管底部的有机相直接进行HPLC分析。采用微量液相进样针吸取离心管底部的有机相，便于计算吸取有机相的体积。

尖底离心管为具塞尖底离心试管；具塞可避免振荡和离心过程中液体损失，尖底结构便于吸取底部液体。

待测样品溶液制备为：所述待测样品溶液制备为：准确称取待测植物鲜样0.5g，用液氮快速研磨成粉末，用3mL含有1mmol/L抗氧化剂2.6-二叔丁基对甲酚BHT的体积浓度为80％甲醇水溶液在4℃浸提过夜；低温离心，收集上清液，残渣用1mL含有1mmol/L抗氧化剂2.6-二叔丁基对甲酚BHT的体积浓度为80％再浸提一小时，合并两次上清液，稀释5倍后，得到待测样品溶液。

实施例

利用本发明测定小球藻中的吲哚乙酸(IAA)含量。

准确称取该待测植物鲜样0.5g，用液氮快速研磨成粉末，用3mL含有1mmol/L抗氧化剂2.6-二叔丁基对甲酚BHT的体积浓度为80％甲醇水溶液在4℃浸提过夜；低温离心，收集上清液，残渣用1mL含有1mmol/L抗氧化剂2.6-二叔丁基对甲酚BHT的体积浓度为80％再浸提一小时，合并两次上清液，稀释5倍后，得到待测样品溶液。

在10mL带塞的尖底离心试管中，加入5.0mL样品溶液(pH 4.0)和0.375g NaCl，将50.0μL氯仿和1.0mL丙酮混匀，用注射器迅速将混合液注入样品溶液中，轻轻地振荡0.1-1min，形成乳浊液体系。以4500r/min离心3 min，用微量液相进样针吸取离心管底部有机相直接进样分析。

色谱条件：以乙腈/水为流动相(50∶50，v/v％)，采用C₁₈色谱柱(5μm，150mm×4.6mm，Agilent)为分离通道，设置流速1.0mL/min，柱温35℃，进样量5μL，荧光波长Ex/Em 230/360nm。

本发明中DLLME用于植物生长素的预处理，得到了较好的净化和富集。检测限与未萃取富集前相比，降低了两个数量级。该方法操作简单，稳定性好，重现性高，成功用于测定小球藻中的IAA含量。日间精密度的RSDs(n＝7)分别为0.17-0.94％(保留时间)，2.52-5.42％(峰面积)；日内精密度的RSDs(n＝5)均小于0.86％(保留时间)和5.63％(峰面积)。测得小球藻中IAA含量为37.0ng/g FW(鲜重)。进行不同浓度的加标回收率实验，回收率介于94.7-116.0％，RSD小于1.2％。本方法具有较好的发展前景，可进一步用于其他植物激素的前处理。