弗氏柠檬酸杆菌在微生物发电中的应用及发电方法

摘要

本发明公开了弗氏柠檬酸杆菌在微生物发电中的应用和发电方法，是以弗氏柠檬酸杆菌作为微生物燃料电池的阳极催化剂应用于微生物发电，发电方法包括制备弗氏柠檬酸杆菌作为微生物燃料电池接种物；制备阴极液和含燃料的阳极液；往微生物燃料电池阳极室中加入微生物燃料电池接种物，静置培养后进行产电检测。本发明为弗氏柠檬酸杆菌开拓了新的应用领域，为微生物燃料电池提供了一种新的适应性强的产电微生物。弗氏柠檬酸杆菌LY-3易于培养，能利用多种有机物产电，产电电压大。

说明书

技术领域

本发明属于环境与新能源技术领域，具体地说，涉及弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)在微生物发电方面的应用及其发电方法。

背景技术

近年来，面对能源短缺和环境污染的双重危机，微生物燃料电池(MicrobialFuel Cell，MFC)以其独特的性质，显示出极大的研究和应用价值。微生物燃料电池是一种利用微生物作为催化剂，将燃料中的化学能直接转化为电能的装置。早在1911年，英国植物学家Potter就发现微生物可以产生电流。但随后，有关微生物燃料电池的研究一直进展缓慢，直到20世纪80年代，氧化还原介体的广泛应用使得MFC的输出功率有了较大提高，由此推动了MFC的发展。但是，氧化还原介体价格昂贵、部分有毒，制约了其进一步发展。随后，研究人员相继发现某些微生物能在无介体的条件下直接将体内产生的电子传递到电极。至此，MFC的研究获得了突破性进展。目前，MFC研究的主要内容是无介体MFC产电性能的改善，及其在污水处理、产氢、生物传感、生物修复等方面的应用。

产电菌是MFC产电的核心要素，是MFC研究的重要内容。目前，分离的产电微生物主要是变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)的细菌，多为兼性厌氧菌，具有无氧呼吸和发酵等代谢方式，可氧化糖类、有机酸等获得能量维持生长。已报道的产电微生物有沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)和人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)；铁还原红育菌(Rhodofoferaxferrireducens)；嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophilia)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和希万氏菌(Shewanella putrefactions)、S.oneidensis；硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)、金属还原地杆菌(G.metallireducens)、丙酸硫叶菌(Desulfoblbus propionicus)，丁酸梭菌(Clostridium butyricum)和拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)等。

弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)目前主要应用于临床致病菌及酶工程的相关研究，有关弗氏柠檬酸杆菌具有产电活性在国内外尚未发现有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)在微生物发电方面的应用。

为了实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)作为微生物燃料电池的阳极催化剂应用于微生物发电。

所述弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)为LY-3，保藏编号为CGMCCNo.3246。

弗氏柠檬酸杆菌菌落表面光滑、半透明、边缘整齐、表面有光泽，能以阳极为电子受体，利用葡萄糖、乙酸钠等有机物产电。

本发明菌株的16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

通过形态特征观察、生理生化测定及16S rDNA基因序列分析，本发明菌株为弗氏柠檬酸杆菌的新菌株，命名为LY-3。

本发明还提供了弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)应用于微生物发电的发电方法，包括以下步骤：

(1)制备弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)作为微生物燃料电池接种物；

(2)制备阴极液和含燃料的阳极液；

(3)往微生物燃料电池阳极室中加入微生物燃料电池接种物，连接外电路，进行产电检测。

所述步骤(1)中微生物燃料电池接种物的制备方法为：将弗氏柠檬酸杆菌接种于LB液体培养基中，30℃，100rpm培养24h，4000rpm离心4min收集菌体，得到微生物燃料电池接种物。

所述步骤(2)中的燃料为葡萄糖或乙酸钠。所述步骤(2)中的阳极液为2g/L的葡萄糖和100mM/L的PBS的混合溶液。所述步骤(2)中的阴极液为0.05M FeCN。

所述步骤(3)中微生物燃料电池接种物的量为0.2g/mL阳极液。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明为弗氏柠檬酸杆菌开拓了新的应用领域，为微生物燃料电池提供了一种新的适应性强的产电微生物。弗氏柠檬酸杆菌LY-3易于培养，能利用多种有机物产电，产电电压大。

本发明菌株弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii LY-3已于2009年8月21日保藏于国家知识产权局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.3246。

附图说明

图1为本发明菌株Citrobacter freundii LY-3的16S rDNA系统发育树；

图2为本发明菌株Citrobacter freundii LY-3菌液的CV扫描图；

图3为本发明菌株Citrobacter freundii LY-3利用葡萄糖和乙酸钠为燃料产生的电压随时间的变化曲线图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步阐明本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。

实施例1：本发明菌株Citrobacter freundiiLY-3的筛选

1.菌株分离

在华南农业大学内(广州)干涸的湖底表面下深10cm处采集泥样，快速转移到已达到厌氧条件的厌氧操作箱中，取样品少量加入试管中，10ml无菌水稀释，振荡混匀。取样品稀释液1ml注射到10ml IRM液体培养基中，30℃富集培养三代。然后，在LB固体培养基上平板划线，30℃厌氧培养3d，观察菌落特征，分别挑取菌落形态不同的菌划线分离，培养3代得到纯菌株后保存，待电化学考察。

其中，IRM培养基的组分为：NaHCO₃ 2.5g/L，KCl 0.1g/L，NH₄Cl 1.5g/L，NaH₂PO₄0.6g/L，NaAc 20mM，柠檬酸铁20mM，酵母提取物0.5g/L。

LB培养基的组分为：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，固体培养基上添加2％的琼脂。

2.产电菌的筛选

对分离得到的纯菌株的菌液进行循环伏安(CV)扫描来确定所测菌株是否具有电化学活性。采用电化学工作站的三电极(石墨工作电极，铂对电极，饱和甘汞电极)法对10ml菌液进行CV扫描，以100mV/s的速率在-0.8～0.8V之间扫描，10ml培养基做对照(CK)，筛选得到一株具有电化学活性的菌株，即为LY-3，扫描结果如图1所示，LY-3菌株的CV扫描出现了还原峰，且氧化还原不可逆，说明菌株LY-3具有电活性。

实施例2：本发明菌株Citrobacter freundiiLY-3的鉴定

通过形态特征观察、生理生化测定及16S rDNA基因序列分析对实施例1得到的LY-3菌株进行鉴定。

1.形态特征观察

LY-3菌株菌落表面光滑、半透明、边缘整齐、表面有光泽。

2.生理生化测定

菌株LY-3与《常见细菌系统鉴定手册》中柠檬酸杆菌属菌种的生理生化性质对照如表1所示。

表1菌株LY-3与弗氏柠檬酸杆菌的生理生化性质对照

注：+：阳性；-：阴性；ND：未测；d：不同

3.16S rDNA系统进化分析

用细菌DNA提取试剂盒提取LY-3的全基因，然后以提取的基因为模板，以通用引物63f：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1387r：5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’进行PCR扩增。

PCR反应体系为：DNA模板1μL，10×PCR缓冲液2μL，上、下游引物各1μL，Taq DNA聚合酶1μL，10×dNTP 2μL，补水至20μL。

PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃40s、42℃1min、72℃1min，30个循环，最后于72℃延伸10min，4℃保存。

扩增产物进行10g/L琼脂糖凝胶电泳分析，纯化和回收PCR产物，送生物公司进行序列测定，LY-3的16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示。将获得的序列提交NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)进行Megablast，获取同源性高的相关序列，用ClustalX软件进行比对，Mega软件进行系统发育分析，采用邻接法构建系统发育树。图2是根据16S rDNA序列所作的系统发育树。

扩增得到1.6kbp的基因序列，在GenBank核酸序列数据库中进行同源序列搜索，LY-3与Citrobacter freundii(AB210978)的同源性为99％，LY-3为弗氏柠檬酸杆菌的新菌株，命名为Citrobacter freundiiLY-3，GenBank接受号为GQ465944。

实施例3：本发明菌株Citrobacter freundii LY-3以葡萄糖为燃料的产电考察

本实施例按照现有技术和方法来构建利用LY-3发电的微生物燃料电池，微生物燃料电池采用两室，包括阳极室和阴极室、交换膜及外电路。电极材料为碳毡，连接外阻1000Ω。

MFC的产电原理为：有机物作为燃料在厌氧阳极室中被弗氏柠檬酸杆菌氧化，产生电子与质子，其中，电子被弗氏柠檬酸杆菌捕获并传递给电池阳极，电子通过外电路到达阴极，从而形成回路产生电流，而质子通过交换膜到达阴极，与氧反应生成水。

本实施例的产电考察步骤为：

(1)将LY-3接种于LB液体培养基中，30℃，100rpm培养24h，4000rpm离心4min收集菌体，作为微生物燃料电池接种物；

(2)阳极室加入阳极反应液为2g/L的葡萄糖和100mM/L的PBS的混合溶液，阴极室加入阴极反应液为0.05M FeCN；其中PBS的配方为：KCl 0.26g/L，NH₄Cl 0.62g/L，NaH₂PO₄ 4.9g/L，Na₂HPO₄ 9.15g/L。

(3)往阳极室中接种LY-3菌株(接种量为0.2g/mL阳极液)，30℃静置培养。

(4)将阳极、阴极通过1000Ω外阻连接，数据采集卡每1s记录一次电压，输出电压结果如图3所示。

由图3可知，LY-3可应用到微生物燃料电池中产电，以葡萄糖为燃料的微生物燃料电池最大电压达到0.52V。

实施例4：本发明菌株Citrobacter freundii LY-3以乙酸钠为燃料的产电考察

实验方法和实验步骤同实施例3，仅将步骤(2)中阳极反应液改为2g/L的乙酸钠和100mM/L的PBS的混合溶液。输出电压结果如图3所示。

由图3可知，LY-3可应用到微生物燃料电池中产电，以乙酸钠为燃料的微生物燃料电池最大电压为0.39V。

上述详细说明是针对本发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。

序列表

<110>中国科学院广州能源研究所

<120>弗氏柠檬酸杆菌在微生物发电中的应用及发电方法

<160>1

<170>Patent In version 3.1

<210>1

<211>1419bp

<212>rDNA

<213>Citrobacter freundii

<400>1

catgcagtcg aacggtagca cagagagctt gctctcgggt gacgagtggc  50

ggacgggtga gtaatgtctg ggaaactgcc cgatggaggg ggataactac 100

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