一种快速提取鱼类DNA进行聚合酶链式反应的方法

摘要

一种涉及到鱼类DNA制备的一种快速提取鱼类DNA进行聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)的方法，它是将酒精保存的鱼类鳍条加入氢氧化钠、Tris-HCl、β-巯基乙醇、聚乙烯吡咯烷酮，并经高速离心后于30分钟内即可获得鱼类DNA用以PCR扩增。本发明成本低、价格廉，其稳定性、快速性、准确性优于原提取鱼类DNA的方法。它不仅能将DNA即时用于PCR扩增，而且还可长期冷冻保存备用。

说明书

技术领域

本发明涉及到DNA的制备，特别是涉及到鱼类DNA的制备。

背景技术

提取鱼类DNA进行聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)是鱼类分子生物学研究的一种基础手段，近年来研究人员发明了多种用蛋白酶K提取鱼类DNA的方法，用这种方法提取鱼类DNA的时间一般需要4小时以上，提取的时间较长，增加了大规模PCR扩增的难度，降低了大规模扩增遗传图谱的建立、种质资源的鉴定、遗传进化分析等的效率。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术的不足，提供一种快速提取鱼类DNA进行PCR扩增的方法，它是一种在20-30分钟提取鱼类DNA进行PCR扩增的方法。

本发明需要的主要材料包括有：酒精保存的鱼类的鳍条、氢氧化钠、Tris-HCl、β-巯基乙醇、聚乙烯吡咯烷酮。

本发明提取鱼类DNA用以PCR扩展保存的方法如下：

(1)将0.05-0.15g酒精保存的鱼鳍条放入1.5ml离心管中，加入200-400微升0.3-0.6mol/L氢氧化钠溶液、2-4微升β-巯基乙醇，1-4微克聚乙烯吡咯烷酮，然后将离心管在65-85℃水中水浴10-15分钟；

(2)再加入200-400微升0.3-0.6mo1/LTris-HCl，摇晃2分钟，然后在高速离心泵上离心10-15分钟；

(3)将离心后的离心管中的上清液取200微升，转至新的离心管中，用以进行PCR扩增；

(4)若要长期保存鱼类DNA，可将上述装有200微升上清液的离心管中加入200微升95％酒精、10-24微克的醋酸钠，摇晃离心管让其混匀，然后在-20℃环境中放置20分钟；

(5)将在-20℃环境中放置20分钟后的离心管，在高速离心泵离心15分钟，将离心管倒置于滤纸上去掉上清液；

(6)再将去掉上清液的离心管中加入80％酒精300-600微升，放置5-10分钟后，高速离心泵离心5分钟，将离心管倒置于滤纸上去掉上清液；

(7)将去掉上清液的离心管在40-50℃下放置5-10分钟以干燥DNA；

(8)再将离心管中加入10-50微升Tris-EDTA，以溶解干燥的DNA，-20℃环境冷冻保存。

本发明的有益效果为：

1、本发明能在20-30分钟内就可以获得用于PCR扩增质量的鱼类DNA样品，比原来需要4小时以上提取鱼类DNA的方法大大的缩短了时间，提高了工作效率；

2、本发明成本低、价格廉，其稳定性、快速性、准确性优于原来提取鱼类DNA的方法；

3、本发明提取的鱼类DNA后既可以进行PCR扩增，还可以冷冻保存备用。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明。

实施例1

1、取0.1g酒精保存的白鲢鳍条放入1.5ml离心管中，加入200微升0.5摩尔氢氧化钠溶液，2微升β-巯基乙醇，2微克聚乙烯吡咯烷酮，然后将离心管在75℃水中水浴12分钟；

2、再将离心管中加入200微升0.5mol/LTris-HCl，摇晃2分钟，然后在13000rpm高速离心泵上离心10分钟；

3、再将上述离心管中取出200微升上清液，倒入另一支1.5ml离心管中进行PCR扩增；

为了保证提取的白鲢鳍条DNA质量，还要对其进行质量检测。

DNA质量检验：

用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，DNA纯度用紫外分光光度计的A260/A280位来确定。

SSR及线粒体的PCR扩增：

PCR扩增反应在扩增仪上进行，反应条件如下：94℃预变性5分钟，共32个循环；94℃变性45秒，还原45秒，72℃延伸45秒，最后72℃延伸10分钟。

SSR扩增产物通过12％的非交性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后分析。另外，线粒体DNA的扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例2

1、取0.1g酒精保存的白鲢鳍条按上述1-3步骤操作后，得到1.5ml离心管中装有200微升的上清液；

2、在上述离心管中加入200微升95％的酒精，0.1摩尔的醋酸钠溶液5微升，摇晃离心管，使其混匀，在-20℃环境中放置10分钟；

3、将离心管在12000rpm高速离心泵上离心15分钟，将离心管倒置于滤纸上去掉上清液；

4、在离心管中加入80％酒精500微升，室温下放置6分钟，12000rpm离心5分钟，倒置于滤纸上去掉上清液；

5、将离心管放置50℃的环境中干燥10分钟；

6、在离心管中加入10微升Tris-EDTA，以溶解其干燥的DNA，然后在-20℃环境中冷冻保存。