Pitman moore狂犬病病毒株对原代鸡胚成纤维细胞培养物的适应方法

摘要

本发明涉及Pitman moore狂犬病病毒株对用于生产狂犬病疫苗的原代鸡成纤维细胞的适应方法。

说明书

技术领域

本发明涉及疫苗领域，尤其是，涉及将Pitman moore狂犬病病毒株(PM株)适应于纯化的鸡胚成纤维细胞培养物以用于生产改良且高度纯化的疫苗。具体而言，该适应的PM狂犬病病毒株产生高病毒效价，并且按照每颗蛋的疫苗剂量计算能够得到较高产量且具有高度免疫原性。

背景技术

狂犬病是一种动物源性病毒疾病，可感染家养和野生动物。一旦出现该疾病症状，狂犬病对动物和人均是致死性的。然而，如果在暴露于病毒前或暴露于病毒后用狂犬病疫苗对个体进行免疫接种，并用消毒剂与抗狂犬病的抗体彻底清洗创口，该个体通常可得到良好的保护。人狂犬病疫苗由灭活或减毒的狂犬病疫苗制备，且自巴斯德时期至今已经过了成功的改良。由巴斯德研制的最初的狂犬病疫苗是基于神经组织的，且病毒通过干燥而灭活，但由于存在神经组织或髓磷脂(myelin)，该疫苗具有激活该病毒和发生过敏性反应的风险。Fuezalida等人引入了由新生小鼠脑制备的无髓磷脂疫苗(Vaccines：第四版，第37章，Plotkin，Rupprecht and Koprowski)。

随后，研制了用于狂犬病的鸭胚疫苗(DEV)。用于狂犬病的DEV由在胚胎化鸭蛋中繁殖的病毒而制备。其免疫原性比脑组织疫苗要差。因此，对于DEV而言，推荐每天接种14-23次，而且有时在严重暴露后，如此高的剂量也不能保护个体免受狂犬病侵袭。(Vaccines：第四版，第37章，第1018页，Plotkin，Rupprecht andKoprowski)。另一个与DEV相关的缺陷是它也含有髓磷脂相关蛋白，可引起副反应，因此后来被WHO禁用。因此，长久以来一直需要免疫原性较高并以低剂量且安全有效地应用的，既可用于初次免疫也可用于暴露后治疗的狂犬病毒疫苗。这些疫苗还能够大大降低接种后反应的次数和严重性。

由于组织/细胞培养疫苗的研制而满足了这种需求。与前面所说的病毒的脑培养疫苗相比，细胞培养疫苗由于不存在神经组织，因此不仅更加安全而且更加有效。为了获得较高的免疫原性和安全性，现在已经开发了几种基于细胞培养的疫苗，如纯化鸭胚疫苗(PDEV)、第一代疫苗如人二倍体细胞疫苗(Wiktor et al.，1964.J.Immunol.93：353-366)and 2^nd generation vaccines like Purified ChickEmbryo Cell Vaccine(PCECV)，Purified Vero Cell Rabies Vaccine，Rabies Vaccine Adsorbed(RVA)，and Primary Hamster Kidney CellVaccine(PHKCV)etc.(Ref：JIACM 2006；7(1)：39-46)。

上述疫苗研制成功的技术进展包括使Pitman moore狂犬病病毒株适应于连续细胞系如Vero细胞(如，纯化的Vero细胞狂犬病疫苗-Abhayrab^TM&Verorab^TM)和MRC-5人双倍体培养细胞系[如印度的人双倍体细胞疫苗(HDCV)-MIRV-HDC][Ref：JIACM 2006；7(1)：39-46]或鸭胚中原位进行适应(如，纯化的鸭胚疫苗-PEDV-Lyssavac N)。(Ref：Laboratory Techniques in Rabies；FourthEdition，Edi.by F.X.Meslin，M.M.Kaplan&H.Koprowski，WHOGeneva-1996)。

Vero和MRC-5细胞系都是连续细胞系，因此有必要检测终产品中的细胞残留DNA(Ref.欧洲药典，2004)，因为其可能具有传递潜伏病毒和其他物质的风险。而且，即使采用PM株制备疫苗，通过Vero细胞得到的产量实际上也比较低。PDEV是一种混悬疫苗，因此该疫苗无法用于皮内(ID)应用。此外，该技术获得的产量较低(每颗蛋1.8-2.2剂量)。处理时间也太长，需要88天。且市售PDEV疫苗采用防腐性硫柳汞，其可能与幼童自闭症有关系(Ref：http://www.ncirs.usyd.edu.au/facts/f-thiomersal.html)。另外，生产PDEV的过程长而繁琐，而且由于其产量低，因此不适于大规模生产。可以认为HDCV是金标准疫苗，但其太过昂贵。因此，需要提供一种改良的高免疫原性狂犬病疫苗，其能提供较高产量，而且利用基于细胞培养的技术，花费也不会那么昂贵。

US 4115195(Rudolph Barth et al.)描述了生产狂犬病疫苗的过程。其中教导了鸡胚成纤维细胞以及其他培养的细胞株均可用来利用多种病毒来制备狂犬病疫苗，如VP11株、Pasteur株、PM株病毒或者包含Flury LEP株(低代株(low egg passage))或Flury HEP株(高代株(high egg passage))病毒的均质化鸡胚物质。该专利还具体提供了利用狂犬病病毒固定株VP11、Flury HEP和Flury LEP感染鸡胚成纤维细胞的实例。然而，该文献未提及使Pitman moore株(Wistar株PM-HDCS、1503-3M)适应于原代鸭胚成纤维细胞或原代鸡胚成纤维细胞。而且，该专利发明中应用的培养基是一种在US4115195中未阐明的独特的组合培养基，其专为PM狂犬病病毒感染原代鸡胚成纤维细胞而设计。

本发明已经出人意料地发现Pitman moore株能够适应于原代鸡成纤维细胞培养物。这种适应提供了一种大量制备狂犬病疫苗的方法，其产量高且生产时间短，易于成规模。因为该疫苗不是混悬液，因此除了肌内应用(IM)，所生产的疫苗还将适合于皮内应用。

根据本发明，通过使Pitman moore适应于原代鸡成纤维细胞培养物而制备的狂犬病疫苗比基于多种其他连续细胞系的狂犬病疫苗更加有利，且更加易于成规模以进行大规模商业化疫苗生产。通过本发明所述方法生产的疫苗具有极高的产量、效力、安全性，而且当优选地利用PET TC转瓶实施该方法时，该方法比已知用于制备狂犬病疫苗的多种其他方法更加经济有效。

本发明者已经出人意料地发现，在合适的处理条件，如下文将详细描述的，利用PET TC转瓶，Pitman moore病毒可以在具有如其他文献所述的独特组合培养物的原代鸡胚成纤维细胞培养物中严重感染。这些优选实施方式提供了具有高产量、较高效价和免疫原性的疫苗，这使得该疫苗相对而言比较经济有效。

发明内容

本发明的主要目的是使Pitman moore狂犬病毒株适应于鸡胚成纤维细胞培养基以获得狂犬病疫苗。

在本发明的一种实施方式中，提供了一种利用用于抗狂犬病活性免疫的Pitman moore株来生产具免疫原性且高度纯化的鸡胚细胞疫苗^PM(下文称为PCECV^PM)的方法。

本发明的另一种实施方式是开发一种利用较简单的方法获得高产量疫苗的独特方法。

在本发明的另外一种实施方式中，提供了一种适合的培养基组合物，以获得Pitman moore株狂犬病病毒进入鸡胚成纤维细胞的高感染性。

本发明提供了一种将Pitman moore狂犬病病毒株适应于鸡胚成纤维细胞培养物的方法。首先通过一次脑内传代使原始Pitmanmoore狂犬病病毒株(Wistar株PM-HDCS，1503-3M)适应于小鼠，然后在鸭蛋中反复传代，本发明人通过连续传代进一步使其适应于鸭胚成纤维细胞，随后通过利用适合的培养基以及其他适合的培养条件在原代鸡胚成纤维细胞中进一步连续传代以获得狂犬病疫苗。

本发明的另一个方面提供了一种独特的组合培养基，以实现使得Pitman moore狂犬病病毒株较高且较严重感染地进入纯化鸡胚成纤维细胞。

本发明的另一个方面中，提供了一种利用PM狂犬病病毒株的灭活的纯化鸡胚细胞狂犬病疫苗，具有较高纯度和免疫原性。

附图说明

图1：示出了第5天时，03PM/鸭/S.Pas.07在鸭培养物中的狂犬病特异性荧光。

图2：示出了第5天时，04PM/鸡/S.Pas.09在鸡胚培养物(CEC)中的狂犬病特异性荧光。

图3：示出了第3天时，04PM/鸡/S.Pas.10在鸡胚培养物(CEC)中的狂犬病特异性荧光。

图4：示出了第3天时，04PM/鸡/S.Pas.11在鸡胚培养物(CEC)中的狂犬病特异性荧光。

图5：示出了第3天时，04PM/鸡/S.Pas.12在鸡胚培养物(CEC)中的狂犬病特异性荧光。

图6：本发明的实验疫苗与多种市售狂犬病疫苗的比较。

具体实施方式

本发明涉及在原代鸡/鸭成纤维细胞培养物中适应Pitmanmoore狂犬病病毒。所采用的蛋是SPF级鸡蛋。SPF鸡蛋和Pitmanmoore狂犬病病毒株是WHO批准用于制造用于人狂犬病疫苗的底物和病毒株。在一种优选实施方式中，利用PET TC转瓶使PM狂犬病病毒株适应于转动培养物中的鸡成纤维细胞，与其他几种技术相比，其可得到较高的产量。

首先通过一次脑内传代使原始的Pitman moore株(Wistar株PM-HDCS，1503-3M)适应于小鼠，随后通过反复传代而适应于鸭蛋中。接下来，本发明人试图开发一种使PM狂犬病病毒株适应于原代鸭胚成纤维细胞的方法，发现仅有部分细胞被感染(图1)。经过几次传代，感染性未能增加至令人满意的程度。

在例如US 4115195中已知足够高的病毒效价是有效狂犬病疫苗的一个必要条件。因此，本发明人改变了其关注点，使病毒传代在鸡胚成纤维细胞培养物中进行。在几次感染性和适应性试验后，在鸡胚细胞中获得了满意的病毒效价结果(图2至图5)。

下文将适应于鸭胚的原始“Wistar株PM-HDCS，1503-3M”称为“主种子DE42/74Pas.12.12.11.1974”，其是用于生产PDEV疫苗的主种子。根据本发明所述，该“主种子DE42/74Pas.12.12.11.1974”狂犬病疫苗最初在鸭胚细胞中然后在原代鸡胚成纤维细胞培养物中适应和繁殖，以生产用于狂犬病的细胞培养PCEC疫苗(PCECV^PM)。

最初，本发明人试图通过反复传代将“主种子DE42/74Pas.12.12.11.1974”适应于原代鸭胚成纤维细胞。但是，因为原代鸭胚成纤维细胞不是PM狂犬病病毒的“天然”宿主，因此最初的实验中本发明人不能得到任何感染，而且随后的实验中进一步优化也仅得到极少量感染。因此，对该方法进行了明显的改进，将在原代鸭胚成纤维细胞中传代改成了在适合的培养基和培养条件下在原代鸡胚成纤维细胞中传代。PM狂犬病病毒株传代入原代鸡胚成纤维细胞中是一种独特而非常规的情形，在本领域中尚未见报道，因为这些细胞不是PM狂犬病病毒株的“天然”宿主，本领域中技术人员也不能将其延伸视为常规技术。

在本发明中，将所述“主种子DE42/74Pas.12.12.11.1974”适应于原代鸭胚成纤维细胞然后如下所述通过反复传代适应于鸡胚成纤维细胞：

传代过程中获得的多株病毒按照下列通用格式进行命名：“制备年份(例如：“04”表示2004年)/Pitman moore株(PM)/在其中进行传代的底物(鸭或鸡)/连续传代次数/培养日期”。

用作主种子或工作种子的已适应Pitman moore株通过用PM病毒(DE42/74Pas.12.12.11.1974)感染原代鸭胚成纤维细胞而得到，并于33-36℃进行7次传代以使该病毒株适应于原代鸭胚成纤维细胞，从而得到“03PM/鸭/S.Pas.07；18.12.03”。对该“03PM/鸭/S.Pas.07；18.12.03”株进一步通过至少4次传代而感染进入原代鸡胚成纤维细胞中，得到主种子“04PM/鸡/S.Pas.11；04.08.04”。人们可从主种子进行1-5次传代来制备用于商业化疫苗生产的工作种子。按照上述方法制备的工作种子批号的一个实例命名为“04PM/鸡/S.Pas.12；25.12.04”。

从主种子“04PM/鸡/S.Pas.11；04.08.04”得到的病毒具有至少10^6.5TCID_50％/ml的峰效价。

在鸡胚细胞中进行连续传代时，病毒效价成对数增加，表明该病毒具有稳定的表型特征。

在每次传代时，均通过标记FITC的Ab结合物将培养物染色，并利用荧光显微镜检测其感染性。得到用于感染性和培养的最佳和可重复性条件后，如在各种药典中所描述的，最初通过荧光显微镜确认该结果，然后通过几次体外以及体内检测加以确认。

所述病毒的适应优选利用PET TC转瓶或多层TC瓶来实施。

为了进行适当的适应，采用了几种培养基及其成分的组合，下文借助实施例1进行描述。本发明进一步通过下列非限制性实施例进行阐释，所述实施例均代表实施本发明的优选模式之一。应该理解，可以在本领域熟练技术人员掌握的范围内进行若干非创造性的改进，并认为这些改进也包括在本发明的范围内。

实施例1：选择用于病毒适应和处理优化的培养基

选择下列培养基进行病毒适应和处理条件的优化。

●生产培养基1(PCM1)

●生产培养基2(PCM2)

●生产培养基(PCM)

上文提到的培养基包含以下成分：

上述培养基进一步以适当浓度补充人血清白蛋白、水解明胶、碳酸氢钠和抗生素溶液。

利用不同培养基进行实验后，比较其形成细胞单层和病毒感染程度的有效性。

取9-11天的胚胎，并用胰蛋白酶依次处理10-10-20分钟。将细胞离心除去胰蛋白酶并同样地重悬浮于PCM1、PCM2和PCM中。在不同实验中，将3种培养基中的细胞数量均调整为约1.7×10⁶个细胞/ml。所有实验中均采用1∶1200稀释的“03PM/鸭/S.Pas.07”病毒。每次实验的吸附时间均为90分钟。将已感染细胞接种于Greiner TC瓶和PET转瓶中。并将来自TC瓶/转瓶的代表性感染细胞接种在24孔TC板内。将该TC瓶和转瓶于34℃±1℃孵育5天。所述24孔板在3％CO₂环境中于34℃±1℃孵育，并在第3天时用FITC结合物染色，检测病毒感染程度，根据狂犬病特异性荧光分级为好(+)、很好(++)、极好(+++)或超好(++++)。

第4天或第5天，从每一组实验收集细胞上清液作为第一次收获物，并分别补充新鲜培养基。继续孵育后，自第一次收集的第2天、第3天或第4天，从每一组采取第二次收获物。检测第一次收获物和第二次收获物的病毒效价和无菌度。

结果发现：

●通过狂犬病特异性免疫荧光评估，在24孔板中，在PCM1和PCM2中接种的细胞表现为差至好的感染，而在PCM中接种的细胞则表现为极好至超好的感染。

●与仅接种于PCM1和PCM2相比，用PCM接种的TC瓶/转瓶表现出的效价为好。PCM1、PCM2和“PCM”中的效价值分别为10^5.6、10^5.8和10^7.7TCID_50％。

根据上述不同实验中的结果，选择PCM培养基用于在原代鸡胚成纤维细胞中进行适应，随后的疫苗制备通过不同的处理条件并进一步选择适合的TC转瓶而进一步优化，所述处理条件在本领域技术人员的掌握范围内。

用于制备主种子、工作种子和狂犬病疫苗生产的一般细胞培养步骤：

用70-90％RH将鸡蛋于35℃-37℃孵育8-11天。孵育后，透光检查鸡蛋以选择存活且健康的胚胎。透光检查后，在无菌条件下从每一个鸡蛋取出胚胎，然后通过提拉法将头和身体分离。随后立即将头丢弃，而将胚胎的身体部分投入瓶中，用无菌PBS清洗3至4次，并在35℃±2℃用预热的胰蛋白酶处理10-40分钟。

将胰蛋白酶处理过的细胞混悬液通过尼龙布进行过滤，随后以1000至1500rpm的速度在低温离心机中离心10至15分钟。将细胞沉淀混悬于新鲜的生长培养基中，使细胞充分混合，并以相同的方式再次离心该细胞混悬液。将该细胞混悬液转移到含上文所述培养基的无菌玻璃瓶中，并于35℃±2℃搅拌5-10分钟。在20L的玻璃瓶中，利用培养基将最终的细胞数量调整为1.4-2.2×10⁶/ml的范围。

该细胞混悬液以预定的最佳主种子或工作种子病毒稀释度进行接种，并于35±2℃缓慢搅拌下孵育90-120分钟，以使病毒吸附于细胞。在吸附结束时，将感染的病毒混悬液分装于PET TC转瓶(300±50ml/TC转瓶)或多层TC瓶如细胞工厂或细胞培养室(3000±500ml)或二者的组合。随后于34.5℃±0.5℃孵育4-6天。在第4天或第5天，收集细胞上清液作为第一次收获物，在第7或第8天实施第二次收集。各种病毒收获物储存于2℃-8℃。由于多次收集能得到更多具有良好效价的收获物，因此使得本发明更加经济有效。

混合的病毒收获物通过在蔗糖密度梯度区带离心机中以35000rpm超速离心而纯化和浓缩。蔗糖浓度在约35-40％之间时，狂犬病病毒的结合最好，含有活性活狂犬病病毒的蔗糖梯度/区带作为产品组分而收集。将来自不同混合收获物的产品组分病毒浓缩物于-60℃以下储存直至实施各种测试，如体外Ag分析、无菌度检测和细菌内毒素检测的结果已经比较清楚。

本发明还提供了一种灭活PM病毒以破坏其感染性而保留其抗原性的方法。将所述浓缩物于37℃解冻并于4±2℃冷却。用疫苗稳定剂稀释该浓缩物以获得适当的抗原含量8.5IU/ml，样品回收用于体外Ag分析，如ABT、ELISA和SRD检测。测量该混合物的pH并用10％w/v已事先灭菌的NaOH溶液的pH调至8.0±1。然后，将有效量的用PBS 1∶100稀释的β-丙内酯缓慢加入该混合物中，以达到1∶4000(0.025％)的终浓度，将容器中的内容物转移到另一个已事先灭菌的灭活容器中。在持续搅拌下，于2-6℃与β-丙内酯一起孵育。需要至少48小时以充分灭活病毒感染性而不丧失病毒抗原性。为了大规模培养时使工艺简化，优选于2-6℃进行PM病毒的灭活过程。

最后将灭活的混合物储存于5℃±3℃直至在持续搅拌下进行进一步处理。用适合的稳定剂溶液稀释该灭活的混合物，以将抗原值调为至少5IU/ml。混合过程中，将该混合物保持于5℃±3℃进行搅拌。装瓶之前，搅拌该混合疫苗30分钟。按照本领域中已知的方法进行冷冻干燥。所采用的疫苗稳定剂包含蔗糖、脱水明胶、人白蛋白和钠盐。疫苗制备成冷冻干燥型制剂，可用无菌注射用水进行重建。

利用鸡成纤维细胞制备的疫苗的效价和免疫原性与已利用多种动物安全性、效力和血清转化性研究进行评估的国际参考疫苗(International Reference Vaccine)(WHO 5^th IRM)相同。此外，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳验证和比较最终产品的纯度，类似于其他市售产品(图6)。并且当储存于2℃-8℃时该产品非常稳定。按照ICH的生物技术和生物学材料稳定性指南，在加速和应激温度下其也能保持效力和其他关键参数。

实施例2：将Pitman moore狂犬病病毒株适应于原代鸭胚成纤维细胞以及将从中获得的病毒连续适应于原代鸡胚成纤维细胞。

(A)首先通过1次脑内传代将原始Pitman moore狂犬病病毒株(Wistar株PM-HDCS，1503-3M)在瑞士白化体小鼠(Swiss AlbinoMice)体内进行适应，随后通过12次传代在胚胎化鸭蛋中适应，将得到的病毒命名为DE 42/74 Pas.1212.11.1974。本发明利用该病毒进一步适应于原代鸭胚成纤维细胞以及随后的鸡胚成纤维细胞。

实验利用11-12天的SPF鸭蛋而实施。按照已知的技术，将细胞数量设定为1.8×10⁶个细胞/ml，利用补充1.5％人白蛋白的生产培养基1(PCM 1，如上文所述)制备细胞混悬液。将一份5ml上述命名为“DE 42/74Pas.1212.11.1974”的冷冻病毒在37℃解冻，并稀释于细胞培养稳定剂中，用于感染鸭胚细胞混悬液。将感染的细胞混悬液装入TC PET转瓶中并于34℃孵育。感染后的第5天，从转瓶采集收获物并测试小鼠体内的病毒效价以及是否存在诸如细菌和真菌等的污染物。所收获的这些病毒命名为“02PM/鸭/S Pas.01”。

同样的，进一步在鸭胚细胞培养基中进行6次这样的传代，且每一次传代后，均收集约7.0升的收获物。每一次传代后，均采集收获物并测试小鼠体内的病毒效价以及是否存在诸如细菌和真菌等的污染物。将每一次传代的收获物均进一步分装成5ml的等份，并如下命名。

  培养日期  鸭蛋数量  收获物的  大致体积  实施例1：命名  02年4月14日  180  07升  02PM/鸭/S.Pas.01  02年7月27日  180  07升  02PM/鸭/S.Pas.02  02年11月30日  180  07升  02PM/鸭/S.Pas.03  03年1月11日  180  07升  03PM/鸭/S.Pas.04  03年10月4日  180  07升  03PM/鸭/S.Pas.05  03年11月17日  180  07升  03PM/鸭/S.Pas.06  03年12月18日  180  07升  03PM/鸭/S.Pas.07

在上述实验过程中，初次传代后，发现仅少量细胞感染且表现出狂犬病特异性荧光。从第4次传代开始，病毒感染性逐渐并显著增强。这可在下列图表中示出：

第7次传代后，感染性几乎恒定不变。尝试了几种备选方案但均未成功。出人意料的是，将病毒“03PM/鸭/S.Pas.0718.02.03”感染入鸡胚成纤维细胞时，感染性显著增强。根据该发现，如下文所述将该病毒株在鸡胚成纤维细胞中进一步传代以获得所需的感染性和病毒效价。

(B)约9-11天(180个胚胎)的已受精SPF鸡蛋用于该过程，并将头部与身体部分分离，仅处理身体部分而将头部丢弃。用磷酸缓冲盐反复冲洗所收集的身体部分，随后利用胰蛋白酶溶液消化处理胚胎。在PCM中制备细胞混悬液，并将细胞数量设定为1.6×10⁶个细胞/ml。将一等份5ml的“03PM/鸭/S.Pas.07”在37℃解冻，并稀释于稳定剂中。其用于感染该鸡胚细胞混悬液。在缓慢搅拌下将该感染细胞混悬液于37℃孵育1.5小时。将该感染细胞分装入转瓶中以及多层TC瓶中，并于34℃孵育。在感染的第5天，从转瓶和多层TC瓶采集约7升的收获物，并以适当等份进行分装，将这些分装的等份中的若干个5ml等份用于检测小鼠体内的病毒效价以及是否存在诸如细菌和真菌等的污染物。

将这些病毒收获物命名为“04PM/鸡/S.pas.08”。

  培养日期  鸡蛋数量  收获物的大致体积  命名  04年4月27日  180  07升  04PM/鸡/S.Pas.08  04年5月11日  180  07升  04PM/鸡/S.Pas.09  04年7月16日  180  07升  04PM/鸡/S.Pas.10  04年8月4日  180  07升  04PM/鸡/S.Pas.11  04年12月25日  180  07升  04PM/鸡/S.Pas.12

随后，在鸡成纤维细胞中再进行3次病毒的连续传代，每一次均采集部分收获物，并以5ml的等份分装，如上所述进行命名。对所有的代数均测试病毒效价以及是否存在细菌和真菌。

根据获得的数据，将第4次传代后得到的病毒命名为“04PM/鸡/S Pas.1104.08.04”，具有10^7.7LD_50％病毒效价/ml，本发明认为其可作为主种子病毒。该病毒再经过一次传代得到工作种子病毒“04PM/鸡/S Pas.1225.12.04”。

实施例3：从工作种子制备疫苗

通过一个类似于上文步骤1(b)中所述的过程，在鸡成纤维细胞中感染该种子病毒“04PM/鸡/S Pas.1225.12.04”，在第4天或之后得到第一次收获物，第一次收集之后的2-3天获得第二次收获物。混合的病毒收获物通过在蔗糖密度梯度区带离心机中以35000rpm超速离心而纯化和浓缩。在蔗糖浓度为约35-40％之间时进行狂犬病病毒的结合，收集有活性的活狂犬病病毒作为产品组分。将来自不同混合收获物的病毒浓缩物储存于-60℃以下直至多个测试，如体外Ag分析、无菌度检测和细菌内毒素检测的结果已经比较清楚。

将所述浓缩物于37℃解冻并于4℃±2℃冷却。用疫苗稳定剂稀释该浓缩物以获得适当的抗原含量8.5IU/ml，回收样品用于体外Ag分析，如ABT、ELISA和SRD检测。测量该混合物的pH并用10％w/v已事先灭菌的NaOH溶液将pH调至8.0±1。随后利用已知技术加入适当浓度的B-丙内酯来灭活该混合物。

最后将灭活的混合物储存于5℃±3℃同时持续搅拌，并用适合的稳定剂溶液稀释，以将抗原值调为至≥5IU/ml，并将该混合物保持于5℃±3℃搅拌30分钟。将该混合物装入瓶中，并利用包含蔗糖、脱水明胶、人白蛋白和钠盐的疫苗稳定剂使其稳定化。疫苗制成可用的冷冻干燥型制剂，可用无菌注射用水进行重建。

该疫苗的免疫原性和效价如下进行检测：

实施例4：小鼠体内的NIH效价检测

小鼠体内的NIH效价检测按照狂犬病实验室技术(LaboratoryTechniques in Rabies，WHO’1996)第四版以及印度药典来实施。

通过比较保护小鼠免受致死量脑内狂犬病毒侵袭所需的实验疫苗剂量与给与相同保护所需的相应参考疫苗(WHO 5^thIRM，16.0IU/安瓿)剂量来确定狂犬病疫苗的效价。

采用体重约12-15g的瑞士白化体小鼠。

将一种剂量的国际参考疫苗重建于2.0ml注射用水中，将其中的0.5ml与12ml磷酸盐缓冲液(PBS)彻底混匀得到25倍稀释液。

将来自至少每一批次(shelf)的本发明所述冷冻干燥的实验疫苗中的一种剂量分别重建于1.0ml注射用水中，然后混合到一起。取出0.5ml与12ml PBS彻底混匀，以得到25倍稀释液。

接下来，在PBS(pH 7.4)中制备国际标准和实验疫苗的3-5倍稀释液。如此选择稀释范围是为了获得包含足够的中间稀释度以保护50％研究用小鼠的疫苗，病毒的激发剂量为10-50LD₅₀。稀释度范围1∶25、1∶125、1∶625、1∶3125对于两种疫苗即标准以及实验疫苗均能发挥有效作用。

首次免疫接种的过程中，通过腹膜内途径对16只小鼠(8只雄性+8只雌性)注射0.5ml的每一种稀释液，首次免疫接种7天后，进行第二次免疫接种，重复第一次免疫接种的步骤。

对已免疫小鼠的病毒激发(感染)

第一次免疫接后14天，所有小鼠均感染激发病毒标准(Challenge Virus Standard，CVS)的脑悬液；将剂量调整为10-50LD₅₀。

实验动物的观察

观察感染小鼠14天。注意到感染5天后出现小鼠死亡。

效价的计算

通过REED和MUENCH法进行计算效价。发现：

●所述测试和标准疫苗的ED₅₀值均在给予实验动物的最高与最低剂量之间。

●所述激发混悬液的效价表现为：0.03ml包含10-50LD₅₀，接受该强度混悬液的所有动物均应出现死亡。

显著性水平(p＝0.95)的置信区间不低于所计算的效价的25％且不超过400％。

最终结果列表如下：

从上述实验可以得知，实验疫苗的平均效价是5.43IU/剂。每一次检测的95％置信区间均为所计算效价的25-400％。每一次检测中应用的激发病毒剂量(CVD)均在10-50LD₅₀之间。每一次检测中应用的标准和测试疫苗的ED₅₀均处于最高和最低稀释度之间。因此，可得出结论认为，该疫苗具有免疫保护性，且NIH效价值远高于所需要的最小剂量2.5IU/剂。

实施例5：兔体内的血清转化和激发研究

根据小鼠体内血清转化/激发研究的阳性结果，设计了一种组合研究来确定兔体内的血清转化和保护。采用体重约1.5-2.5kg的新西兰白兔，每组包括5只雄兔和5只雌兔。

根据WHO 5^th IRM，于2ml无菌注射用水中重建得到8IU/ml的浓度，作为参考疫苗。将本发明所述实验疫苗重建于1ml无菌注射用水中。

第0天和第7天，对每一组中的所有兔子均肌内注射0.5ml每一种疫苗，观察14天。第14天时，从每一只兔的耳缘静脉无菌抽取2ml血液，并37℃孵育1小时使其凝血。将血液样品以1500rpm离心10分钟分离血清，并将血清无菌收集于事先灭菌的试管/冷冻管中。将样品于56℃热灭活30分钟，并储存于-60℃以用于进行进一步的效价测定。

通过RFFIT和MNT测定每一个样品的抗体效价。接下来，全部兔均在静脉麻醉(硫喷妥纳)的情况下用30MLD₅₀/0.3ml激发病毒标准(CVS-27)进行脑内激发，观察兔14天，看是否出现狂犬病特异性症状和死亡情况。直至第5天的死亡可认为是非特异性死亡。

观察：

我们观察到，任何一组中的兔均未表现出狂犬病特异性症状，也均未死亡。从表格可以推断，测试疫苗的免疫原性类似于参考疫苗。

兔体内的血清转化

组I：参考狂犬病疫苗(WHO 5^th IRM)

组II：实验测试疫苗(PCEC狂犬病疫苗)

推论：

根据实验测试疫苗(RFFIT和MNT分别测得的平均值为：8.2和10.87)和参考疫苗(RFFIT和MNT分别测得的平均值为：8.51和10.06)得到的抗体效价，可以推断本发明所述实验疫苗与参考疫苗的免疫原性相同。

因此，我们可以从激发后获得的结果得到结论：就免疫原性和效价而言，根据本发明所述方法制备的PCEC疫苗(实验疫苗)与参考标准具有同等保护性。

实施例6：本发明所述实验疫苗与各种市售狂犬病疫苗的比较

利用已知标记物，实施SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析来检测并比较实验性狂犬病疫苗的蛋白结合与其他市售产品的蛋白结合。

从该研究观察到(图6)，当如同其他市售狂犬病疫苗一样配制时，本发明所述病毒浓缩物表现出同样的蛋白条带。

在图6中，

泳道1：低分子量标记物；

泳道2：本发明的API；

泳道3：如其他市售PCEC狂犬病疫苗一样配制的本发明API；

泳道4：市售PCEC狂犬病疫苗；

泳道5：基于Vero细胞系的市售狂犬病疫苗；

泳道6：如其他市售Vero狂犬病疫苗一样配制的本发明API。