牛蛙皮肤活性肽及其基因和在制药中的应用

摘要

本发明涉及一种牛蛙皮肤活性肽及其基因和在制药中的应用，牛蛙皮肤活性肽是从构建的牛蛙皮肤cDNA文库中筛选到的，牛蛙皮肤活性肽基因编码的一种单链多肽。分子量为3144.8道尔顿，等电点为10.16，多肽全序列一级结构为：Met Met Arg Val Met Arg Arg Lys Thr Lys Val IIe TrpGlu Arg Arg Asp Phe IIe Gly Leu Tyr Ser IIe Asp(MMRVMRRKTKVIWEKKDFIGLYSID)。编码牛蛙皮肤活性肽的基因由369个核苷酸组成，其中编码牛蛙皮肤活性肽的为第97-171位核苷酸。人工合成的牛蛙活性肽具有明显的抑制细菌生长的作用，可以作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物被应用，还具有清除自由基的功能。本发明的牛蛙皮肤活性肽具有分子量小、合成简单、抗菌活性强、抗氧化等特点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种牛蛙皮肤活性肽及其基因和在制药中的应用，属于生物医学领域。

背景技术

自从青霉素发现以来，抗生素一直是人类治疗病原微生物感染疾病的有力武器，但是由于人类对″抗生素″的持续使用和滥用，导致很多细菌对现有的抗生素都产生了耐药性，所以寻找全新的机制杀伤病原微生物，且不易形成耐药性的新型抗生素已经成为目前研究的热点之一。两栖类动物皮肤多肽类不仅具有高效、广谱且不易产生耐药性等特点，在耐抗生素病原菌株不断出现的今天，已成为人们应对日趋严重的耐药性细菌的新型生物制剂的主要生物资源。相关研究结果显示，两栖类皮肤多肽目录呈现出超乎想象的分子和功能多样性。蛙科(Ranidae)是分布最广泛的两栖动物，几乎遍及各大洲，占据着不同的生态地位，为适应特定环境，它们皮肤的活性成分在种类和数量等方面，都是极其惊人的。

在中国，很多两栖类动物被作为传统中药和民族药物而广泛应用，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效。已报道药理活性有广谱抗微生物作用、抗肿瘤、镇痛、局部麻醉、免疫调节、心血管系统作用等。据国内外文献报道，已从各种生物来源分离得到不同的活性多肽，而且有些已进入临床治疗。例如从爪蟾(Xenopus laevis)皮肤分泌液获得的抗菌肽Magainin具光谱抗微生物作用，同时具有抗肿瘤活性，在美国已获准作为广谱抗菌药物，其基因工程产品已进入三期临床。

目前我国科学家研究发现滇蛙皮肤具有极强的氧化自由基清除能力，并从滇蛙皮肤分泌液中发现了11个家族的抗氧化多肽。这些抗氧化多肽是由15～30个氨基酸组成的小肽。这些蛙类抗氧化多肽快速、强大的自由基清除能力可以最大限度地保护蛙类皮肤，使其尽可能少地受到日照、紫外线等诱导的自由基损伤，是皮肤保护、皮肤抗氧化领域的重大发现，对生物医学、抗氧化保护以及化妆品研发具有重要意义。牛蛙，原产于北美洲，1959年从古巴、日本引进我国内陆。目前我国主要靠养殖生产，全国各地均产，主要集中于湖北、湖南、江西、新疆、四川等地。

发明人将本发明的牛蛙皮肤活性肽氨基酸结构经蛋白质数据库进行比较，未发现有任何相同多肽。发明人将本发明的牛蛙皮肤活性肽编码基因经数据库进行比较，与其它已发现的活性肽基因的同源性比较低。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种牛蛙皮肤活性肽及其基因，为新的活性肽，具有广谱抗细菌功效。

本发明还公开了牛蛙皮肤活性肽及其基因在作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物的应用。

本发明进一步公开了牛蛙皮肤活性肽及其基因在在制备抗氧化保护药物中的应用。

本发明的牛蛙活性肽基因，其cDNA由369个核苷酸组成，其自5′端至3′端序列为：

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本发明的牛蛙活性肽，其分子量为3144.8道尔顿，等电点为10.16；编码牛蛙皮肤活性肽的为97-171位核苷酸，其氨基酸序列为：

Met Met Arg Val Met Arg Arg Lys Thr Lys Val IIe Trp Glu Arg Arg Asp Phe IIe Gly LeuTyr Ser IIe Asp。

本发明牛蛙皮肤活性肽的制备过程，包括以下步骤：

1)牛蛙皮肤活性肽基因的克隆：

牛蛙皮肤总RNA的提取，mRNA的纯化，cDNA第一链的合成及cDNA文库构建，设计引物利用PCR方法筛选牛蛙皮肤活性肽基因。扩增引物长度为20个核苷酸，上游引物为5′-ATGTTCACCWTGAAGAAATC-3′，下游引物为CLONTECH公司SMART^TM cDNA Library Construction Kit中的3′PCR Primer引物，其序列为5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCC-3′。所获阳性克隆进行核苷酸序列测定。基因测序结果表明牛蛙皮肤活性肽的基因由369个核苷酸组成，其自5′端至3′端序列为：

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编码牛蛙皮肤活性肽的为97-171位核苷酸，其氨基酸序列为：

Met Met Arg Val Met Arg Arg Lys Thr Lys Val IIe Trp Glu Arg Arg Asp Phe IIe Gly LeuTyr Ser IIe Asp。

牛蛙皮肤活性肽基因作为基因工程制备牛蛙皮肤活性肽的应用。

牛蛙皮肤活性肽的制备方法：

根据编码牛蛙皮肤活性肽的基因推导出牛蛙皮肤活性肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪APEX396合成其全序列。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。分子量测定采用电喷雾电离(electrospray ionization，ESI)，发射电压为4.5Kv。纯化的牛蛙凝集素用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度(流速1.0mL/min；流动相乙腈+水+TFA0.01％，梯度洗脱；色谱柱C18，检测波长220nm)，分子量测定采用快原子轰击质谱法，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

以下试验例表明牛蛙皮肤活性肽的医学作用：

1.牛蛙皮肤活性肽抑制细菌生长的作用：

抗菌活性检测，测定最小抑菌浓度(MIC)时，采用二倍稀释法进行抗菌检测。以LB液体培养基作为培养介质。将过夜培养的标准菌株用LB培养基稀释菌落成每毫升含10⁵细菌的菌液，将菌液接种于LB液体培养基，细菌最终浓度为10⁵。

在96孔细胞培养板上加入90μL LB培养基中，加入经0.22μm孔径膜过滤的溶解于生理盐水的牛蛙活性肽样品10μL作为第一孔，混匀后取50μL加入第2管，依次倍比稀释，自第9孔吸出50μL弃去，第10管系对照管，每个样品重复两次。细菌菌株均为吉林大学畜牧兽医学院微生物与免疫实验室保存，结果如表1.

表1.牛蛙皮肤活性肽抑制细菌生长的作用

由表1可见，合成的牛蛙皮肤活性肽具有显著的抑制细菌生长的作用。

2.牛蛙皮肤活性肽的抗氧化活性检测

配制6×10^-5M DPPH甲醇溶液，用灭菌的去离子水将抗菌肽样品配成2mg/mL。2μL样品与48μL DPPH使用液混合(使样品与DPPH的质量比为3∶1)，室温避光放置30min，于517nm检测光吸收，每种样品做3个平行。紫外分光光度计调零时使用甲醇。

自由基清除率％＝(空白对照一样品)/空白对照×100％

对合成的样品进行抗氧化活性测定(如表2)，根据自由基清除率计算得：Catesbeianin-1具有很强的DPPH自由基清除能力，以溶解样品的H₂O为对照，对自由基DPPH的清除率为69.47％。

表2.合成样品的抗氧化活性

结论：上述试验表明牛蛙皮肤活性肽具有显著的抑制细菌生长的作用，可以作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物的应用。

牛蛙皮肤活性肽具有抗氧化的作用，可以作为皮肤抗氧化保护的应用。

本发明的有益效果在于：由牛蛙皮肤活性肽编码基因推导其氨基酸结构，合成的牛蛙皮肤活性肽具有显著的抑制细菌生长的作用，并且具有抗氧化的作用。牛蛙皮肤活性肽具有结构简单、人工合成方便的特点。

具体实施方式：

下面用实例来进一步说明本发明实质内容，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1：

牛蛙皮肤活性肽基因克隆：

I.牛蛙皮肤总RNA提取

A.活体牛蛙用双蒸水清洗干净，灭菌针从牛蛙的延髓腔毁髓，取50～100mg牛蛙皮肤组织放入干烤过的研钵中，加入1mL TRIZOL Reagent(Invitrogen公司产品)迅速在冰水浴中研磨。

B.充分混匀后，移入1.5mL离心管中(DEPC管)15～30℃放置5min，加入等体积氯仿旋涡混匀15s，4℃ 12000×g离心15min。

C.取上清加入500μL异丙醇，15～30℃放置5min，旋涡15s混匀，4℃ 12000×g离心10min。弃上清，加入1mL 75％乙醇漂洗沉淀，7500×g离心5min，重复1次。超净工作台中干燥90s，用30μL RNase-free water溶解，即得到牛蛙皮肤组织总RNA。

II.牛蛙皮肤mRNA的分离纯化，采用操作步骤按照德国QIAGEN公司的OligotexmRNA Mini Kit试剂盒说明书进行。

III.牛蛙皮肤cDNA文库的构建

采用CLONTECH公司的CreatorTM SMART^TM cDNA Library Construction Kit文库构建试剂盒。

A.cDNA第一链合成(mRNA反转录)

以纯化的mRNA为模板，利用cDNA构建试剂盒提供的CDS III/3′Primer：5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3′(N＝A，C，G or T；N-1＝A，G or C)和SMARTTM IV oligonucleotide：5′-AAGCAGTGGTATCAA CGCAGA GT GGCC ATTACG GCCGGG-3′，在PowerScript^TM逆转录酶的作用下，合成cDNA第一链。反应体系为10μL：1μL SMART IV Oligonucleotide，1μL CDS III引物混匀，72℃ 2min，冰浴2min。离心后分别加入以下试剂：2.0μL 5X First-Stand Buffer、1.0μL DTT(20mM)、1.0μL dNTPMix(10mM)、1.0μL PowerScript逆转录酶，反应总体积为10.0μL。42℃反应60min，冰浴放置5min，终止第一链合成。-20℃保存。

B.LD-PCR方法扩增第二链

1.95℃预热PCR仪。

2.以第一链cDNA为模板，向反应管中依次加入以下试剂：2μL cDNA第一链合成产物、80μL去离子水、10μL 10*Advantage 2PCR缓冲液、2μL 50*dNTP混合物、2μL 5′PCR引物、2μL CDS 111/3′PCR引物以及2μL 50*Advantage 2Polymerase Mix，反应体系为100μL。

3.在PCR仪中按以下程序扩增：

①95℃1分钟；

②24个循环：95℃15秒钟，68℃复性6分钟。

4.循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链进行纯化。

C.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：

1.挑取大肠杆菌DH5α单菌落划线接种在新鲜LB琼脂平板上，37℃过夜。挑取单菌落接种到25mL的LB液体培养基中。

2.以220-225rpm 37℃振摇过夜。取10mL过夜培养物接种到1L LB中。在37℃剧烈振摇培养直到OD600达到0.5-0.7，冰浴1h。

3.把菌液转移到灭菌的预冷的离心瓶中。以4000rpm(2800xg)4℃，15min。去上清液冰浴。轻轻地用1L冰预冷的10％甘油重悬沉淀。

4.4000rpm(2800xg)4℃，15min，轻轻地用0.5L冰预冷的10％甘油重悬沉淀。

5.4000rpm(2800xg)4℃，15min，轻轻地用250mL冰预冷的10％甘油重悬沉淀。

6.4000rpm(2800xg)4℃，15min。用甘油重悬使最终体积达3.5mL。细菌密度大约为3x10¹⁰细胞/mL。等体积分装为100μL/份，迅速放于干冰中。在-80℃贮存感受态细胞。

7.用超螺旋载体如pUC19进行转化验证感受态。应产生至少0.5-1x10¹⁰cfu/μg的细胞。

D.连接以及连接产物的转化：

1.在微量离心管中加入0.3μL TaKaRa pMD18-T载体、2.2μL牛蛙cDNA双链溶液、2.5μL 4d H₂O，加入5μL Solution1，全量为10μL。

2.16℃连接过夜.

3.全量(10μL)加入至100μL DH5a感受态细胞中，冰浴30分钟。

5.42℃热击90秒钟后，冰浴2分钟。

6.加入LB培养基800μL，37℃缓慢振荡培养(60-80转/min)45-60分钟。

7.取200μL涂布于含有Amp+的LB培养基上37℃培养16小时，形成单菌落。

8.每个LB平皿用5mL LB液体培养基洗涤菌落，加30％甘油冻存。构建的cDNA文库大约含1x10⁶个单独克隆。

IV.牛蛙皮肤活性肽基因克隆筛选

扩增引物长度为20个核苷酸，上游引物：5′-ATGTTCACCWTGAAGAAATC-3′，下游引物为SMART^TM cDNA Library Construction Kit中的3′PCR Primer引物：5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCC-3′。

PCR反应条件如下：94℃30秒，50℃30秒，72℃2分钟，共35循环，72℃10分钟。

V.牛蛙皮肤活性肽基因序列测定结果

提取质粒并用M13+与M13-测序，仪器为ABI PRISM 3730全自动核苷酸序列测定仪，基因测序结果自5′端至3′端序列为：

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牛蛙皮肤活性肽基因核苷酸序列为：序列长度为369个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，序列

种类：cDNA，来源：牛蛙皮肤

编码牛蛙皮肤活性肽的为97-171位核苷酸，其氨基酸序列为：

Met Met Arg Val Met Arg Arg Lys Thr Lys Val IIe Trp Glu Arg Arg Asp Phe IIe Gly LeuTyr Ser IIe Asp。

实施例2：

制备牛蛙皮肤活性肽

I、样品的制备方法：根据编码牛蛙皮肤活性肽的基因推断牛蛙活性肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪APEX396合成其全序列。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。

II、分子量测定采用电喷雾电离(electrospray ionization，ESI)，发射电压为4.5Kv。

III、纯化的牛蛙凝集素用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度(流速1.0mL/min；流动相乙腈+水+TFA0.01％，梯度洗脱；色谱柱C18，检测波长220nm)，分子量测定采用快原子轰击质谱法，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

牛蛙皮肤活性肽是由无尾两栖类动物牛蛙活性肽基因编码的一种单链多肽，分子量为3144.8道尔顿，等电点为10.16，多肽全序列一级结构为：蛋氨酸-蛋氨酸-精氨酸-缬氨酸-蛋氨酸-精氨酸-精氨酸-赖氨酸-苏氨酸-赖氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-色氨酸-谷氨酸-精氨酸-精氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-亮氨酸-酪氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-天冬氨酸(Met Met Arg Val Met Arg Arg Lys Thr Lys Val IIe Trp Glu Arg Arg AspPhe IIe Gly Leu Tyr Ser IIe Asp)。

SEQUENCE LISTING

<110>吉林大学

<120>牛蛙皮肤活性肽及其基因和在制药中的应用

<130>

<160>369

<210>1

<211>369

<212>DNA

<213>牛蛙(Rana catesbeiana)

<220>

<221>CDS

<222>(97)...(171)

<400>1

atgttcaccatgaagaaatcgctgttactcctttttttccttgggaccatcaacttatct     60

ttttgtgaaaaggagagaagagaaagagggaaacggatgatgagggtgatgaggaggaag    120actaaagttatttgggaaaaaaaggactttattggattatacagtattgattgaactggc    180tccattcgtggaatattgaaaaacaggctacaaattgtaacaatgaaaacaagccctatc    240

cctgaacacccaaaaagagccaaagagtcgttactgtgacattcctacagccaataaacc    300

ctactggaagcttacatcgtggtttatagttaagtctgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa    360

aaaaaaaaa                                                       369

<210>2

<211>25

<212>PRT

<213>牛蛙(Rana catesbeiana)

<400>2

Met Met Arg Val Met Arg Arg Lys Thr Lys Val IIe Trp Glu Arg Arg

Asp Phe IIe Gly Leu Tyr Ser IIe Asp