新的骨量增加药

摘要

本发明公开了含有RANKL作用分子的骨形成增强剂，所述分子能增强成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、成熟或钙化。具体地讲，本发明公开了用于治疗或预防伴有骨量减少的代谢性骨病的药物组合物，所述组合物包含作为有效成分的能作用于位于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞上的RANKL以促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物。

说明书

技术领域

本发明涉及增强骨形成(osteogenesis)的方法，即通过给予有效量的作用于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞(例如成骨细胞前体细胞、间充质干细胞、基质细胞和成肌细胞)的分子，从而增强所述细胞的分化和成熟。

另外，本发明涉及刺激骨形成的药物组合物。

此外，本发明涉及作用于RANKL并用于信号传递的物质的筛选方法，涉及通过这样的筛选方法所得到的物质，并涉及包含所得到的物质的药物组合物。

背景技术

骨是通过在骨形态发生中重复形成和吸收/破坏而不断进行骨的重建并维持血清钙浓度的活动器官。一般而言，由成骨细胞引起的骨形成和由破骨细胞引起的骨吸收通常处于平衡状态。骨量可通过这些细胞间的相互反应的机制而维持在恒定水平上(参见非专利文件1)。当平衡状态因绝经、衰老、炎症等而遭到破坏时，就会因骨质疏松症或类风湿性关节炎导致破坏而引起代谢性骨病。这种代谢性骨病的发生在目前的老龄化社会中是一个严重问题。因此，在分子水平上阐明这种疾病的病理机制并开发有效治疗药是迫切任务。

在日本，推测有一千万以上潜在的骨质疏松症患者。骨量减少(例如骨质疏松症)的实例包括青少年骨质疏松症、骨发育障碍、高钙血症、甲状旁腺机能亢进症、骨软化症、骨质缺乏、溶骨性骨病、骨坏死、佩吉特病(Paget′s disease)、类风湿性关节炎、因骨关节炎引起的骨量减少、炎症性关节炎、骨髓炎、糖皮质激素治疗、转移性骨病、牙周骨丢失、因癌症引起的骨丢失、因衰老引起的骨丢失和其它骨量减少相关疾病。

迄今为止，抑制骨吸收过程、而不是增强骨形成的骨吸收抑制剂已用作表现出骨丢失的骨代谢疾病(例如骨质疏松症)的治疗药。能抑制骨吸收并用于或建议用于治疗骨质疏松症的药物实例包括雌激素、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、依普黄酮、维生素K2、钙剂、骨化三醇、降钙素(参见非专利文件2)和二膦酸盐例如阿仑膦酸盐(参见非专利文件3)。然而，采用以上药物的治疗方法在疗效和结果上并不总是令人满意的。因此，一直都在期待进一步开发安全有效的新治疗药。具体地讲，人们关注的是，以上述二膦酸盐为代表的骨吸收抑制剂可能会引起过度骨吸收抑制，这会在体内导致不良反应。另外，已经提出会发生医源性大理石样骨病(iatrogenic marble bone disease)(骨硬化症)的危险(参见非专利文件4)。因此，必须慎重使用上述药物，尤其对于年轻患者。已报道骨折的愈合可被延迟，尤其是在二膦酸盐引起骨代谢周转率极大下降的情况下(参见非专利文件5)。

同时，在日本，可作为骨合成代谢因子的甲状旁腺激素(PTH)正在进行临床开发。除此之外，已知BMP2、BMP7、IGF1、FGF2等具有骨合成代谢活性。然而，这类药物在实践上用作骨合成代谢因子的例子是数量有限的。例如，这类例子在美国和其它国家已有报道，但这些例子仅涉及临床使用PTH(用于骨质疏松症)、BMP2和BMP7(用于脊椎前移(spondylolisthesis)等)以及IGF1(用于因严重原发性IGF1缺陷所致的身材矮小儿童)。如上所述，使用骨合成代谢因子的例子非常少。这是因为引起骨形成的成骨细胞分化和成熟机制尚未阐明。

控制骨质溶解的破骨细胞是多核大细胞，源自分化成单核细胞/巨噬细胞的造血细胞。破骨细胞前体细胞经分化成熟而成为破骨细胞，这受到骨表面的成骨细胞/基质细胞的控制(参见非专利文件1)。一种破骨细胞分化因子(RANKL；NF-κB受体激活蛋白配体(receptoractivator of NF-κB ligand)是隶属于肿瘤坏死因子(TNF)家族的膜结合蛋白，是由骨吸收因子作用于成骨细胞/基质细胞而诱导的，而且RANKL是破骨细胞分化/成熟必不可少的(参见非专利文件6和7)。作为集中在RANKL/RANK/OPG(包括作为RANKL受体的RANK(NF-κB受体激活蛋白)和作为诱骗受体(decoy receptor)的OPG(护骨蛋白))的研究结果，在生物学水平上已对破骨细胞分化和成熟控制机制进行了解释。另外，参与骨代谢疾病的3种因子正在被阐明(参见非专利文件8)。

骨形成和骨吸收通常处于平衡状态，这是由将骨形成程度精细控制在对应于骨吸收程度的现有机制而维持的。骨吸收和骨形成的这种共轭关系(conjugation)称为“偶联(coupling)”(参见非专利文件9)。RANKL是一种破骨细胞分化因子，它在响应骨吸收因子的刺激时在成骨细胞上产生。RANKL与位于破骨细胞前体细胞和破骨细胞上并作为RANKL受体的RANK结合，导致分化和活化信号的传递。已有报道称，根据以上机制，构象类似于TNF结合区的人工肽用于抑制信号自RANKL传递到RANK(参见非专利文件10至12)。

同时，为响应骨吸收信号的传递而将骨形成信号传递到成骨细胞的机制尚未阐明。

非专利文件1：Suda等，Endocr Rev，13：66，1992

非专利文件2：Sambook等，N Engl J Med 328：1747，1993

非专利文件3：Luckman等，J Bone Miner Res 13：581，1998

非专利文件4：Whyte等，N Engl J Med 349：457，2003

非专利文件5：Odvina等，J Clin Endocrinol Metab 90：1294，2005

非专利文件6：Yasuda等，Proc Natl Acad Sci USA 95：3597，1998

非专利文件7：Lacey等，Cell 93：165，1998

非专利文件8：Suda等，Endocr Rev，20：345，1999

非专利文件9：Martin等，Trends Mol Med，11：76，2005

非专利文件10：Aoki等，J Clin Invest 116：1525，2006

非专利文件11：Takasaki等，Nat Biotec，15：1266，1997

非专利文件12：Cheng等，J Biol Chem，279；8269，2004。

发明内容

本发明的一个目的是提供增强骨形成的方法，即通过给予有效量的能增强成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、成熟或钙化的RANKL结合分子；以及提供能刺激骨形成的药物组合物。

本发明的发明人已经发现，除了将正向信号自RANKL传递给RANK之外，也发生了将反向信号自作为RANKL受体的RANK传递到作为RANK配体的RANKL。同样，本发明的发明人还发现，在RANKL与RANK之间传递的双向信号控制骨吸收和骨形成的偶联。人们认为，自位于破骨细胞上的膜结合RANK传递给位于成骨细胞上的膜结合RANKL的反向信号在生理性骨代谢中控制骨吸收和骨形成的偶联。利用这样的反向信号允许开发能增加骨量的药物。具体地讲，对成骨细胞分化和成熟的增强作用是由反向信号引起的，当RANKL结合分子(例如膜结合RANK、RANK类似物肽、抗RANKL抗体、可溶性RANK、OPG及其变异体和类似物)与膜结合RANKL结合时，就会传递这样的反向信号，导致骨量增加。

如上所述，本发明的发明人已经发现，可通过允许可用作作用于RANKL的分子的各种蛋白质、肽等作用于位于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞上的RANKL，体外诱导成骨细胞的分化、成熟和钙化。此外，本发明的发明人已经发现，可用作作用于RANKL的分子的各种蛋白质、肽等，当体内给予小鼠时，可导致小鼠的骨密度等的增加，因此可用于治疗和预防骨量减少相关骨代谢疾病。这使得本发明得以完成。

具体地讲，本发明描述如下。

[1]一种用于治疗或预防骨量减少相关骨代谢疾病的药物组合物，所述组合物包含作为有效成分的作用于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物。

[2]第[1]项的用于治疗或预防骨量减少相关骨代谢疾病的药物组合物，其中所述作用于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物作用于位于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞上的RANKL。

[3]第[1]项的用于治疗或预防骨量减少相关骨代谢疾病的药物组合物，其中所述作用于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物是选自以下的化合物：RANK、RANK片段肽的变异体、结构上类似于RANK的肽、结构上类似于RANK片段肽的肽、结构上类似于RANK的化学物质、结构上类似于RANK片段肽的化学物质、OPG、OPG的变异体或片段肽、结构上类似于OPG的肽、结构上类似于OPG片段肽的肽、结构上类似于OPG的化学物质和结构上类似于OPG片段肽的化学物质。

[4]第[2]项的用于治疗或预防骨量减少相关骨代谢疾病的药物组合物，其中所述作用于位于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞上的RANKL并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物是选自以下的化合物：RANK、能作用于RANKL的RANK片段肽的变异体、结构上类似于RANK并能作用于RANKL的肽、结构上类似于RANK片段肽并能作用于RANKL的肽、结构上类似于RANK并能作用于RANKL的化学物质、结构上类似于RANK片段肽并能作用于RANKL的化学物质、OPG、能作用于RANKL的OPG的变异体或片段肽、结构上类似于OPG并能作用于RANKL的肽、结构上类似于OPG片段肽并能作用于RANKL的肽、结构上类似于OPG并能作用于RANKL的化学物质和结构上类似于OPG片段肽并能作用于RANKL的化学物质。

[5]第[1]或[2]项的用于治疗或预防骨量减少相关骨代谢疾病的药物组合物，其中所述作用于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物是由SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：16所示氨基酸序列组成的肽。

[6]第[1]或[2]项的用于治疗或预防骨量减少相关骨代谢疾病的药物组合物，其中所述作用于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物是包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的肽和GST或IgG1的Fc区的融合蛋白。

[7]第[1]或[2]项的用于治疗或预防骨量减少相关骨代谢疾病的药物组合物，其中所述作用于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物是抗RANKL抗体或其功能性片段。

[8]第[1]-[7]项中任一项的用于治疗或预防骨量减少相关骨代谢疾病的药物组合物，其中所述骨量减少相关骨代谢疾病选自骨质疏松症、青少年骨质疏松症、骨发育障碍、高钙血症、甲状旁腺机能亢进症、骨软化症、骨质缺乏、溶骨性骨病、骨坏死、佩吉特病、类风湿性关节炎、因骨关节炎引起的骨量减少、炎症性关节炎、骨髓炎、糖皮质激素治疗、转移性骨病、牙周骨丢失、因癌症引起的骨丢失和因衰老引起的骨丢失。

[9]第[1]-[8]项中任一项的用于治疗或预防骨量减少相关骨代谢疾病的药物组合物，所述组合物还包含作为有效成分的BMP家族成员。

[10]第[1]-[9]项中任一项的用于治疗或预防骨量减少相关骨代谢疾病的药物组合物，其中所述能分化成成骨细胞的细胞选自成骨细胞前体细胞、间充质干细胞、基质细胞和成肌细胞。

[11]一种筛选作用于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞，给成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞传递信号并促进所述细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物的方法；所述方法包括判断候选化合物是否是作用于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞，给成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞转导信号并促进所述细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物，即通过允许候选化合物接触表达RANKL的成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞并证实候选化合物是否能够促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化。

[12]第[11]项的筛选方法，其中所述作用于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物作用于位于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞上的RANKL。

[13]一种筛选作用于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞，给成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞传递信号并促进所述细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物的方法；所述方法包括判断候选化合物是否是作用于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞，给成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞传递信号并促进所述细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物，即通过将候选化合物给予小鼠并证实在小鼠中是否观察到选自以下的至少一种现象：在骨密度、骨矿物质含量、骨表面积、单位骨量、骨小梁宽度和骨小梁数量方面的增加。

[14]第[13]项的筛选方法，其中所述作用于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物作用于位于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞上的RANKL。

[15]第[11]至[14]项中任一项的筛选方法，其中所述能分化成成骨细胞的细胞选自成骨细胞前体细胞、间充质干细胞、基质细胞和成肌细胞。

[16]一种用于成骨细胞分化和成熟的药物，所述药物包含作为活性剂的作用于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物。

[17]第[16]项的用于成骨细胞分化和成熟的药物，其中所述作用于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物作用于位于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞上的RANKL。

[18]第[16]项的用于成骨细胞分化和成熟的药物，其中所述作用于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物是选自以下的化合物：RANK、RANK片段肽的变异体、结构上类似于RANK的肽、结构上类似于RANK片段肽的肽、结构上类似于RANK的化学物质、结构上类似于RANK片段肽的化学物质、OPG、OPG的变异体或片段肽、结构上类似于OPG的肽、结构上类似于OPG片段肽的肽、结构上类似于OPG的化学物质和结构上类似于OPG片段肽的化学物质。

[19]第[17]项的用于成骨细胞分化和成熟的药物，其中所述作用于位于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞上的RANKL并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物选自：RANK、能作用于RANKL的RANK片段肽的变异体、结构上类似于RANK并能作用于RANKL的肽、结构上类似于RANK片段肽并能作用于RANKL的肽、结构上类似于RANK并能作用于RANKL的化学物质、结构上类似于RANK片段肽并能作用于RANKL的化学物质、OPG、能作用于RANKL的OPG的变异体或片段肽、结构上类似于OPG并能作用于RANKL的肽、结构上类似于OPG片段肽并能作用于RANKL的肽、结构上类似于OPG并能作用于RANKL的化学物质和结构上类似于OPG片段肽并能作用于RANKL的化学物质。

[20]第[16]至[19]项中任一项的用于成骨细胞分化和成熟的药物，其中所述作用于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物是包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的肽。

[21]第[16]至[19]项中任一项的用于成骨细胞分化和成熟的药物，其中所述作用于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物是包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的肽和GST或IgG1的Fc区的融合蛋白。

[22]第[20]项的用于成骨细胞分化和成熟的药物，其中所述作用于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物是呈乙酸盐形式的包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的肽。

[23]第[19]项的用于成骨细胞分化和成熟的药物，其中所述作用于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物是抗RANKL抗体或其功能性片段。

[24]第[16]至[23]项中任一项的用于成骨细胞分化和成熟的药物，其中所述能分化成成骨细胞的细胞选自成骨细胞前体细胞、间充质干细胞、基质细胞和成肌细胞。

[25]一种用于治疗或预防骨量减少相关骨代谢疾病的药物组合物，所述组合物包含作为有效成分的包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的肽。

[26]一种用于治疗或预防骨量减少相关骨代谢疾病的药物组合物，所述组合物包含作为有效成分的包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的肽和GST或IgG1的Fc区的融合蛋白。

[27]第[25]项的用于治疗或预防骨量减少相关骨代谢疾病的药物组合物，其中所述有效成分是呈乙酸盐形式的包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的肽。

[28]第[25]至[27]项中任一项的用于治疗或预防骨量减少相关骨代谢疾病的药物组合物，其中所述骨量减少相关骨代谢疾病选自骨质疏松症、青少年骨质疏松症、骨发育障碍、高钙血症、甲状旁腺机能亢进症、骨软化症、骨质缺乏、溶骨性骨病、骨坏死、佩吉特病、类风湿性关节炎、因骨关节炎引起的骨量减少、炎症性关节炎、骨髓炎、糖皮质激素治疗、转移性骨病、牙周骨丢失、因癌症引起的骨丢失和因衰老引起的骨丢失。

[29]第[25]至[28]项中任一项的用于治疗或预防骨量减少相关骨代谢疾病的药物组合物，所述组合物还包含作为有效成分的BMP家族成员。

本说明书包括日本专利申请第2007-149799、2007-313822、2008-60145和2008-131572号的说明书和/或附图中所公开的部分或全部内容，这些专利申请是本申请的优先权文件。

附图简述

图1是在用肽D处理的人间充质干细胞中ALP活性增加的图。

图2是显示在用肽D处理的人间充质干细胞中ALP活性增加的染色图像。

图3是显示用肽D处理的人间充质干细胞的钙化的图。

图4是用肽D处理的(小鼠成骨细胞前体细胞系的)MC3T3-E1细胞中ALP活性增加的图。

图5是显示用肽D处理的MC3T3-E1细胞钙化的图像。

图6是在用肽D处理的小鼠成骨细胞中ALP活性增加的图。

图7是在用抗RANKL多克隆抗体处理的小鼠成骨细胞中ALP活性增加的图。

图8是在用抗RANKL多克隆抗体和抗RANKL单克隆抗体处理的小鼠成骨细胞中ALP活性增加的图。

图9是在用肽D、抗RANKL多克隆抗体和抗RANKL单克隆抗体处理的人成骨细胞中ALP活性增加的图。

图10是在用肽D、OPGFc、RANKFc和抗RANKL单克隆抗体处理的人成骨细胞中ALP活性增加的图。

图11是在用抗RANKL多克隆抗体处理的(小鼠成肌细胞细胞系的)C2C12细胞中ALP活性增加的图。

图12A～图12C显示在用肽D处理的人间充质干细胞中ALP和I型胶原蛋白基因表达水平的增加。图12A显示电泳结果。图12B和图12C显示经GAPDH表达水平归一化的结果。

图13是在表达膜结合RANK的C2C12中ALP活性增加的图。

图14A和图14B是在表达膜结合RANK的ST2中ALP活性增加的图。图14A和图14B分别显示在维持培养基中培养和在地塞米松(10^-7M)和活化维生素D3(10^-8M)存在下的结果。

图15是用或不用RANKL处理的小鼠颈骨的单位骨量的图。

图16是用或不用RANKL处理的小鼠颈骨的破骨细胞数的图。

图17是用或不用RANKL处理的小鼠颈骨的骨小梁数量的图。

图18显示用或不用RANKL处理的小鼠股骨的骨形态图像(用μCT获得)。

图19是用或不用RANKL处理的小鼠颈骨的成骨细胞表面积的图。

图20A是用肽D处理的小鼠股骨的矿物质含量的图。

图20B是用肽D处理的小鼠股骨的表面积的图。

图20C是用肽D处理的小鼠股骨的骨密度的图。

图21是用肽D处理的小鼠骨密度(在各个股骨区内)的图。

图22A是用肽D处理的小鼠骨密度(在接近股骨远端5mm的区域中)的图。

图22B是用肽D处理的小鼠皮质骨量(在接近股骨远端5mm的区域中)的图。

图23显示对于用肽D处理的小鼠，在接近股骨远端2mm的区域中的三维结构分析(用μCT)结果的图像。

图24A是对于用肽D处理的小鼠，在接近股骨远端2mm的区域中的μCT分析的BV/TV图。

图24B是对于用肽D处理的小鼠，在接近股骨远端2mm的区域中的μCT分析的骨小梁宽度图。

图24C是对于用肽D处理的小鼠，在接近股骨远端2mm的区域中的μCT分析的骨小梁数量图。

图25显示用肽D处理的小鼠钙化率(A)和增殖率(B)的图。

图26显示在用肽D刺激后12小时得到的p38磷酸化的图像。

图27显示在用肽D刺激后短时间内得到的p38磷酸化的图像。

图28显示由肽D引起的GSK3β磷酸化图像。

图29显示由肽D引起的Smad磷酸化图像。

图30是显示使用SB203580对由肽D引起的ALP活性增加的抑制的图。

图31是显示使用Dkk-1对由肽D引起的ALP活性增加的抑制的图。

图32是显示使用BMPR-IA对由肽D引起的ALP活性增加的抑制的图。

图33是显示在用肽D和BMP-2处理的C2C12细胞中ALP活性增加的协同效应的图。

图34是显示在用肽D和BMP-2处理的MC3T3-E1细胞中ALP活性增加的协同效应的图。

图35显示在用BMP-2处理的C2C12细胞中促进RANKL表达的图像。

图36是显示在RAW264细胞中肽D和肽E引起的TRAP活性的抑制的图。

图37显示在MC3T3-E1细胞中肽D和肽E引起的ALP活性增加。

图38显示在RANKL敲减(knock-down)MC3T3-E1细胞中对由肽D引起的ALP活性增加的抑制。

图39A是显示不同肽D盐替代品引起的ALP活性增加的图。

图39B是乙酸盐形式的肽D引起的ALP活性剂量依赖性增加的图。

图39C是显示肽D和BMP-4的组合引起的ALP活性增加的图。

图40显示在C2C12细胞中RANKL抗体以及RANKL抗体和BMP-2的组合引起的ALP活性增加的图。

图41显示在小鼠成骨细胞中RANKL抗体引起的ALP活性增加的图。

图42显示在小鼠成骨细胞中RANKL抗体和BMP-2的组合引起的ALP活性增加的图。

图43是显示在MC3T3-E1细胞中GST-RANKL对由肽D和BMP-2的组合引起的ALP活性增加的影响。

图44是显示用肽D和RANKL抗体处理的小鼠成骨细胞的增殖性反应的图。

图45是显示在用肽D处理的MC3T3-E1细胞中(12小时后)基因表达变化的图。

图46是显示在用肽D处理的MC3T3-E1细胞中(96小时后)基因表达变化的图。

图47A显示电泳图像，表明在用肽D和BMP-2处理的MC3T3-E1细胞中基因表达(ALP、Col1和OC)的变化。

图47B是显示在用肽D和BMP-2处理的MC3T3-E1细胞中基因表达(ALP、Col1和OC)变化的图。

图48是显示肽D引起的骨形成标记增加的图。

图49是显示在基因表达中肽D的骨合成代谢活性的图。

图50A显示由肽D诱导的分化因子和受体的表达的图像。

图50B是由肽D诱导的分化因子和受体的表达的图。

图51是显示Fc融合肽D引起的ALP活性增加的图。

图52是显示肽D盐替代品对破骨细胞形成活性影响的图。

图53是不同RANKL抗体相对于RANKL诱导的破骨细胞形成活性的中和能力的图。

图54是抗人RANKL单克隆抗体相对于RANKL诱导的破骨细胞形成活性的中和能力的图。

图55是显示GST融合肽D引起的ALP活性增加的图。

图56是显示抗人RANKL单克隆抗体引起的ALP活性增加的图。

实施发明的最佳方式

在下文中详细描述了本发明。

RANKL(NF-κB受体激活蛋白配体)是RANK(NF-κB受体激活蛋白)的配体(属于TNF超家族成员)和具有胞内结构域的2型跨膜蛋白(对应于N-端48个氨基酸(残基1-48)的结构域、跨膜结构域和胞外结构域)。(日本专利公布(Kohyo)第2002-509430A号和WO98/46644(现在的日本专利第3523650号))。为响应骨吸收因子的刺激，在成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞上表达RANKL。在此，能分化成成骨细胞的细胞包括任何类型的细胞，只要这样的细胞能分化成成骨细胞。其实例包括成骨细胞前体细胞、间充质干细胞、基质细胞和成肌细胞。在胞外结构域中，对应于氨基酸残基153-317的结构域是TNF配体家族同源结构域。人源性RANKL全长核苷酸序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。RANK的全长核苷酸序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

OPG(护骨蛋白)是一种结构上类似于RANK的蛋白质，并能与RANKL结合。OPG的全长核苷酸序列和氨基酸序列分别示于SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6。

本发明涉及药物组合物，其包含作为有效成分的化合物，该化合物作用于成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化，从而诱导骨形成，因而引起骨量增加等。这种药物组合物是包含作为有效成分的化合物的药物组合物，该化合物给成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞传递信号并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化，从而诱导骨形成，因而引起骨量增加等。其实例是包含作为有效成分的化合物的药物组合物，该化合物作用于RANKL，使RANKL传递信号给成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化，从而诱导骨形成，因而引起骨量增加等。当化合物作用于RANKL时，目标RANKL的来源动物是不受限制的。目标RANKL的实例包括来自不同种类动物的RANKL，例如人RANKL、小鼠RANKL和大鼠RANKL。在此，术语“作用于RANKL”是指该化合物作用于RANKL，使RANKL传递信号给成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞。例如，该化合物可与RANKL结合，使RANKL传递信号给成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞。

作用于RANKL并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化，从而诱导骨形成，因而引起骨量增加等的化合物的实例，包括能作用于RANKL的各种化合物，RANKL可源自不同动物种类。这些化合物包括天然肽和非天然肽以及化学合成和微生物来源的低分子化合物。

促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化，从而诱导骨形成，因而引起骨量增加等的本发明化合物的实例包括：RANK片段肽的变异体、结构上类似于RANK的肽、结构上类似于RANK片段肽的肽、结构上类似于RANK的化学物质和结构上类似于RANK片段肽的化学物质。这些化合物的实例包括RANK、能作用于RANKL的RANK片段肽的变异体、结构上类似于RANK并能作用于RANKL的肽、结构上类似于RANK片段肽并能作用于RANKL的肽、结构上类似于RANK并能作用于RANKL的化学物质以及结构上类似于RANK片段肽并能作用于RANKL的化学物质。

另外，本文所用的术语“化学物质”是指非肽或非蛋白质化合物。术语“RANK”是指膜结合RANK和可溶性RANK。术语“膜结合RANK”是指结合在细胞表面的RANK，其具有跨膜区。细胞实例包括动物细胞，例如表达天然RANK的细胞和表达重组RANK的人体细胞和哺乳动物细胞。同样，术语“RANK”是指RANKFc。在此，RANKFc是通过将人IgG1的Fc区与人RANK胞外区结合而获得的融合蛋白。

此外，在本发明中，术语“结构上类似于”是指所得化合物具有与RANK结构类似并能作用于RANKL的部分的情况。就肽和蛋白质而言，这样的部分在通常以氨基酸序列为代表的一级结构上类似于RANK。然而，在本发明中，在构象上、而不是在氨基酸序列上类似于RANK并且能作用于RANKL的化合物也可使用。

此外，促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化，从而诱导骨形成，因而引起骨量增加等的化合物的实例，包括OPG、OPG的变异体或片段肽、结构上类似于OPG的肽、结构上类似于OPG片段肽的肽、结构上类似于OPG的化学物质和结构上类似于OPG片段肽的化学物质。例如，所述化合物可以是这样的化合物：其作用于RANKL并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化，从而诱导骨形成，因而引起骨量增加等。其实例包括OPG、能作用于RANKL的OPG的变异体或片段肽、结构上类似于OPG并能作用于RANKL的肽、结构上类似于OPG片段肽并能作用于RANKL的肽、结构上类似于OPG并能作用于RANKL的化学物质和结构上类似于OPG片段肽并能作用于RANKL的化学物质。

另外，本文所用的术语“化学物质”是指非肽或非蛋白质化合物。术语“OPG”是指膜结合OPG和可溶性OPG。术语“膜结合OPG”是指C-端区结合在细胞表面的OPG。这种细胞的实例包括动物细胞，例如表达天然OPG的细胞和表达重组OPG的人体细胞。同样，术语“OPG”是指OPGFc。在此，OPGFc是通过将人IgG1的Fc区与人OPG胞外区结合而获得的融合蛋白(Fc融合蛋白)。

RANK类似物或OPG类似物的实例是具有RANK或OPG活性的蛋白质或肽，其氨基酸序列是由RANK的氨基酸序列、OPG的氨基酸序列、或其任一种的片段肽的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸的缺失、取代或添加而获得的。在此，术语“一个或多个”是指“1-9个”、优选“1-5个”和更优选“1个或2个”。

结构上类似于RANK部分并与RANKL结合的肽的实例包括含有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的肽(肽D)和含有SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的肽(肽E)。这些肽是环状肽，其中第2位的Cys与第8位的Cys通过二硫键相结合。

此外，也可使用结构上类似于RANK部分并与RANKL结合的肽盐。这样的肽盐没有限制，只要它是药理学上可接受的盐。其实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐的具体实例包括：含有乙酸、苹果酸、琥珀酸、三氟乙酸(TFA)、酒石酸和柠檬酸等有机酸的盐；和含有盐酸、硫酸、硝酸和磷酸等无机酸的盐。另外，碱加成盐的具体实例包括含有钠和钾等碱金属的盐，含有钙和镁等碱土金属的盐和含有铵和三乙胺等胺的盐。在这些盐中，优选乙酸盐。具体地讲，优选呈乙酸盐形式的包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的肽。

同样，也可使用通过将GST(谷胱甘肽-S-转移酶)或人IgG1的Fc区(GST融合蛋白或Fc融合蛋白)与结构上类似于RANK部分并与RANKL结合的肽结合而获得的融合蛋白。这种融合蛋白的实例是通过将GST(谷胱甘肽-S-转移酶)或人IgG1的Fc区与肽D结合而获得的融合蛋白(GST融合肽D或Fc融合肽D)。上述融合蛋白的体内稳定性得到不同程度的改进，并且血清半衰期得以延长。同样，可使用包含GST和表位标签、而非Fc区的融合蛋白。这种表位标签的实例包括聚组氨酸(其包含2-12个、优选4个以上、更优选4-7个、还更优选5个或6个组氨酸)、FLAG标签、Myc标签、V5标签、Xpress标签、HQ标签、HA标签、AU1标签、T7标签、VSV-G标签、DDDDK标签、S标签、CruzTag09、CruzTag22、CruzTag41、Glu-Glu标签、Ha.11标签、KT3标签、硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白(MBP)和β-半乳糖苷酶。

在本发明中，作用于RANKL并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化，从而诱导骨形成，因而引起骨量增加等的化合物，可称为RANKL激动剂物质。

此外，这些化合物包括抗RANKL抗体，其作用于RANKL，促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化，从而诱导骨形成，因而引起骨量增加等；而且还包括其功能性片段。在本发明中，这种抗体可称为RANKL激动剂抗体。可通过已知方法，获得呈多克隆抗体或单克隆抗体形式的抗RANKL抗体。优选它是单克隆抗体。单克隆抗体的实例包括杂交瘤所产生的单克隆抗体和宿主所产生的单克隆抗体，这样的宿主是利用包含抗体基因的表达载体，通过遗传工程方法转化而来的。可通过如下所述的已知方法制备能产生单克隆抗体的杂交瘤。具体地讲，这样的杂交瘤可制备如下：采用已知免疫接种方法，使用膜结合RANKL或可溶性RANKL或其片段肽作为致敏抗原来进行接种，通过通用细胞融合方法，将所得免疫细胞与已知亲本细胞融合，然后通过已知筛选方法来筛选产生单克隆抗体的细胞。一旦接种RANKL，在使用前，就可允许RANKL与载体蛋白结合，所述载体蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)和匙孔血蓝蛋白(keyhole lympet haemocyanin)等。可使用的单克隆抗体是如下产生的重组单克隆抗体：使用杂交瘤，对抗体基因进行克隆，将所克隆的基因掺入到合适载体中，然后通过基因重组技术将该载体引入宿主中(例如参见Vandamme，A.M.等，Eur.J.Biochem.1990；192：767-775)。在这种情况下，可将编码抗体重链(H链)和轻链(L链)的DNA分别掺入到表达载体中，同时转化宿主细胞。或者，可将编码H链和L链的DNA掺入到一个表达载体中，以转化宿主细胞(参见WO 94/11523)。同样，也可使用转基因动物，产生重组抗体。例如，可通过将抗体基因插入到编码乳汁中特别产生的蛋白质(例如山羊β-酪蛋白)的基因的非末端区内，制备融合基因。将含有已插入抗体基因的融合基因的DNA片段注射到山羊胚胎中，将由此得到的胚胎引入雌性山羊体内。从引入胚胎的山羊或其后代所生的转基因山羊分泌的乳汁中，就可得到所需抗体(Ebert，K.M.等，Bio/Technology 1994；12：699-702)。

本发明抗RANKL抗体的实例包括经人工修饰而使例如针对人的异源抗原性水平降低的基因重组抗体，例如嵌合抗体和人源化抗体。这类抗体的具体实例包括通过已知方法产生的嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。嵌合抗体可按如下方式获取：获取编码抗体V区的DNA，将该DNA与编码人抗体C区的DNA连接，将所得物掺入到表达载体中，然后将载体引入宿主中，用于产生抗体。在某些情况下，人源化抗体可称为重建(重塑)人抗体。通过将非人类哺乳动物抗体(例如小鼠抗体)的互补决定区(CDR)移植到人抗体的互补决定区，而得到人源化抗体。这可通过已知方法而产生(参见EP 125023和WO96/02576)。人抗体C区用于嵌合抗体或人源化抗体的C区。例如，Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4可用于H链，Cκ或Cλ可用于L链。此外，为了改进抗体稳定性或生产稳定性，可修饰人抗体C区。

可通过将抗原给予经引入例如人抗体基因座而得到的能产生人源抗体的转基因动物，获取人抗体。这样的转基因动物实例包括小鼠。产生能产生人抗体的小鼠的方法可参见WO02/43478等。

抗RANKL抗体不仅包括完整抗体，而且包括其功能性片段。功能性抗体片段相当于抗体的一部分(部分片段)，其具有针对相关抗原的至少一种抗体作用。其具体实例包括F(ab′)₂、Fab′、Fab、Fv、二硫键连接的Fv、单链Fv(scFv)及其任何聚合物[D.J.King.，Applicationsand Engineering of Monoclonal Antibodies.，1998T.J.InternationalLtd]。

另外，当使用单克隆抗体时，可使用一种类型的单克隆抗体。然而，也可使用识别不同表位的两种以上类型，例如2种、3种、4种或5种单克隆抗体。

可测定上述化合物是否具有促进信号通过RANKL传递的激动剂活性，即通过例如将抗体给予能表达RANKL的成骨细胞或成骨细胞前体细胞或者具有类似于成骨细胞特征的细胞(例如成肌细胞、基质细胞和间充质干细胞)，使抗体作用于RANKL，然后检测所述细胞是否发生分化或增殖。可根据例如细胞碱性磷酸酶活性、钙化等方面的增加，确定分化或增殖的发生与否。

此外，当将上述化合物给予动物时，骨密度、骨矿物质含量和骨表面积将会增加。术语“骨密度”是指矿物质组分(例如骨钙)的数值密度。可通过pQCT(外周定量计算机断层扫描，使用外周骨X射线CT扫描仪(peripheral quantitative computerized tomography with aperipheral bone X-ray CT apparatus))、SXA(单能X射线吸收测量(singleenergy X-ray absorptiometry))、DXA(双能X射线吸收测量(dual energyX-ray absorptiometry)，一种双能X射线吸收方法)等，测定骨密度。此外，当将以上化合物给予动物时，通过μCT对骨的三维结构分析可证实海绵骨密度的增加。此外，通过测定海绵骨小梁结构可证实BV/TV(单位骨量：骨体积/总的组织体积)、骨小梁宽度和骨小梁数量上的增加。此外，当将上述化合物给予动物时，通过使用pQCT的骨形态学测量可证实皮质骨区骨密度的增加。

上述结果表明，该化合物作用于位于成骨细胞、成骨细胞前体细胞、间充质干细胞、基质细胞和成肌细胞上的RANKL，使反向信号得以传递，导致对骨形成的促进作用。本发明的组合物在体外可增强骨形成，因此可用作研究用试剂。或者，它可在体内用作药物组合物。

本发明的药物组合物可用作增强骨形成的药物组合物。具体地讲，它可用于治疗和预防骨量减少相关骨代谢疾病。这些骨代谢疾病的实例包括骨质疏松症、青少年骨质疏松症、骨发育障碍、高钙血症、甲状旁腺机能亢进症、骨软化症、骨质缺乏、溶骨性骨病、骨坏死、佩吉特病、类风湿性关节炎、因骨关节炎引起的骨量减少、炎症性关节炎、骨髓炎、糖皮质激素治疗、转移性骨病、牙周骨丢失、因癌症引起的骨丢失、因衰老引起的骨丢失和其它骨量减少相关疾病。

化合物的剂量将因症状、患者年龄和体重等不同而异。然而，对于成人口服给药，剂量通常为每天约0.01mg～1000mg。可按单剂量给药或多剂量给药形式进行给药。另外，对于胃肠外给药，可通过皮下注射、肌肉注射或静脉内注射给予约0.01mg～1000mg的单剂量。另外，对于给药时间，可在动脉硬化病的临床症状已经发展之前或之后给药。

组合物可包括常用于制剂领域的载体、稀释剂和赋形剂。例如乳糖、硬脂酸镁等可用作片剂的载体或赋形剂。可使用的注射用含水溶液的实例包括生理性盐溶液以及含有葡萄糖和其它辅助剂的等渗溶液。这种注射用含水溶液可与合适增溶剂例如醇、多元醇(例如丙二醇)或非离子型表面活性剂联用。可使用的油性溶液的实例包括芝麻油和大豆油。这样的油性溶液可与增溶剂例如苯甲酸苄酯或苯甲醇联用。

本发明的药物组合物还可含有BMP(骨形态发生蛋白；骨形成蛋白)家族成员，除了含有促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化，从而诱导骨形成，因而引起骨量增加等的化合物之外。一个实例是这样的化合物：其作用于RANKL并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟和钙化，从而诱导骨形成，因而引起骨量增加等。也就是说，将BMP家族成员和以下化合物联用还可得到更好的效果：所述化合物作用于或不作用于RANKL并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化，从而诱导骨形成，因而引起骨量增加等。具体地讲，优选将BMP家族成员与肽D、肽E或抗RANKL抗体联用。具体地讲，本发明包括用于治疗或预防骨量减少相关骨代谢疾病的药物组合物，可将BMP家族成员与促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物(尤其是肽D、肽E或抗RANKL抗体)联用，就可得到这样的药物组合物。当本发明的化合物与BMP家族成员联用时，可制备同时含有这两类物质的药物制剂，用于给药。或者，也可分别给予本发明化合物和BMP家族成员。具体地讲，本发明的药物组合物包含BMP家族成员与促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物(尤其是肽D、肽E或抗RANKL抗体)的组合制剂。BMP家族成员的实例包括BMP-4、BMP-2、BMP-7和BMP-6。本发明的化合物与BMP家族成员相互作用，促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟和钙化，从而诱导骨形成，因而引起骨量增加等。BMP成员的含量不受限制。然而，例如，其单剂量约为0.01mg～1000mg。

本发明还包括筛选化合物的方法，该化合物促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟和钙化，从而诱导骨形成，因而引起骨量增加等。一个实例是这样的化合物：其作用于RANKL并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟和钙化，从而诱导骨形成，因而引起骨量增加等。

对于筛选方法，将候选物给予成骨细胞、成骨细胞前体细胞或具有类似于成骨细胞前体细胞特征的细胞(例如基质细胞、间充质干细胞或成肌细胞)。然后，检测候选化合物是否促进这些细胞的分化和增殖。例如，将候选化合物给予成骨细胞、成骨细胞前体细胞或具有类似于成骨细胞前体细胞特征的细胞(例如基质细胞、间充质干细胞或成肌细胞)，所述细胞已表达RANKL。然后检测候选化合物是否作用于RANKL并促进这些细胞的分化和增殖。可根据细胞碱性磷酸酶活性、细胞钙化程度等方面的增加，判定分化或增殖的发生。如果候选化合物促进了分化或增殖，可判定该候选化合物就是能促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化，从而诱导骨形成，因而引起骨量增加等的化合物。一个实例是作用于RANKL并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化，从而诱导骨形成，因而引起骨量增加等的化合物。

另外，当将候选化合物给予小鼠(例如C57BL/6CrjCrlj)时，可通过检查骨密度、骨矿物质含量、骨表面积等方面是否增加，而判定候选化合物是否是目标化合物。在这种情况下，目标化合物就是这样的化合物：其促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化，从而诱导骨形成，因而引起骨量增加等。一个实例是这样的化合物：其作用于RANKL并促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化，从而诱导骨形成，因而引起骨量增加等。

下面，参考以下实施例，进一步详述本发明，尽管本发明的技术范围并不限于此。

实施例1：人间充质干细胞的分化

试剂

合成肽用作实验试剂。合成肽D是含有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的肽，是由9个氨基酸组成并含有通过二硫键彼此结合的2个半胱氨酸残基的环肽。已经报道合成肽D与RANKL结合(Aoki等，JClin Invest 116：1525，2006)。作为对照肽，使用缺乏上述功能的合成肽。

培养细胞

人间充质干细胞购自Cambrex Corporation。Lonza生产的维持培养基用于继代培养。

人间充质干细胞的分化

将人间充质干细胞接种到96孔板(1×10³细胞/孔)(Nunc)和48孔板(2.4×10³细胞/孔)(IWAKI)上。24小时后，从各板去除培养上清液，向其中加入成骨细胞分化诱导培养基(Lonza)。每隔3天或4天更换一次新培养基。

在此时，加入浓度为100μM的肽D(肽D处理组)。作为阴性对照，加入同样浓度的对照肽。

ALP(碱性磷酸酶)活性测定

分化后第7天，从各板去除培养上清液，细胞用丙酮/乙醇溶液固定。用磷酸对硝基苯酯作为底物，测定ALP活性。具体地讲，将含有磷酸对硝基苯酯(Nacalai)(1mg/mL)的碳酸盐缓冲液(5mM MgCl₂，50mM NaHCO₃)加入到各孔(100μL/孔)中，再在37℃孵育。然后用微量培养板阅读器(BMG Labtech)在405nm处测定各孔的OD值。

在加入肽D(100μM)的人间充质干细胞组中，在第7天，在分化培养基和维持培养基内，ALP活性显著增加(图1)。另外，与对照组相比，在肽D处理组中观察到以浓度依赖性方式的ALP染色(图2)。

实施例2：人间充质干细胞的钙化

ALP染色

在分化期间，加入浓度为300μM的肽D。在第7天，细胞用10％中性缓冲福尔马林溶液固定，接着用丙酮/乙醇溶液再次固定。

将按照下述组成而制备的染色液(500μL)加入到细胞中，再在37℃孵育10分钟，用水洗涤并干燥。

(染色液的组成)

萘酚AS-MX磷酸盐(SIGMA)：       5mg

N，N-二甲基甲酰胺(Wako)：      0.5mL

0.1M Tris-HCl(pH 8.5)：        50mL

坚牢蓝半盐(SIGMA)：            30mg

茜素红S染色

分化后第21天，细胞用PBS洗涤，再用10％中性缓冲福尔马林溶液固定。

除去固定液后，细胞用水洗涤。向其中加入1％茜素红S染色液(Nacalai)(150μL)。将板在室温下放置3分钟。然后，弃去染色液，再用水洗涤并干燥。然后进行显微镜观察。

按照与实施例1同样的方式，培养人间充质干细胞。将肽D(300μM)加入到人间充质干细胞中。因此，无论是否诱导分化，在第21天观察到强烈的茜素红染色。这表明肽D除了增加ALP活性之外，还诱导钙化(图3)。

实施例3：小鼠成骨细胞前体细胞系(MC3T3-E1)的分化

培养细胞

小鼠成骨细胞前体细胞系MC3T3-E1(亚克隆号4)细胞购自ATCC。

小鼠成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)

将与10％FBS+αMEM(GIBCO)混合的细胞接种到96孔板(8×10³细胞/孔)和48孔板(2×10⁴细胞/孔)上。48小时后，将各板的培养上清液更换为含有5mMβ-甘油磷酸(SIGMA)、10μg/mL抗坏血酸钠(SIGMA)的10％FBS+αMEM。然后，每隔3天或4天更换一次新培养基。作为对照，使用10％FBS+αMEM作为维持培养基培养MC3T3-E1。一旦更换培养基后，就向各板中加入浓度为300μM的肽。按照实施例1所述的方法，在第7天和第21天进行ALP活性测定和茜素红S染色。

小鼠成骨细胞前体细胞系的分化

在加入肽D(300μM)的组中，在MC3T3-E1细胞分化后第7天，ALP活性显著增加(图4)。

肽D对钙化的影响

在加入肽D(300μM)的组中，在MC3T3-E1细胞分化后21天，观察到强烈的茜素红染色(图5)。这表明肽D除了增加ALP活性之外，还诱导钙化。这种现象不仅在分化培养基中培养时、而且在维持培养基中培养时都能观察到。

实施例4：小鼠成骨细胞的分化

试剂

为了实验，使用山羊多克隆mRANKL抗体(R&D，Saint Cruz)、单克隆mRANKL抗体((A)：克隆88227(R&D)；(B)：克隆12A668)(ALEXIS)和合成肽D。作为阴性对照，使用山羊IgG(ZYMED)和对照肽。所用的合成肽D和对照肽与实施例1所用的相同。另外，作为阳性对照，使用300ng/mL BMP-2(R&D)。按照实施例1所述，进行ALP活性测定。

小鼠成骨细胞的收集

将新生小鼠颅盖浸泡在酶溶液(0.1％胶原酶(Wako)，0.2％分散酶(GODO SHUSEI CO.，LTD.))中，再在37℃恒温浴中振摇5分钟。从中取出最初漂浮的细胞部分，再向其中加入新的酶溶液(10mL)，再次在37℃恒温浴中振摇10分钟。上述操作重复4次。每次都收集漂浮的细胞溶液。将各次漂浮细胞溶液在250×g离心5分钟。将所得物悬浮在培养基中，再在CO₂培养箱中培养3天或4天。用胰蛋白酶-EDTA溶液(Nacalai)收集细胞，再用Cell Banker(Juji Kagaku(JujiField Inc.))冷冻保存。

小鼠成骨细胞的分化

使用10％FBS+αMEM，将所得小鼠成骨细胞接种在96孔板(0.8×10⁴/孔)上。当发生细胞贴壁后，在含有5mM β-甘油磷酸和10μg/mL抗坏血酸的培养基中诱导细胞分化。结果证实，到第7天，在分化培养基中，300μM合成肽D引起ALP活化程度增加(图6)。一旦分化，就加入上述抗体(各1μg/mL)。在分化后第7天，在加入相应因子的组中证实ALP活性显著增加(图7)。这种现象不仅在分化培养基中培养的小鼠成骨细胞中、而且在维持培养基中培养的小鼠成骨细胞中都能观察到。也就是说，与对照抗体相比，能结合RANKL的多克隆抗体显著诱导小鼠成骨细胞的分化。为了更详细地证实抗体的作用，将不同浓度的多克隆抗体加入到小鼠成骨细胞中，再在维持培养基中培养7天。此时，抗RANKL单克隆抗体A和抗RANKL单克隆抗体B用于检测证实类似分化作用的可能性，同时也使用单克隆抗体。结果，发现抗RANKL多克隆抗体以浓度依赖性方式引起小鼠成骨细胞的ALP活性增加，尽管观察到某种程度的分散(图8)。此外，抗RANKL单克隆抗体A和抗RANKL单克隆抗体B的组合以类似方式引起小鼠成骨细胞ALP活性增加(图8)。根据以上所述，发现小鼠RANKL多克隆抗体和单克隆抗体可诱导小鼠成骨细胞的分化。

实施例5：人成骨细胞的ALP活化作用

本实施例中所用的抗RANKL多克隆抗体和抗RANKL单克隆抗体等试剂与实施例4所用的相同。另外，使用抗RANKL单克隆抗体((C)：克隆12A380)(ALEXIS)、人OPGFc和人RANKFc(R&D))。按照实施例1所述进行ALP活性测定。所有上述抗体都是针对小鼠RANKL的抗体。另外，已发现这些抗体与人RANKL交叉反应并与之结合。

培养细胞

人成骨细胞购自Cambrex Corporation。专用培养基(Lonza)用于继代培养。

人成骨细胞的分化

将人成骨细胞接种在96孔板(3.1×10³/孔)和48孔板(7.65×10³/孔)中。当发生细胞贴壁后，使用含有5mM β-甘油磷酸的培养基进行分化。一旦分化，就加入抗体(100ng/mL或1ng/mL)。培养进行5天或6天，然后进行ALP活性测定。

抗RANKL多克隆抗体、抗RANKL单克隆抗体、肽D、OPGFc和RANKFc引起人成骨细胞ALP活性的显著增加，证实了分化(图9和图10)。根据以上所述，发现针对小鼠RANKL的多克隆抗体、单克隆抗体、OPGFc和RANKFc可诱导人成骨细胞的分化。

实施例6：小鼠成肌细胞的分化

本实施例中所用的单克隆mRANKL抗体等试剂与实施例4所用的相同。按照实施例1所述进行ALP活性测定。

培养细胞

(小鼠成肌细胞前体细胞系的)C2C12细胞购自RIKEN。

小鼠成肌细胞的分化

将作为小鼠成肌细胞前体细胞的C2C12细胞接种在96孔板(6.5×10³细胞/孔)中。48小时后，将培养上清液更换为含有300ng/mL BMP-2(R&D)的5％FBS+DMEM(SIGMA)。在培养基更换期间，将抗体(100ng/mL)加入其中，然后培养7天。证实单克隆mRANKL抗体((A)克隆88227(R&D))引起小鼠成肌细胞ALP活性的显著增加，导致分化为成骨细胞(图11)。作为实验结果，表明抗RANKL单克隆抗体单独作用于具有成骨细胞前体细胞特性的小鼠成肌细胞，从而诱导细胞分化成为成骨细胞。

实施例7：肽D对人间充质干细胞的ALP活化作用RT-PCR分析

将人间充质干细胞(3×10⁴细胞)接种在6孔板上，然后在成骨细胞分化培养基(Lonza)或维持培养基(Lonza)存在下培养7天。将肽D(100μM和300μM)加入到各孔中。此外，将肽溶剂加入到对照组中。培养后，细胞用PBS洗涤并溶于QIAzol Lysis Reagent(QIAGEN)(0.75mL)中。然后，收集溶液。将溶液在室温下放置5分钟。然后，加入氯仿(Wako)(0.15mL)，通过上下颠转而混合所得物，然后将所得物于4℃在12000×g离心15分钟。将上清液收集到新管内。用EZ1RNA通用组织试剂盒(QIAGEN)和Magtration System 12GC(QIAGEN)，自上清液中分离出RNA。测定RNA浓度后，对各RNA(250ng)进行1％琼脂糖凝胶电泳，以证实RNA是否降解。对未降解RNA(各500ng)进行RT-PCR。用ThermoScript RT-PCR System(Invitrogen)和随机引物进行RT-PCR。

cDNA合成后，使用人碱性磷酸酶(hALP)和人I型胶原蛋白(hCollagen I)的特异性引物进行PCR。为了标准化，使用人GAPDH特异性引物进行PCR。所用的PCR引物序列如下所示。另外，使用ExTaq^TM Hot Start Version(Takara Bio Inc.，Shiga，Japan)，在下述条件下进行PCR。使碱性磷酸酶(hALP)经历初次热变性，在94℃15分钟，接着是28次循环，在94℃1分钟，58℃1分钟和72℃30秒，然后是72℃10分钟的延伸反应。使I型胶原蛋白(hCollagen I)经历初次热变性，在94℃15分钟，接着是25次循环，在94℃1分钟，58℃1分钟和72℃30秒，然后在72℃10分钟的延伸反应。使GAPDH经历初次热变性，在95℃3分钟，接着是28次循环，在95℃10秒，60℃15秒和68℃1分钟，然后是68℃10分钟的延伸反应。

PCR引物序列

hALP-F：5’-GGGGGTGGCCGGAAATACAT-3’(SEQ ID NO：8)

hALP-R：5’-GGGGGCCAGACCAAAGATAGAGTT-3’(SEQ ID NO：9)

hCollagenI-F：5’-ATTCCAGTTCGAGTATGGCG-3’(SEQ ID NO：10)

hCollagenI-R：5’-TTTTGTATTCAATCACTGTCTTGCC-3’(SEQ ID NO：11)

hGAPDH-F：5’-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3’(SEQ ID NO：12)

hGAPDH-R：5’-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3’(SEQ ID NO：13)

将PCR反应后所得到的样品进行1％琼脂糖凝胶电泳。在紫外光下用溴化乙锭证实形成特定条带(图12A)。所得图像用CSAnalyzer进行分析。图12B和图12C显示根据GAPDH表达水平的标准化结果。

在加入肽D(300μM)的人间充质干细胞组中，在分化后第7天，在分化培养基和维持培养基内，ALP活性都显著增加。另外，在分化后第7天当进行细胞的ALP染色时，与对照组相比，在肽D处理组中证实以浓度依赖性方式发生ALP染色。然而，作为PCR分析结果，当人间充质干细胞在肽存在下分化7天后，证实碱性磷酸酶和I型胶原蛋白的表达水平以肽浓度依赖性方式增加(图12A)。还是在维持培养基中，浓度为300μM的肽引起碱性磷酸酶和I型胶原蛋白的mRNA表达水平的增加(图12B和图12C)。

实施例8：膜结合RANK导致C2C12分化成为成骨细胞

将与DMEM-5％FBS混合的COS1细胞接种在96孔板(10000细胞/孔)上，然后培养1天。然后，细胞用以下各种质粒DNA来转染：经QIAwell8质粒纯化试剂盒(Qiagen)纯化的pSRα-EX1(对照表达载体1)、pSRα-mRANK(小鼠RANK表达载体)和pCAGGS-mBMP-4(小鼠BMP-4表达载体)，并使用FuGENE HD(Roche)(50ng/孔)。按照类似方式，将pCAGGS-mBMP-4(0.5ng)与pCAGGS(对照表达载体2)(24.5ng)和pSRα-mRANK(25ng)混合在一起，然后进行转染。作为对照，将pCAGGS-mBMP-4(0.5ng)与pCAGGS(24.5ng)和pSRα-EX1(25ng)混合在一起，然后进行转染。翌日，将C2C12细胞接种在COS1板上进行转染(10000细胞/孔)，然后进行培养。每隔3天用DMEM-2.5％FBS更换培养基一次。1周后，从中去除培养基，然后加入混合物溶液(丙酮∶乙醇1∶1)，进行细胞固定。30秒后去掉固定液。将培养板干燥约30分钟，其间制备ALP检测液(5mM MgCl₂，40mMNaHCO₃，1mg/ml磷酸对硝基苯酯)并逐步加入到培养板中(每次加入100μl的量)，开始反应。60分钟后，使用微量板阅读器进行测定(ABS：405nm)。结果，发现pSRα-mRANK引起ALP活性的显著增加，因而表现出成骨细胞分化活性，尽管活性水平比作为阳性对照的pCAGGS-mBMP-4所表现的更微弱(图13)。另外，当pCAGGS-mBMP-4的比例降至1％时，未观察到pCAGGS-mBMP-4与作为对照表达载体的pSRα-EX1之间的显著差异。然而，作为用pSR-α-mRANK同时转染的结果，观察到ALP活性的显著增加(图13)。此外，比单用pSRα-mRANK转染而言，当pCAGGS-mBMP-4的比例降至1％时再与pSRα-mRANK同时转染，观察到ALP活性的更显著增加(图13)。这表明膜结合RANK与BMP-4协同作用。如上所述，膜结合RANK独立诱导或与BMP-4协同诱导具有成骨细胞前体细胞特征的小鼠成肌细胞株的成肌细胞性C2C12细胞分化成为成骨细胞。

实施例9：膜结合RANK导致ST2细胞分化成为成骨细胞

(小鼠基质细胞系的)ST2细胞购自RIKEN。将与DMEM-5％FBS混合的COS1细胞接种在96孔板(10000细胞/孔)上，然后培养1天。然后，细胞用以下各种质粒DNA来转染：经QIAwell 8质粒纯化试剂盒(Qiagen)纯化的pSRα-EX1(对照表达载体1)和pSRα-mRANK(小鼠RANK表达载体)，并使用FuGENE HD(Roche)(50ng/孔)。翌日，将ST2细胞接种在COS1板上进行转染(5000细胞/孔)并共同培养。另外，为了在ST2细胞中诱导RANKL表达，制备含有地塞米松(10^-7M)和活化维生素D3(10^-8M)的系统，用于在ST2细胞中诱导RANKL表达，并制备不含这两者的系统(缺乏对RANKL表达的诱导)。3天后，将DMEM-2.5％FBS加入其中。3天后，将培养基更换为DMEM-2.5％FBS。1周后，去除培养基并将混合物溶液(丙酮∶乙醇1∶1)加入其中，进行细胞固定。30秒后去掉固定液。将培养板干燥约30分钟，其间制备ALP检测液(5mM MgCl₂，40mM NaHCO₃和1mg/ml磷酸对硝基苯酯)并逐步加入到培养板中(每次加入100μl的量)，开始反应。60分钟后，使用微量板阅读器进行测定(ABS：405nm)。结果，仅在含有地塞米松(10^-7M)和活化维生素D3(10^-8M)的系统中，发现pSRα-mRANK引起ALP活性的显著增加(RANKL诱导)。在系统中，ST2细胞表现出成骨细胞分化活性(图14A和图14B)。如上所述，膜结合RANK独立诱导(小鼠基质细胞系的)的ST2细胞分化成为成骨细胞，所述ST2细胞具有成骨细胞前体细胞和脂肪细胞前体细胞的特征。该现象仅在使用ST2细胞诱导RANKL表达的情况下观察到。这表明，膜结合RANK与经诱导而在ST2细胞上表达的膜结合RANKL结合，使成骨细胞分化信号在ST2细胞内转递。

实施例10：破骨细胞体内分化引起的成骨细胞的增殖和分化GST-RANKL的制备

通过PCR，将SalI位点和NotI位点加到编码人RANKL残基140-317的cDNA上。将内切核酸酶用于克隆pGEX-4T-2谷胱甘肽S-转移酶的cDNA下游(GE healthcare；Genbank检索号：U13854)。SEQ IDNO：14和SEQ ID NO：15分别代表GST融合蛋白编码DNA的核苷酸序列和该蛋白的氨基酸序列，所述GST融合蛋白的氨基酸序列包含RANKL氨基酸序列位置140-317的氨基酸。当使用IPTG(终浓度：0.5mM)，在BL21(DE3)大肠杆菌(Escherichia coli)(Invitrogen)中诱导蛋白质表达后，将细胞悬浮于提取缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，100mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT和1％(v/v)TritonX-100)中，然后在4℃用超声波仪破碎。在18000×g离心15分钟。然后，收集上清液并上样到谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Sepharose)柱。随后，用洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，100mM NaCl，1mM DTT和0.1％(v/v)TritonX-100)洗涤。然后，使用谷胱甘肽溶液(20mM还原型谷胱甘肽，50mM Tris-HCl和pH 8.0)进行洗脱。通过滤器过滤后，测定经SDS-PAGE纯化的GST-RANKL的分子量和纯度。分子量为47.0kDa，纯度为95％以上。另外，通过鲎变形细胞裂解产物测定(limulusamebocyte lysate assay)，检测内毒素浓度为小于1EU/ug。

给予RANKL的试验

将57nmol(低剂量)或426nmol(高剂量)的GST-RANKL经腹膜内给予7周龄雌性C57BL/6N小鼠(各10只)，每24小时一次，共3次。在第3次给予后1.5小时将小鼠处死后解剖(dissect)。为了进行比较，给予PBS的组用作对照。

对处死后的每只小鼠都收集以下器官：股骨、胫骨、大脑、肺、心、肝、胸腺、脾、肾和皮肤。通过对大脑、肺、心、肝、胸腺、脾、肾和皮肤进行HE染色，观察到天然发生的损伤。

骨形态学测量

作为骨形态学测量结果，发现给予高剂量GST-RANKL结果导致单位骨量和骨小梁数量降至约50％。同时，发现破骨细胞数增加。另外，在低剂量给予的情况下没有观察到这样的降低(图15、图16和图17)。

通过μCT测定股骨形态。结果，在高剂量GST-RANKL给予组中观察到显著的骨减少(图18)。

对从各小鼠切取的大脑、肺、心、肝、胸腺、脾、肾和皮肤进行HE染色并观察。然而，在任何组中都未观察到异常发现和天然发生的损伤。

成骨细胞表面

作为给予高剂量GST-RANKL的结果，证实破骨细胞数增加，骨量降低和骨吸收。此外，当检查成骨细胞表面积时，发现它显著增加(图19)。这涉及因破骨细胞数增加和破骨细胞活化而增强的骨吸收能促进骨形成的现象，表明存在骨吸收和骨形成的偶联。人们认为，在给予高剂量GST-RANKL的小鼠中，位于破骨细胞上的、在骨微环境中被增加和活化的RANK作用于成骨细胞上的RANKL，从而传递信号，用于分化、增殖、成熟或钙化。

实施例11：给予合成肽引起的体内骨量增加试剂

用合成肽进行实验。合成肽D是含有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的环肽，由9个氨基酸组成并含有通过二硫键彼此结合的2个半胱氨酸残基。已经报道合成肽D与RANKL结合(Aoki等，J Clin Invest116：1525，2006)。将合成肽溶于10％DMSO(Nacalai)/PBS中，浓度1mg/ml。

实验动物

C57BL/6CrjCrlj小鼠购自Oriental Bio Service。所用小鼠是C57BL/6CrjCrlj近亲交配小鼠，其特征是因衰老而引起的细胞免疫力降低削弱(weakened depression)。先将小鼠在温度23℃±3℃和湿度50％±30％的环境下饲养1周。光照时间是8:00-20:00。

实验期间，所有小鼠都饲喂CR-LPF(Oriental Yeast Co.，Ltd.)。

对照组(n＝5)和肽D处理组(n＝4)都笼养。

给药方法和周期

在8:00、14:00和20:00(每天3次)，皮下给予肽D，剂量为10mg/kg，共5天。将5％DMSO/PBS给予对照组。5天的给药完成后12小时，处死小鼠并放血。然后，自各小鼠收集股骨和胫骨。各小鼠的全血在室温下放置1小时，然后在5000rpm和4℃的条件下离心5分钟。将血清收集在新管中。各小鼠的股骨和胫骨用冷70％乙醇固定。

骨密度分析

对乙醇固定的各股骨进行单能X射线吸收测量(SXA)分析(DCS-600EX-IIIR DXA，对于动物，ALOKA)，测定骨密度、骨矿物质含量和骨表面积。将各骨的全长划分为20个区。测定各区的骨密度并分析肽在各区中的作用。

骨结构分析和骨小梁结构(trabecular structure)分析

使用外周定量计算机断层扫描(在下文缩写为pQCT)和微型计算机断层扫描(在下文缩写为μCT)进行骨结构分析。Scan-Xmate-A080(Comscantecno Co.，Ltd.)用于μCT，XCT-Research SA+(StratecMedizintechnik GmbH)用于pQCT。专用软件(3D-BON(RATOC))使用μCT数据，用于制备三维结构图像和骨小梁结构分析。另外，对于pQCT分析，测定骨密度在395mg/cm³以下的区域就是海绵骨，而测定骨密度在690mg/cm³以上的区域就是皮质骨。

对每天3次、共给予5天肽D(10mg/kg)的各股骨进行SXA分析，测定总骨矿物质含量、骨表面积和骨密度。结果，发现给予肽D导致骨矿物质含量增加和骨密度显著增加(p＜0.05vs对照组)(图20A～图20C)。此外，作为SXA20分段分析对各区骨密度的测定结果证实，在自股骨远端的第6区至第9区中骨密度的显著增加(p＜0.05vs对照组)(图21)。另外，作为pQCT对股骨密度分析结果，在位于距离股骨远端5mm的区域中证实皮质骨密度的显著增加(p＜0.05vs对照组)(图22A)。作为厚度测定结果，发现外膜周的周长(periadventitialcircumference)、外膜内的周长(endoadventitial circumference)、骨矿物质含量和区内皮质骨骨表面积、内膜周长(intimal circumference)缩短，表明皮质骨的量向内增加(图22B)。

同时，对位于生长板附近的海绵骨中丰富的干骺端区(metaphyseal region)进行μCT三维结构分析。结果发现在给予肽D后，在位于距离股骨远端2mm位置的海绵骨含量增加(图23)。因此，通过μCT，对海绵骨区进行骨小梁结构测定。结果，发现海绵骨的BV/TV和骨小梁宽度增加(图24A～图24C)。

对于肽D对骨的作用而言，根据μCT的骨小梁结构测定结果，证实了骨吸收抑制作用，尽管观察到微弱作用。然而，作为给予仅5天的结果，肽在干骺端区引起皮质骨骨密度增加的原因，尚不能用上述骨吸收的微弱抑制来解释。结果表明肽具有骨形成作用。

实施例12：骨形态学测量

在将合成肽D给予小鼠的实施例11的实验中，在开始给予合成肽D后第1天和第4天，将与2％碳酸(hydrogen carbonate)/乙醇水溶液混合的钙黄绿素(Nacalai)经腹膜内给予各组各小鼠，剂量为0.01mL/g(体重)，用于钙黄绿素标记。在从处死的各小鼠收集到的股骨中，将位于距离乙醇固定的股骨远端5mm的区域包埋在甲基丙烯酸甲酯(MMA)树脂中，从而制备未脱钙标本。该区与以下区相同：在实施例11的肽D处理组中，作为SXA分析结果，证实所述区的骨密度显著增加。标本进行甲苯胺蓝染色，然后测定类骨质表面积、成骨细胞表面积、骨钙化表面积、钙化率、骨形成率等。结果，在肽D处理组中观察到钙化率和骨形成率增加(图25A和图25B)。对肽D处理组进行SXA分析和pQCT分析，证实皮质骨密度显著增加。这可能是因为，作为给予肽的结果，钙化率和骨形成率在体内增加，引起皮质骨密度增加。

实施例13：对肽D引起ALP活性增强的作用机制的分析(信号分子的磷酸化)

将与10％FBS+αMEM(SIGMA)混合的MC3T3-E1细胞接种在6孔板(7.5×10⁴细胞/孔)上。12小时后，从中去除培养基并向其中加入含有200μM肽D或200ng/ml BMP-2的培养基。在相关附图所示的各时间点去除培养基。将PBS加入到细胞中，用刮器(Falcon)收集细胞。通过于4℃在1200rpm离心5分钟得到细胞沉淀。将RIPA缓冲液(100μL)加入到所收集的沉淀中，用于细胞膜的溶解。此外，所得物在4℃在14500rpm条件下离心25分钟。收集上清液作为细胞提取物。一部分细胞提取物用于定量测定蛋白质浓度，使用BCA蛋白质测定试剂盒(PIERCE)。对于SDS-PAGE，将相当于细胞提取物1/4量的样品缓冲液(Fermentas)加入其中，再在95℃加热5分钟。将所制备的7.5μg或10μg样品上样到10％聚丙烯酰胺凝胶(BioRad)上，在170V电泳1小时。电泳后，在80mA进行40分钟，将电泳样品转移到PVDF膜(Millipore)上。将膜在封闭液(Nacalai)中在室温下振摇1小时，然后将第一抗体加入其中，接着在室温下振摇1小时，再在4℃振摇12小时。除去第一抗体溶液后，将膜洗涤3次，接着在含有第二抗体的封闭液中，在室温下振摇1小时。除去第二抗体溶液后，将膜洗涤3次。用ECL plus(GE Healthcare Bioscience)进行检测。

另外，如下给出第一抗体和第二抗体的组合。

(1)第一抗体：磷酸化p38抗体(细胞信号转导)；第二抗体：HRP缀合的山羊抗兔IgG(Santa Cruz)

(2)第一抗体：p38抗体(Santa Cruz)；第二抗体：HRP缀合的山羊抗小鼠IgG1(SouthernBiotech)

(3)第一抗体：β-肌动蛋白抗体(Santa Cruz)；第二抗体：HRP缀合的山羊抗兔IgG(Santa Cruz)

(4)第一抗体：GSK3α/β抗体(Santa Cruz)；第二抗体：HRP缀合的山羊抗小鼠IgG(SIGMA)

(5)第一抗体：磷酸化GSK3α/β抗体(细胞信号转导)；第二抗体：HRP缀合的山羊抗小鼠IgG(SIGMA)

(6)第一抗体：磷酸化smad1/5/8(细胞信号转导)；第二抗体：HRP缀合的山羊抗兔IgG(Santa Cruz)。

通过蛋白质印迹检测涉及主要信号转导途径的MAP激酶p38磷酸化，BMP-2和PTH作为已知的骨形态发生因子正是通过该途径而诱导骨形成。结果，在加入肽D后12小时可检测到显著的p38磷酸化(图26)。另外，也可检测到在加入肽D后短时间内发生p38磷酸化。然而，未观察到显著变化(图27)。同时，在加入BMP-2作为对照后1小时，观察到p38磷酸化。

其次，通过蛋白质印迹检测用于信号转导途径的GSK3β磷酸化，Wnt正是通过该途径起到骨形态发生因子的作用。证实在加入肽D后1小时和3小时诱导GSK3β磷酸化(图28)。同样，在加入BMP-2作为对照后1小时和3小时观察到相似程度的GSK3β磷酸化。

此外，通过蛋白质印迹检测用于信号传递途径的Smad1/5/8磷酸化，BMP正是通过该途径起到骨形态发生因子的作用。结果显示在未受刺激的MC3T3-E1细胞中Smad发生磷酸化。在加入肽D后至少3小时内没有诱导Smad1/5/8磷酸化(图29)。同时，在加入BMP-2作为对照后3小时，观察到Smad1/5/8发生磷酸化。根据以上观点，加入肽D后至少在3小时内，发现Smad1/5/8的活化没有发生到与BMP-2活化相当的程度。然而，在加入肽D后12小时观察到显著的p38磷酸化，其程度大于在加入BMP-2后1小时所观察到的磷酸化。因此表明肽D使用的信号明显不同于BMP-2所用的信号。同时，在加入肽D后1小时和3小时观察到GSK3β磷酸化，其程度相当于加入BMP-2所观察到的那样，表明肽D部分地使用类似于BMP-2所用的信号。

实施例14：对由肽D引起的ALP活性增强机制的分析(抑制剂作用)

将与10％FBS+αMEM(SIGMA)混合的MC3T3-E1细胞接种在96孔板(1.5×10⁴细胞/孔)上。12小时后，从中去除培养基并向其中加入含有SB203580p38抑制剂(Calbiochem)的培养基。此外，在1小时后，向其中加入200μM肽D或100ng/ml BMP-2，然后培养5天。然后，按照实施例1所述的方法进行ALP活性测定。结果，以SB203580浓度依赖性方式抑制由肽D引起的ALP活性增强。在浓度为1μM时观察到显著抑制，在浓度为10μM时观察到完全抑制(图30)。另一方面，在BMP-2用作对照的情况下，在浓度为1μM时未观察到对ALP活性增强的显著抑制，在浓度为10μM时则观察到微弱抑制效果。

同样，加入作为Wnt拮抗剂的rhDkk-1(R&D)，浓度为0.25μg/ml、0.5μg/ml和1μg/ml。1小时后，向其中加入200μM肽D，然后培养5天。然后，按照实施例1所述的方法进行ALP活性测定。结果，发现Dkk-1虽然弱但显著地以浓度依赖性方式抑制ALP活性增强(图31)。

另外，如上所述，加入作为BMP拮抗剂的BMPR-IA(R&D)，浓度为0.25μg/ml和1μg/ml。1小时后，向其中加入200μM肽D或200ng/ml BMP-2，然后培养5天。然后，按照实施例1所述的方法进行ALP活性测定。结果，发现BMPR-IA显著抑制由肽D和BMP-2引起的ALP活性增强(图32)。根据以上结果，肽D的作用很可能依赖于BMP诱导或细胞稳定而自发产生的BMP。

实施例15：对由肽D(肽D和BMP-2的协同作用)引起的ALP活性增强机制的分析

为了检查肽D和BMP-2的协同效应，使用C2C12细胞进行ALP活性测定，在这类细胞中，ALP活性增强的发生依赖于BMP-2的加入。将与5％FBS+αMEM(SIGMA)混合的C2C12细胞接种在96孔板(1×10⁴细胞/孔)上。6小时后，从中去除培养基。向其中分别加入含有50μM肽D的培养基、含有100ng/ml BMP-2的培养基、含有200ng/ml BMP-2的培养基以及含有50μM肽D和100ng/ml BMP-2组合的培养基后培养6天。按照实施例1所述的方法进行ALP活性测定。结果，在仅含50μM肽D的培养基的情况下，未观察到ALP活性增强作用。BMP-2以浓度依赖性方式增强ALP活性。同时，与只存在BMP-2的培养基相比，在含有50μM肽D和100ng/mL BMP-2的培养基的情况下，证实ALP活性水平增加至少5倍(图33)。这些结果支持以下论点：实施例14所述的肽D的作用很可能依赖于BMP诱导或细胞稳定而自发产生的BMP。源自成肌细胞株的C2C12细胞不同于源自成骨细胞株的MC3T3-E1细胞，因此在常规培养条件下，C2C12细胞中的ALP活性水平极低。当C2C12细胞在加入BMP-2的情况下培养时，则会如本实施例所示地增强ALP活性，结果导致细胞分化成为成骨细胞。在没有BMP2的情况下，认为C2C12细胞不响应肽D。同时，如以上实施例所示，MC3T3-E1细胞表现出ALP活性的显著增加，甚至在只加入肽D的情况下。这强烈表明肽D的作用依赖于BMP诱导或MC3T3-E1细胞中稳定而自发产生的BMP。

此外，也检查了BMP-2和肽D对MC3T3-E1细胞的协同作用。将与10％FBS+αMEM(SIGMA)混合的MC3T3-E1细胞接种在96孔板(1.5×10⁴细胞/孔)上。12小时后，从中去除培养基，在加入30ng/mLBMP-2和150μM肽D的情况下进行ALP活性测定。结果，肽D和BMP-2表现出对MC3T3-E1细胞ALP活性增强的附加作用(图34)。

对ALP活性而言，BMP-2和肽D对C2C12细胞和MC3T3-E1细胞的协同效应如图33所示。另外，已经报道，在C2C12细胞中RANKL表达水平增加，当将BMP-2加入到细胞中时(Fujita等，Molecular Cancer 6：71，2007)。因此，当加入BMP时，通过RT-PCR证实RANKL表达。

将C2C12细胞接种在96孔板(5×10³细胞/孔)上。在细胞贴壁后，将BMP-2加入其中，使其浓度为100ng/mL。36小时后，将TRIZOL溶液(Invitrogen)(84μL)加入到各孔中，进行细胞裂解，由此进行RNA提取。每组从6孔收集所得物，制备样品。将氯仿(Wako)(0.1mL)加入到样品中，剧烈地上下颠倒而混合，然后于4℃在12000×g离心15分钟。将上清液收集到新管内。将异丙醇(Nacalai)(0.25mL)加入其中，然后上下颠倒而混合。将所得物在室温下放置10分钟，于4℃在12000×g离心10分钟。从中去除上清液。然后，将70％乙醇(1mL)加入到其中，于4℃在12000×g离心5分钟。再次从中去除上清液。测定其RNA浓度，用2μg所得物进行RT-PCR。使用ThermoScriptRT-PCR系统(Invitrogen)和随机引物进行RT-PCR。cDNA合成之后，使用小鼠RANKL特异性引物进行PCR。为了标准化，使用小鼠GAPDH特异性引物进行PCR。所用PCR引物序列如下所示。用ExTaq^TM Hot Start Version(Takara Bio Inc.，Shiga，Japan)，在下述条件下进行PCR。

使小鼠RANKL经历初次热变性，在94℃2分钟，接着是35次循环，在94℃20秒，60℃20秒和72℃40秒，然后是72℃10分钟的延伸反应。使GAPDH经历初次热变性，在95℃3分钟，接着是25次循环，在95℃10秒，60℃15秒和68℃1分钟，然后是68℃10分钟的延伸反应。

mRANKL-F：5’-GGCAAGCCTGAGGCCCAGCCATTT-3’(SEQ ID NO：17)

mRANKL-R：5’-GTCTCAGTCTATGTCCTGAACTTT-3’(SEQ ID NO：18)

mGAPDH-F：5’-CACCATGGAGAAGGCCGGGG-3’(SEQ ID NO：19)

mGAPDH-R：5’-GACGGACACATTGGGGGTAG-3’(SEQ ID NO：20)

结果，证实在C2C12细胞中RANKL表达水平增加，当将BMP-2加入到细胞中时(图35)。结果表明，BMP-2作用于C2C12细胞，促进RANKL表达，因而支持肽D对RANKL的作用。

实施例16：对肽D和肽E的活性比较

在肽D上取代一个氨基酸，制备肽E(SEQ ID NO：16)。测定TRAP活性和ALP活性，比较肽D和肽E对引起破骨细胞分化和成骨细胞分化的作用。将与10％FBS+αMEM(SIGMA)混合的RAW264细胞接种在96孔板(2×10³细胞/孔)上。证实细胞贴壁后，将培养基更换为含有10nM GST-RANKL(Oriental Yeast Co.，Ltd.)的10％FBS+αMEM。将肽D和肽E分别加入其中，浓度为25μM、50μM、100μM和200μM，然后培养4天。培养终止后，将100μL丙酮/乙醇加入到各孔中，进行细胞固定，然后通风干燥30分钟。

为了得到浓度为1.5mg/mL的TRAP溶液缓冲液，使用50mM柠檬酸缓冲液并加入0.2M酒石酸钠溶液(体积为柠檬酸缓冲液的1/10)调节磷酸对硝基苯酯(Nacalai)，制备溶液。将所得TRAP溶液缓冲液加入到各孔中，加入量为100μL，再在37℃孵育45分钟。然后，将1N NaOH溶液(50μL)加入其中，终止反应。按照实施例1同样的方式，使用微量培养板阅读器(BMG Labtech)在405nm处测定各孔的OD值。

此外，比较肽D和肽E对MC3T3-E1细胞中的ALP活性增强作用。肽D和肽E的使用浓度为25μM、50μM、100μM和200μM，在实施例14所述的条件下进行培养，然后按照实施例1所述的方法测定ALP活性。

结果，发现肽D和肽E都抑制TRAP活性并以浓度依赖性方式增强ALP活性(图36和图37)。对于TRAP活性而言，与肽E相比，在浓度为100μM和200μM时，肽D表现出显著抑制作用(图36)。另外，对于ALP活性而言，与肽E相比，在浓度为50μM和100μM时，肽D表现出显著增强作用(图37)。当在达到几乎相同作用的浓度下比较肽D和肽E时，发现单个氨基酸取代导致TRAP活性抑制作用降至原先水平的一半。同样，ALP活性增强作用降至原先水平的约1/4。已经知道，这样的单个氨基酸取代导致肽D对sRANKL的亲和力水平降至原先水平的约1/3(Aoki等，J Clin Invest 116：1525，2006)。上述结果表明，肽D作用于RANKL，从而表现出对破骨细胞中TRAP活性的中和作用并表现出对成骨细胞中ALP活性的促进作用。

实施例17：对由肽D与RANKL敲减引起的ALP活性增加机制的分析

BMP-2和肽D对C2C12细胞的协同效应如图33所示。在这一点上，当加入BMP-2时，证实C2C12细胞中RANKL表达水平增加(图35)。然后，使用RNAi stealth，在MC3T3-E1细胞中进行RANKL敲减，以便检查肽D对ALP活性的增强作用和RANKL敲减的影响。将OPTiMEM(Invitrogen)(20μL)和RNA-stealth select(tnfrsf11)(Invitrogen)(1.2pmol)在各孔中轻轻混合。5分钟后，将LipofectamineRNAiMAX(Invitrogen)(0.2μL)加入其中，将各所得物在室温下放置20分钟。此外，将MC3T3-E1细胞接种到各孔(4×10³细胞)中，然后在CO₂培养箱中培养48小时。从中去除培养液，将含有200μM肽D或200ng/ml BMP-2的αMEM加入其中，再培养5天。然后，按照实施例1所述的方法进行ALP活性测定。另外，对于3类RANKL(TNFRSF11)(KD)阴性对照，使用Stealth RNAi阴性通用对照(Invitrogen)进行类似实验。回收必要量的细胞，并通过实施例7所述的方法从中提取mRNA。然后，通过RT-PCR，使用SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示引物，证实RANKL敲减。当用对照1和对照2作为阴性对照来分别比较KD1和KD2时，发现RANKL mRNA水平以特定方式显著降低，而GAPDH mRNA水平却不受影响(图38)。在RANKL敲减组(包括KD1和KD2两种情况)中，当加入肽D时，ALP活性增强程度显著降低。这表明RANKL起到肽D受体的作用(图38)。另外，在MC3T3-E1细胞中，仅由BMP-2引起的ALP活性增强并不受RANKL敲减的影响。

这些结果表明，肽D作用于成骨细胞和能分化成成骨细胞的细胞(例如成骨细胞前体细胞、间充质干细胞、基质细胞和成肌细胞)，从而增强BMP的作用或与BMP联合起作用，因而促进成骨细胞分化。另外，也表明在某些细胞例如C2C12细胞中，BMP促进RANKL表达，从而与肽D联合起作用。

实施例18：合成肽D的纯化方法对ALP活性增加的影响

一般而言，纯化合成肽D含有三氟乙酸盐(TFA)。因此，已经考虑到合成肽D浓度增加将会引起对细胞的损伤。就以上观点而言，合成肽D中的三氟乙酸盐用乙酸盐或盐酸盐来替代。所得产物用于下述实验，以使所获得的肽表现出低毒性和高ALP活性。用大肠杆菌制备的BMP-2(R&D)和未用盐进行任何替代的合成肽D(50μM和150μM)用作阳性对照。

将与10％FBS+αMEM(SIGMA)混合的MC3T3-E1细胞(小鼠成骨细胞前体细胞)接种在96孔板(2×10⁴细胞/孔)上。细胞贴壁后，从中除去培养基，然后在加入50μM和150μM肽D(乙酸盐和盐酸盐)的情况下进行ALP活性测定。加入用大肠杆菌制备的50ng/mL BMP-2(R&D)、由CHO细胞产生的BMP-2(R&D)、由NS0细胞产生的BMP-4(R&D)和合成肽D(50μM和150μM)(TFA盐)，作为阳性对照。另外，CHO细胞表达的BMP-2的ED50值为40-200ng/mL。大肠杆菌表达的BMP-2的ED50值为0.3-1.0μg/mL。在加入各因子(the individualfactors)后第5天，除去培养上清液，使用实施例1所述的方法进行ALP活性测定。结果，在MC3T3-E1细胞中，呈乙酸盐形式的肽表现出ALP活性增强作用的最高水平(图39A)。同时，在呈盐酸盐形式的肽D情况下，却未观察到这样的高活性水平。如上所述，发现所用盐的差异影响了这样的活性，甚至当合成肽含有共有氨基酸序列时。

其次，检查了呈乙酸盐形式的合成肽D和BMP-2对ALP活性的协同效应。将与10％FBS+αMEM(SIGMA)混合的MC3T3-E1细胞(小鼠成骨细胞前体细胞)接种在96孔板(2×10⁴细胞/孔)上。当发生细胞贴壁后，从中除去培养基，在5ng/mL BMP-2(由CHO细胞产生)与6.25μM、12.5μM、25μM、50μM和100μM合成肽D混合的情况下测定ALP活性。在加入各因子后第5天，除去培养上清液，按照实施例1所述的方法进行ALP活性测定。结果，证实了ALP活性的增加，并且它们依赖于呈乙酸盐形式的合成肽D的剂量(图39B)。

在实验结束时，也检查了呈乙酸盐形式的合成肽D与BMP-4(R&D)的协同效应。将与10％FBS+αMEM(SIGMA)混合的MC3T3-E1细胞(小鼠成骨细胞前体细胞)接种在96孔板(2×10⁴细胞/孔)上。当发生细胞贴壁后，从中除去培养基，再将100μM呈乙酸盐形式的合成肽D加入到2ng/mL BMP-4中。在加入各因子后第5天，除去培养上清液，按照实施例1所述的方法进行ALP活性测定。

作为同时加入合成肽D和BMP-4的结果，证实ALP活性显著增加。证实呈乙酸盐形式的合成肽D不仅在BMP-2的情况下，而且在BMP-4的情况下都表现出协同效应(图39C)。

上述结果表明，在合成肽D纯化时，使用乙酸盐、而非引起细胞损伤的三氟乙酸盐(TFA)，可极大地诱导ALP活性。同样，对于ALP活性增强能力，使用替代为乙酸盐的合成肽D组合可表现出协同效应，而且这样的情况不仅包括BMP-2，而且包括BMP-4。因此，在后续实验中决定使用呈乙酸盐形式的肽D。

实施例19：对RANKL抗体的ALP活性增强机制的分析(RANKL抗体和BMP-2的协同效应)

为了实验，使用单克隆mRANKL抗体((A)：克隆88227(R&D)；和(B)：克隆12A668(ALEXIS))、对照抗体(Oriental Yeast Co.，Ltd.)和单克隆mRANKL抗体#22(克隆IKK22/5)和#36(克隆IKK36/12)。抗体#22和抗体#36是由Ko Okumura教授(School of Medicine，JuntendoUniversity)转让的。这些抗体描述于Biochemical and BiophysicalResearch Communication 2006；347，124-132。使用替代为乙酸盐的合成肽D。由哺乳动物细胞(CHO细胞)(R&D)产生的BMP-2(用于C2C12细胞)和由大肠杆菌表达的BMP-2(R&D)(用于小鼠成骨细胞)用作BMP-2，用于添加。制造商的使用说明介绍说，由哺乳动物细胞产生的BMP-2的活性比由大肠杆菌产生的BMP-2的活性强约10倍。在加入各因子之后第5天除去培养上清液，然后按照实施例1所述的方法进行ALP活性测定。

为了检查单克隆RANKL抗体和BMP-2的协同效应，使用C2C12细胞进行ALP活性测定，在这类细胞中，对ALP活性增强的诱导依赖于BMP-2的加入。将与5％FBS+αMEM(SIGMA)混合的C2C12细胞接种在96孔板(1×10⁴细胞/孔)上。6小时后，从中去除培养基。向其中分别加入含有0.3μg/mL单克隆RANKL抗体的培养基、含有50ng/ml BMP-2(在CHO细胞中表达(R&D))的培养基以及含有单克隆RANKL抗体与50ng/ml BMP-2组合的培养基。在加入各因子后第6天，从中除去各培养上清液，然后按照实施例1所述的方法进行ALP活性测定。结果，在分别只含0.3μg/mL单克隆抗体A、B或#22的每种培养基中，观察到显著的ALP活性增强作用。另外，在分别含有单克隆抗体A或B并加入BMP-2的每种培养基中观察到ALP活性的显著增加(图40)。

用小鼠成骨细胞作进一步检查。将与10％FBS+αMEM(SIGMA)混合的小鼠成骨细胞接种在96孔板(8×10³细胞/孔)上。当发生细胞贴壁后，从中除去培养基，然后在0.3-3μg/mL RANKL抗体的情况下或在RANKL抗体与50ng/mL BMP-2(在大肠杆菌中表达(R&D))混合的情况下，进行ALP活性测定。在加入各因子后第4天，从中除去各培养上清液，然后按照实施例1所述的方法进行ALP活性测定。结果，在小鼠成骨细胞中，使用浓度为3μg/mL的单克隆抗体A和浓度为0.3μg/mL的单克隆抗体B，证实ALP活性的少量而显著的增加。在对照抗体(Oriental Yeast Co.，Ltd.)用作阴性对照的情况下，未观察到这样的作用。另外，在单克隆抗体#36和#22的情况下，在浓度为0.3μg/mL和3μg/mL时，证实ALP活性的显著增加(图41)。此外，在所有上述单克隆抗体的情况下，证实了BMP-2和单克隆RANKL抗体对ALP活性的协同作用(图42)。如上所述，在小鼠成骨细胞中，用于实验的所有抗RANKL单克隆抗体都表现出ALP活性增强作用，尽管增强程度因抗体的不同而异。另外，抗体表现出与BMP-2的协同ALP活性增强作用。

实施例20：GST-RANKL的作用与肽D(乙酸盐)和BMP-2协同效应的关系

将BMP-2和呈乙酸盐形式的肽D同时加入到MC3T3-E1细胞中，导致ALP活性增强的协同效应。检查了加入GST-RANKL对这样的ALP活性增强的影响。

使用实施例19所述的RANKL抗体。所用的GST-RANKL和GST是由Oriental Yeast Co.，Ltd生产的。另外，使用BMP-2(由CHO细胞产生)(R&D)。使用替代为乙酸盐的合成肽D。

将与10％FBS+αMEM(SIGMA)混合的MC3T3-E1细胞(小鼠成骨细胞前体细胞)接种在96孔板(2×10⁴细胞/孔)上。当发生细胞贴壁后，从中去除培养基。为了更换，将含有100μM呈乙酸盐形式的肽D的培养基、含有100μM呈乙酸盐形式的肽D与5ng/mL BMP-2混合的培养基以及含有肽D与BMP-2混合物的培养基(其中已加入100nM GST-RANKL或GST)加入其中。在加入各因子后第5天，除去各培养上清液，然后按照实施例1所述的方法进行ALP活性测定。结果，在MC3T3-E1细胞中发现GST-RANKL能显著抑制肽D(乙酸盐)和BMP-2对ALP活性增强的协同效应(图43)。同时，在加入GST的组中未观察到显著程度的抑制。这些结果表明，肽D作用于MC3T3-E1细胞上表达的RANK，从而引起ALP活性增强。认为GST-RANKL对细胞膜上的RANKL具有拮抗性，因此抑制肽D的活性。

实施例21：在肽D或RANKL抗体处理的小鼠成骨细胞中的增殖反应

在实施例19和实施例20中描述了可观察ALP活性增强作用，当同时加入肽D或RANKL抗体和BMP-2时。检查了能表现出与BMP-2有协同效应的肽D和RANKL抗体，看它们在小鼠成骨细胞中是否会诱导增殖反应。

使用替代为乙酸盐的合成肽D。另外，使用BMP-2(在CHO细胞中产生)(R&D)。

将与10％FBS+αMEM(SIGMA)混合的小鼠成骨细胞接种在96孔板(2×10³细胞/孔)上。当发生细胞贴壁后，从中除去培养基。将含有100μM肽D(乙酸盐)的培养基、含有实施例19所述的任一种RANKL抗体(3μg/mL)的培养基和含有任一种上述因子并与5ng/mLBMP-2混合的培养基分别加入其中。72小时培养后，将WST-1(Roche)加入其中，加入量为各培养基的1/10，再在37℃孵育3小时。然后，使用微量培养板阅读器(BMG Labtech)测定各孔的OD值(450nm)(参考波长：595nm)。结果发现，无论BMP-2是否存在，肽D和RANKL抗体B都能促进小鼠成骨细胞增殖(图44)。然而，肽D表现出微弱作用，而其它RANKL抗体(#22、#36和A)则不表现出增殖促进作用。

根据以上所述，发现存在着能促进小鼠成骨细胞增殖的抗RANKL单克隆抗体和不能促进小鼠成骨细胞增殖的抗RANKL单克隆抗体，这取决于这些抗体所识别的表位的差异。同时，如实施例19所述，发现甚至是不能促进小鼠成骨细胞增殖的抗RANKL单克隆抗体在小鼠成骨细胞中也可表现出ALP活性增强作用；也就是说，分化促进作用。简而言之，可通过适当选择能识别不同表位的抗RANKL单克隆抗体来引起成骨细胞的增殖或分化。

实施例22：肽D对MC3T3-E1细胞的作用机制的分析(DNA微阵列)

将与10％FBS+αMEM(SIGMA)混合的MC3T3-E1细胞接种在10cm皿(2×10⁵细胞/孔)上。12小时后，从中除去培养基。将含有200μM肽D(乙酸盐)或150ng/ml BMP-2(在大肠杆菌中产生(R&D))的培养基加入其中。在12小时和96小时除去部分培养基，在此时将TRIZOL溶液(Invitrogen)(3mL)加入到各孔中，进行细胞裂解。然后，通过实施例15所述的方法进行总RNA的提取。对每次提取的总RNA(2μg)进行DNA微阵列分析(Mouse Genome 4302.0Affymetrix)。另外，使用基因芯片扫描仪3000(GeneChip Scanner 3000，Affymetrix 690036)进行扫描，并用基因芯片操作软件(Gene Chip Operating Software，1.4版)进行数字化。

结果，在加入肽D后12小时，发现IRS-1、IGF-1、FGF受体2、PDGF受体β、PDGF受体α、CTGF和I型胶原蛋白α1链和I型胶原蛋白α2链的基因表达水平显著增加(图45)。此外，在96小时后，IGF-2、ALP、BMP-4、OC(骨钙蛋白)、FGF2、PDGFc、PDGFα和PDGFβ的基因表达水平显著增加(图46)。已知I型胶原蛋白、ALP和骨钙蛋白都是成骨细胞标记。在实施例7中，肽D引起人间充质干细胞中I型胶原蛋白和ALP的基因表达水平增加。然而，同样在MC3T3-E1细胞中，发现这两个基因的表达水平也增加。此外，已知作为晚期成骨细胞分化标记的骨钙蛋白(OC)基因的表达水平急剧增加。因此，认为肽D使MC3T3-E1细胞分化成为成骨细胞。

实施例23：根据通过RT-PCR的DNA阵列分析的证实

使用DNA微阵列，在发现表现出增加的表达信号的基因中，对已知作为成骨细胞标记的碱性磷酸酶(ALP)、I型胶原蛋白(Col1)和骨钙蛋白(OC)的基因进行RT-PCR，用于证实。对实施例22中收集的各基因的总RNA(2μg)进行RT-PCR。用ThermoScript RT-PCR System(Invitrogen)和随机引物进行RT-PCR。

cDNA合成后，使用小鼠碱性磷酸酶(mALP)、小鼠I型胶原蛋白α1(mColI)和小鼠骨钙蛋白(mOC)的特异性引物进行PCR。为了标准化，使用小鼠GAPDH特异性引物进行PCR。所用的PCR引物序列如下所示。用Ex Taq^TM Hot Start Version(Takara Bio Inc.，Shiga，Japan)，在下述条件下进行PCR。使碱性磷酸酶(mALP)经历初次热变性，在95℃3分钟，接着是28次循环，在95℃10秒，60℃15秒和68℃1分钟，然后是68℃10分钟的延伸反应。使I型胶原蛋白α1(mColI)经历初次热变性，在93℃3分钟，接着是20次循环，在94℃30秒，58℃30秒和72℃15秒，然后是72℃10分钟的延伸反应。使骨钙蛋白(mOC)经历初次热变性，在95℃3分钟，接着是28次和30次循环，在94℃30秒，58℃30秒和72℃15秒，然后是72℃10分钟的延伸反应。使GAPDH经历初次热变性，在95℃3分钟，接着是20次循环，在94℃10秒，58℃15秒和68℃1分钟，然后是68℃10分钟的延伸反应。

PCR引物序列

mALP-F：5’-CCAAGCAGGCTCTGCATGAA-3’(SEQ ID NO：21)

mALP-R：5’-GCCAGACCAAAGATGGAGTT-3’(SEQ ID NO：22)

mOC-F：5’-TCTGACAAAGCCTTCATGTCC-3’(SEQ ID NO：23)

mOC-R：5’-AAATAGTGATACCATAGATGCG-3’(SEQ ID NO：24)

mCol1-F：5’-CCTGGTAAAGATGGTGCC-3’(SEQ ID NO：25)

mCol1-R：5’-CACCAGGTTCACCTTTCGCACC-3’(SEQ ID NO：26)

mGAPDH-F：5’-CACCATGGAGAAGGCCGGGG-3’(SEQ ID NO：19)

mGAPDH-R：5’-GACGGACACATTGGGGGTAG-3’(SEQ ID NO：20)

对各反应溶液的一部分进行琼脂糖凝胶电泳，然后用溴化乙锭溶液染色。结果，就DNA微阵列分析结果而言，证实肽D和BMP-2引起ALP、Col1和OC的基因表达水平显著增加(图47A)。将各对照的基因表达水平指定为1，将各表达强度数字化并创建图。结果，与通过DNA微阵列分析证实的结果相比，更能明确地观察到基因表达水平的显著增加(图47B)。

因此，也根据通过RT-PCR而观察到的基因表达水平的变化，证实肽D能引起MC3T3-E1细胞分化成为成骨细胞。

实施例24：给予合成肽，对骨形成标记进行体内分析试剂

在本实验中使用替代为乙酸盐的合成肽D。将合成肽D溶于PBS中，浓度1mg/mL。将PBS给予对照组。

实验动物

C57BL/6CrjCrlj小鼠购自KITAYAMA LABES Co.，Ltd。所用小鼠是C57BL/6CrjCrlj近亲交配小鼠，其特征是它们经历因衰老而引起的细胞免疫力降低削弱。先将小鼠在温度23℃±3℃和湿度50％±30％的环境下饲养1周。光照时间是8:00-20:00。

实验期间，所有小鼠都饲喂MF(Oriental Yeast Co.，Ltd.)。

对照组(n＝6)和肽D处理组(n＝7)都笼养。

给药方法和周期

在8:00、14:00和20:00(每天3次)，皮下给予合成呈乙酸盐形式的肽D，剂量为10mg/kg，共5天。将PBS给予对照组。5天的给药完成后12小时，处死小鼠并放血。然后，自各小鼠收集股骨和胫骨。各小鼠的全血在室温下放置1小时，然后在5000rpm和4℃的条件下离心5分钟。将血清收集在新管中。各小鼠的股骨和胫骨用冷70％乙醇固定。从各胫骨上小心除去肌肉等。然后，各胫骨用PBS洗涤并用剪刀剪切成1mm的碎片，然后用液氮冷冻。将TRIZOL溶液(Invitrogen)(1mL)加入到各冷冻胫骨中，然后用Polytron匀浆。按照实施例7所述的方法进行总RNA的提取。将每种所得的总RNA样品溶于DEPC水(50μL)中。按照实施例7所述的方法，对自各小鼠提取的总RNA(500ng)进行RT-PCR。使用ThermoScript RT-PCR System(Invitrogen)和随机引物进行RT-PCR。

cDNA合成后，正如实施例23的情况一样，使用小鼠碱性磷酸酶(mALP)、小鼠I型胶原蛋白αI链(mCollagen αI)和小鼠骨钙蛋白(mOC)的特异性引物进行PCR。为了标准化，使用小鼠GAPDH特异性引物进行PCR。PCR条件与实施例23所用的相同。变性循环次数为：对于mOC，23次循环；对于mCollagen αI，20次循环；和对于mALP，28次循环。在mGAPDH数据的情况下，次数为23次循环。对PCR反应后所得样品进行1％琼脂糖凝胶电泳。使用溴化乙锭，在紫外光下证实特定条带的形成。所得图像用CSAnalyzer分析并根据GAPDH表达水平而标准化。结果，在肽D处理组中观察到各因子表达水平的增加(图48)。根据以上所述，在小鼠骨组织的情况下，也证实了给予肽D引起成骨细胞分化标记基因的表达。

实施例25：肽D对小鼠胫骨的作用机制的分析(DNA微阵列)

自实施例24所述各小鼠胫骨中提取的总RNA(2μg)，用于DNA微阵列(每组：n＝2)。按照标准方法进行DNA微阵列分析(MouseGenome 4302.0Affymetrix)。另外，使用基因芯片扫描仪3000(Affymetrix 690036)进行扫描，并用基因芯片操作软件(1.4版)进行数字化。结果发现，与标准样品相比，在肽D处理组的小鼠胫骨样品中，OC、ALP、I型胶原蛋白α2链(CoL1α2)、血小板衍生生长因子C(PDGFc)肽、血小板衍生生长因子受体(PDGFRβ)和胰岛素样生长因子(IGF-1)表现出明显更高的信号(图49)。不仅在加入肽D的小鼠成骨细胞前体细胞中，而且在给予肽D的小鼠胫骨中，都证实骨形态发生因子(例如OC和ALP)的增加，表明肽D在体内也可增强骨形成。

实施例26：证实2：通过RT-PCR的DNA阵列分析

按照实施例23，对ALP、CoL1和OC进行RT-PCR，使用DNA微阵列得到证实数据。为了得到更详细证实数据，对各种不同生长因子及其受体进行RT-PCR，从而通过DNA微阵列分析，使用得自实施例23的MC3T3-E1细胞的各组cDNA，确认信号增加。

按照实施例23所述的方法合成各cDNA。合成后，使用小鼠骨形态发生蛋白4(mBMP-4)、小鼠结缔组织生长因子(mCTGF)、小鼠血小板衍生生长因子(mPDGFc肽)及其受体(mPDGFRβ)、小鼠成纤维细胞生长因子2(mFGF2)及其受体(mFGFR2)、胰岛素样生长因子2(mIGF-2)和胰岛素受体底物(mIRS-1)的特异性引物进行PCR。为了标准化，使用小鼠GAPDH特异性引物进行PCR。所用的PCR引物序列如下所示。用Ex Taq^TM Hot Start Version(Takara Bio Inc.，Shiga，Japan)，在下述条件下进行PCR。使BMP-4经历初次热变性，在95℃3分钟，接着是31次循环，在95℃10秒，58℃15秒和72℃30秒，然后是68℃10分钟的延伸反应。使CTGF经历初次热变性，在95℃3分钟，接着是31次循环，在95℃10秒，58℃15秒和72℃30秒，然后是72℃10分钟的延伸反应。使FGF2经历初次热变性，在95℃3分钟，接着是34次循环，在95℃10秒，58℃15秒和72℃30秒，然后是72℃10分钟的延伸反应。使FGFR2经历25次循环的热变性(95℃10秒，58℃15秒和72℃30秒)和72℃10分钟的延伸反应。使IGF-2经历31次循环的热变性(95℃10秒，58℃15秒和72℃30秒)和72℃10分钟的延伸反应。使PDGFc肽、PDGFRβ和IRS-1经历23次循环的热变性(95℃10秒，58℃15秒和72℃30秒)和72℃10分钟的延伸反应。使GAPDH经历初次热变性，在95℃3分钟，接着是20次循环，在94℃10秒，58℃15秒和68℃1分钟，然后是68℃10分钟的延伸反应。对各反应溶液的一部分进行2％琼脂糖凝胶电泳，然后用溴化乙锭溶液染色。

因此，根据DNA微阵列分析所得结果，使用MC3T3-E1细胞，证实加入肽D能引起IRS1、PDGFRβ、PDGFc、FGFR2、FGF2、CTGF、BMP-4和IGF-2的基因表达水平的显著增加，正如OC、ALP和Col1的情况一样(图50A)。将各对照的基因表达水平指定为1，将表达强度数字化并创建图。结果，与通过DNA微阵列分析证实的结果相比，更能明确地观察到IRS-1和PDGFRβ的基因表达水平的显著增加(图50B)。对于其它因子，得到与DNA微阵列分析的情况下所得到的类似的结果。

根据以上所述，认为肽D作用于成骨细胞，其方式使得由肽D刺激的成骨细胞自身产生细胞因子(例如PDGFRβ、PDGFc、IGF-1、IGF-2、FGF2、CTGF和BMP-4和一组生长因子)，并且还产生一组细胞因子的受体(例如PDGFRβ和FGFR2)和生长因子，导致以自分泌方式促进成骨细胞的分化、增殖和骨形成。生理上的反向信号从RANK通过RANKL而传递给与破骨细胞接触的成骨细胞，以自分泌/旁分泌方式引起链式反应。这不仅导致对接触破骨细胞的成骨细胞的分化、增殖和骨形成的促进作用，而且导致对存在于破骨细胞附近的成骨细胞的促进作用。

PCR引物序列

mBMP-4-F：5’-ATGAGGGATCTTTACCGGCT-3’(SEQ ID NO：27)

mBMP-4-R：5’-TTTATACGGTGGAAGCCCTG-3’(SEQ ID NO：28)

mCTGF-F：5’-AGTGTGCACTGCCAAAGATG-3’(SEQ ID NO：29)

mCTGF-R：5’-GGCCAAATGTGTCTTCCAGT-3’(SEQ ID NO：30)

mFGF2-F：5’-AAGCGGCTCTACTGCAAGAA-3’(SEQ ID NO：31)

mFGF2-R：5’-TCGTTTCAGTGCCACATACC-3’(SEQ ID NO：32)

mFGFR2-F：5’-CTTTGGCCTGGCCAGGGATATCAAC-3’(SEQ ID NO：33)

mFGFR2-R：5’-CCAACTGCTTGAATGTGGGTCTCT-3’(SEQ ID NO：34)

mIGF2-F：5’-CCCGCTGTTCGGTTTGCATAC-3’(SEQ ID NO：35)

mIGF2-R：5’-ACGGTTGGCACGGCTTGAAG-3’(SEQ ID NO：36)

mIRS1-F：5’-AGCGTAACTGGACATCACAGCAG-3’(SEQ ID NO：37)

mIRS1-R：5’-CGGTGTCACAGTGCTTTCTTGTTG-3’(SEQ ID NO：38)

mPDGFRβ-F：5’-GTCTGGTCTTTTGGGATCCTACTCT-3’(SEQ ID NO：39)

mPDGFRβ-R：5’-CTCCTCATCTACCTGCTGGTACT-3’(SEQ ID NO：40)

mPDGFc-F：5’-CTGATTCGGTACCTAGAGCCAGAT-3’(SEQ ID NO：41)

mPDGFc-R：5’-CTGTCCTCTTTAGCTCTTCCCGT-3’(SEQ ID NO：42)

mGAPDH-F：5’-CACCATGGAGAAGGCCGGGG-3’(SEQ ID NO：19)

mGAPDH-R：5’-GACGGACACATTGGGGGTAG-3’(SEQ ID NO：20)

实施例27：Fc融合肽的产生

使用EcoRV和BglII(TOYOBO)对pFUSE-hIgG1-Fc2表达载体(Invivogen)进行限制酶处理。使用1％琼脂糖凝胶(Wako)进行电泳。从凝胶上切下DNA片段，然后使用Mag Extractor(TOYOBO)对片段进行纯化。同时，对插入部分进行退火(95℃5分钟)并冷却至25℃(每次循环温度都降低1℃)，使用寡核苷酸PDF1-F(SEQ ID NO：43)、PDF1-R(SEQ ID NO：44)、PAF1-F(SEQ ID NO：45)和PAF1-R(SEQ IDNO：46)，从而合成了两种不同的双链DNA(PDF和PAF1)。制备PAF1(是含有SEQ ID NO：47所示氨基酸序列的肽A的插入DNA)作为PDF1的阴性对照，PDF1是含有肽D的插入DNA。载体经过限制酶处理，使用Ligation Mighty Mix(TAKARA)将两种不同插入序列在16℃连接1小时。将所得物的一部分(5μL)转化到DH5α(Invitrogen)中。在含有零霉素(Invitrogen)的LB培养基中进行筛选。用Mini PrepKit(BioRad)纯化所得菌落。对各质粒进行限制酶处理和序列分析，以证实目标质粒。SFQ ID NO：50和SEQ ID NO：51分别代表Fc融合肽D(肽D和Fc的融合蛋白)的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53分别代表Fc融合肽D(肽A和Fc的融合蛋白)的核苷酸序列和氨基酸序列。

PDF1-F：CTACTGCTGGAGCCAGTACCTGTGCTACGGTGGAGGTGGTAGCG(SEQID NO：43)

PDF1-R：GATCCGCTACCACCTCCACCGTAGCACAGGTACTGGCTCCAGCAGTAG(SEQ ID NO：44)

PAF1-F：CTACTGCGCTGCAGCTGCAGCTTGCTACGGTGGAGGTGGTAGCG(SEQID NO：45)

PAF1-R：GATCCGCTACCACCTCCACCGTAGCAAGCTGCAGCTGCAGCGCAGTAG(SEQ ID NO：46)

YCAAAAACY(SEQ ID NO：47)

实施例28：Fc融合肽D的ALP活性增强能力

将COS-1细胞接种到10cm皿(各2×10⁶细胞)中。将表达Fc融合肽D的质粒、表达Fc融合肽A的质粒和在实施例27中制备的pFUSE-hIgG1-Fc2载体(各5μg)转染到COS-1细胞中(使用FuGENEHD(Roche))。8小时后，将各培养基都更换为OptiMEM(GIBCO)(10mL)后培养72小时。回收各培养上清液并于4℃以2000rpm离心5分钟以除去杂质，例如死细胞。然后，使用浓缩滤器(Amicon)浓缩各培养上清液中产生的Fc融合肽。在各培养上清液中Fc融合肽D(SEQ IDNO：50)和Fc融合肽A(SEQ ID NO：52)的产生和Fc的产生，都通过SDS-PAGE测定相应大小(约30KDa)的条带而得以证实。

将所得Fc融合肽D、Fc融合肽A和Fc对照用αMEM稀释。将稀释液加入到已接种MC3T3-E1细胞(2×10⁴细胞/孔)的96孔板(Nunc)上，然后进行培养。在培养的第5天，按照实施例1所述的方法进行ALP活性测定。结果证实Fc融合肽D引起ALP活性增强至显著程度(图51)。同时，在加入Fc融合肽A的组或在加入Fc对照的组中，却未观察到这样的ALP活性增强作用。上述结果表明，将肽D与Fc融合而得到的Fc融合肽D能促进MC3T3-E1细胞分化为成骨细胞，正如在肽D的情况下一样。

实施例29：合成肽D的纯化方法对TRAP活性的影响

检测实施例18中产生的肽D盐替代品对TRAP活性的影响。

将与10％FBS+αMEM(SIGMA)混合的RAW264细胞接种在96孔板(2×10³细胞/孔)上。发生细胞贴壁后，将培养基更换为含有5nMGST-RANKL(Oriental Yeast Co.，Ltd.)的10％FBS+αMEM。将浓度为25μM和100μM的呈TFA形式的肽D、呈乙酸盐形式的肽D和呈盐酸盐形式的肽D分别加入其中，然后培养4天。培养完成后，将丙酮/乙醇(100μL)加入到各孔中，进行细胞固定，然后通风干燥30分钟。按照实施例16所述的方法进行TRAP活性测定。结果证实浓度为25μM的呈TFA盐形式的肽D具有显著TRAP活性抑制作用。然而，证实替代为乙酸盐或盐酸盐的肽D却没有这样的抑制作用。另外，浓度为100μM的呈TFA盐形式的肽D具有显著高抑制作用。同时，证实呈乙酸盐形式的肽D具有显著抑制作用，然而，所述抑制作用却比呈TFA形式的肽D的作用更微弱(图52)。另外，证实呈盐酸盐形式的肽D对TRAP活性抑制没有作用，甚至当其浓度为100μM时。如图39A所示，也证实，对于破骨细胞形成抑制活性而言，使用不同盐会影响活性水平，甚至在共有氨基酸序列存在时。证实了呈盐酸盐形式的肽D既没有成骨细胞分化活性，又没有破骨细胞形成抑制活性。然而，与呈TFA形式的肽D相比，证实了呈乙酸盐形式的肽D具有更高的成骨细胞分化活性和更低的破骨细胞形成抑制活性。这些结果表明，可通过修饰(例如取代)来分别控制肽D的两种活性(即：成骨细胞分化活性和破骨细胞形成抑制活性)。也可产生仅具有成骨细胞分化活性的修饰肽D或仅具有破骨细胞形成抑制活性的修饰肽D。

实施例30：对各种RANKL抗体中和能力的检测

为了检测具有ALP活性增强能力的RANKL抗体的功能，检测了各种RANKL抗体中和RANKL破骨细胞形成活性的能力。在此使用小鼠单克隆RANKL抗体(#22、#36、A和B)。将与10％FBS+αMEM(SIGMA)混合的RAW264细胞接种在96孔板(2×10³细胞/孔)上。当发生细胞贴壁后，将培养基更换为含有5nM小鼠sRANKL(PeproTechEC，Ltd)的10％FBS+αMEM。将各种RANKL抗体(1μg/mL)分别加入其中，然后培养4天。培养完成后，将丙酮/乙醇(100μL)加入到各孔中，进行细胞固定，然后通风干燥30分钟。按照实施例16所述的方法进行TRAP活性测定。结果，发现抗体#22和抗体B具有TRAP活性抑制作用，而另一方面，发现抗体#36和抗体A没有中和活性(图53)。相比之下，抗体#36和抗体A显著促进RANKL破骨细胞形成活性。这可能是因为这些抗体当与其结合时，引起sRANKL的结构变化，致使sRANKL形成三聚体，因而当sRANKL与位于RAW264细胞上的RANK结合时促进RANK成簇，导致对破骨细胞形成的促进作用。

实施例31：GST融合肽的制备

正如实施例27的情况一样，使用寡核苷酸GPD1-F(SEQ ID NO：48)和GPD1-R(SEQ ID NO：49)制备包含肽D编码序列和接头序列并具有添加在其两端的EcoRI和BamHI限制酶位点的插入DNA。按照标准方法，使用内切核酸酶，将插入DNA克隆到pGEX-4T-2(GEhealthcare；Genbank检索号U13854)谷胱甘肽S-转移酶下游。SEQ IDNO：54和SEQ ID NO：55分别代表GST融合肽D的核苷酸序列和氨基酸序列，该GST融合肽D是肽D与GST的融合蛋白。DH5α(Invitrogen)用于转化。按照标准方法培养所得的阳性克隆，然后使用IPTG(终浓度：0.5mM)诱导蛋白质表达。然后，将细胞悬浮在提取缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，100mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT和1％(v/v)TritonX-100)中，再使用超声波仪，在冰上进行匀浆。所得物在18000×g离心15分钟。回收上清液并用于上样到谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱上。然后，该柱用洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，100mM NaCl，1mM DTT和0.1％(v/v)TritonX-100)洗涤，再用谷胱甘肽溶液(12mM还原型谷胱甘肽，50mM Tris-HCl和pH 8.0)洗脱。洗脱后，用磷酸缓冲液(PBS)进行透析。对纯化的GST融合肽D进行SDS-PAGE，以确认其分子量。分子量约为27kDa。GST融合肽D用0.22-μm滤器(Pall Corporation)过滤除菌，然后用于下述实验。

实施例32：抗人RANKL单克隆抗体的制备

按照标准方法，用含有人RANKL胞外结构域(aa140-317)的GST-RANKL(Oriental Yeast Co.，Ltd.)来免疫小鼠，从而制备杂交瘤。所制备的杂交瘤在DMEM细胞培养基(含有4.5g/L葡萄糖和L-谷氨酰胺)+10％FBS中培养，再通过有限稀释而克隆。然后，选择6个不同杂交瘤，回收每个杂交瘤的培养上清液。每个回收培养上清液各自通过0.22-μm滤器(Pall Corporation)过滤，然后用于上样到蛋白G琼脂糖凝胶柱(GE healthcare)上。其后，该柱用PBS洗涤。抗体用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸-HCl，pH 2.7)洗脱。另外，洗脱下来的抗体立即用中和缓冲液(1M Tris-HCl，pH 9.0)中和，再用PBS透析，然后用0.22-μm滤器过滤除菌。经SDS-PAGE证实抗体的L链和H链条带后，使用分光光度计，根据A280的吸光度求出浓度。

实施例33：抗人RANKL单克隆抗体中和能力的检测

为了评论ALP活性增强能力与RANKL抗体中和能力之间的偶然关系(casual relationship)，检测了实施例32中制备的抗人RANKL单克隆抗体对RANKL破骨细胞形成能力的中和活性影响。使用克隆4G4、克隆7H12和克隆10C11。将与10％FBS+αMEM(SIGMA)混合的RAW264细胞接种在96孔板(2×10³细胞/孔)上。当发生细胞贴壁后，将培养基更换为含有5nM人sRANKL(PeproTech EC，Ltd)的10％FBS+αMEM。将0.0625μg/mL、0.25μg/mL和1μg/mL抗人RANKL单克隆抗体分别加入其中，然后培养4天。培养完成后，将丙酮/乙醇(100μL)加入到各孔中，进行细胞固定，然后通风干燥30分钟。按照实施例16所述的方法进行TRAP活性测定。结果发现，当使用浓度为1μg/mL时，10C11具有显著TRAP活性抑制作用。然而，当使用浓度为0.25μg/mL和0.0625μg/mL时，10C11却没有表现出这样的抑制作用(图54)。同时，发现7H12在各浓度时都具有强烈中和能力；另一方面，证实4G4没有中和作用。

实施例34：GST融合肽D和抗人RANKL单克隆抗体对人间充质干细胞分化的作用

将人间充质干细胞(hMSC；Lonza)接种在96孔板(Nunc)(2×10³细胞/孔)上。当发生细胞贴壁后，将培养基更换为分化培养基，该培养基的制备方法是将100nM地塞米松(SIGMA)、10mM BGP(SIGMA)和50μg/mL抗坏血酸加入到专用的维持培养基(Lonza)中。将10nMGST融合肽D和GST或3种抗人RANKL单克隆抗体(浓度为0.3μg/mL和3μg/mL)加入其中，然后进行培养。在培养的第5天，按照实施例1所述的方法进行ALP活性测定。结果，在hMSC的情况下，证实GST融合肽D引起ALP活性的显著增加(图55)。单独加入GST不能引起ALP活性的变化。同时，当实施例33所用的3种抗人RANKL单克隆抗体加入到hMSC中时，10C11抗体引起ALP活性的显著增强(图56)。同时，证实4G4和7H12没有ALP活性增强作用。

根据以上所述，发现通过将肽D与GST融合而得到的GST融合肽D促进人间充质干细胞分化成为成骨细胞，正如在肽D的情况下一样。总结由实施例28中的Fc融合肽D引起的对成骨细胞分化促进作用的上述结果，表明与某种蛋白质融合的肽D可表现出与肽D相当的作用。另外，上述实验结果表明，某些抗人RANKL单克隆抗体具有促进人间充质干细胞分化为成骨细胞的作用。也就是说，已经知道，能将RANKL特定部分识别为表位的抗体作用于RANKL，从而传递成骨细胞分化信号。根据这一点，可以设计、筛选和产生有效传递成骨细胞分化信号的抗RANKL单克隆抗体。正如实施例21所述的抗小鼠RANKL单克隆抗体B的情况一样，存在着作用于RANKL的抗RANKL单克隆抗体，从而转导成骨细胞增殖信号。也已知道，能将RANKL特定部分识别为表位的抗体作用于RANKL，从而传导成骨细胞分化信号。如上所述，可以通过筛选许多抗RANKL单克隆抗体，来寻找能有效传导成骨细胞增殖或分化信号的抗体，从而找到最佳抗体。

另外，如实施例19和实施例30所述，已经知道，可中和由RANKL引起的破骨细胞分化的抗小鼠RANKL单克隆抗体(抗体#22和B)包括对成骨细胞具有增殖作用的抗体(B)和没有这种作用的抗体(#22)，并且刺激成骨细胞分化的抗小鼠RANKL单克隆抗体(#22、#36、A和B)包括中和抗体和非中和抗体。此外，已经知道，中和由RANKL引起的破骨细胞分化的抗人RANKL单克隆抗体(7H12和10C11)包括能刺激成骨细胞分化的抗体(10C11)和没有这种作用的抗体(7H12)。同时，有另一种抗人RANKL单克隆抗体，上述作用全部没有(4G4)。这些事实表明，可以允许不同抗RANKL单克隆抗体分别表现出抗RANKL单克隆抗体可显示的上述3种作用(即：对破骨细胞分化的中和作用、对成骨细胞增殖的刺激作用和对成骨细胞分化的刺激作用)。另外，就抗体B而言，也可允许单一抗体具有上述3种作用(破骨细胞分化中和作用、成骨细胞增殖和成骨细胞分化)。此外，就抗体#22和10C11而言，也可允许单一抗体具有上述3种作用中的任何2种。

工业实用性

根据本发明，已经知道，在成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞中，除了自RANKL至RANK的正向信号传递之外，还发生自RANK(其是RANKL受体)至RANKL(其是RANK配体)的反向信号传递。同样，本发明的发明人已经知道，RANKL与RANK之间的双向信号转导控制骨吸收和骨形成的偶联。人们认为，自位于破骨细胞上的膜结合RANK传递给位于成骨细胞上的膜结合RANKL的反向信号在生理性骨代谢中控制骨吸收和骨形成的偶联。使用这样的反向信号允许开发能增加骨量的药物。具体地讲，对成骨细胞分化和成熟的增强作用是由反向信号引起的，当作用于RANKL的分子(例如膜结合RANK、RANK类似物肽、抗RANKL抗体、可溶性RANK、OPG及其变异体和类似物)作用于膜结合RANKL时，就会传递这样的反向信号，导致骨量增加。

可以使用膜结合RANK、RANK类似物肽、抗RANKL抗体、可溶性RANK、OPG及其变异体和类似物、以及能促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物，用于增强成骨细胞分化和成熟，导致骨量增加；所述化合物是天然或合成的低分子量化合物，例如能作用于RANKL的分子。具体地讲，这样的化合物可用于医药产品、体外诊断试剂等。另外，可通过筛选能促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物，例如能作用于RANKL的分子，来搜索或开发新的骨形成促进剂。此外，促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物，例如能作用于RANKL的分子，可用作给成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞传递信号的试剂，导致成骨细胞或这类细胞的分化和成熟。除了成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞之外，有许多已知的能表达RANKL的细胞，例如T细胞、B细胞和滑膜细胞。然而，促进成骨细胞或能分化成成骨细胞的细胞的分化、增殖、成熟或钙化的化合物，例如能作用于RANKL的分子，可用作以类似方式将信号传导给上述细胞的物质，导致所述细胞的分化、成熟和/或活化。这样的化合物可用作医药产品、体外诊断试剂、研究用试剂等，用于各种不同用途。

序列表的自由文本(Free Text)

SEQ ID NO：7和16：合成肽，其中第2位的Cys与第8位的Cys通过二硫键相结合。

SEQ ID NO：8-13、SEQ ID NO：17-46、SEQ ID NO：48和49：引物

本文所引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用全部结合到本文中。

序列表

<110>东方酵母工业株式会社(ORIENTAL YEAST Co.，Ltd.)

 

<120>新的骨量增加药

 

<130>PH-3583-PCT

 

<150>JP2007-149799

<151>2007-06-05

 

<150>JP2007-313822

<151>2007-12-04

 

<150>JP2008-060145

<151>2008-03-10

 

<150>JP2008-131572

<151>2008-05-20

 

<160>55

 

<170>PatentIn version 3.4

 

<210>1

<211>2201

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<220>

<221>CDS

<222>(129)..(1082)

 

<400>1

ggccaaagcc gggctccaag tcggcgcccc acgtcgaggc tccgccgcag cctccggagt   60

tggccgcaga caagaagggg agggagcggg agagggagga gagctccgaa gcgagagggc  120

cgagcgcc atg cgc cgc gcc agc aga gac tac acc aag tac ctg cgt ggc   170

         Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Thr Lys Tyr Leu Arg Gly

         1               5                   10

tcg gag gag atg ggc ggc ggc ccc gga gcc ccg cac gag ggc ccc ctg    218

Ser Glu Glu Met Gly Gly Gly Pro Gly Ala Pro His Glu Gly Pro Leu

15                  20                  25                  30

cac gcc ccg ccg ccg cct gcg ccg cac cag ccc ccc gcc gcc tcc cgc    266

His Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro His Gln Pro Pro Ala Ala Ser Arg

                35                  40                  45

tcc atg ttc gtg gcc ctc ctg ggg ctg ggg ctg ggc cag gtt gtc tgc    314

Ser Met Phe Val Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys

            50                  55                  60

agc gtc gcc ctg ttc ttc tat ttc aga gcg cag atg gat cct aat aga    362

Ser Val Ala Leu Phe Phe Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg

        65                  70                  75

ata tca gaa gat ggc act cac tgc att tat aga att ttg aga ctc cat    410

Ile Ser Glu Asp Gly Thr His Cys Ile Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His

    80                  85                  90

gaa aat gca gat ttt caa gac aca act ctg gag agt caa gat aca aaa    458

Glu Asn Ala Asp Phe Gln Asp Thr Thr Leu Glu Ser Gln Asp Thr Lys

95                 100                 105                 110

tta ata cct gat tca tgt agg aga att aaa cag gcc ttt caa gga gct    506

Leu Ile Pro Asp Ser Cys Arg Arg Ile Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala

                115                 120                 125

gtg caa aag gaa tta caa cat atc gtt gga tca cag cac atc aga gca    554

Val Gln Lys Glu Leu Gln His Ile Val Gly Ser Gln His Ile Arg Ala

            130                 135                 140

gag aaa gcg atg gtg gat ggc tca tgg tta gat ctg gcc aag agg agc    602

Glu Lys Ala Met Val Asp Gly Ser Trp Leu Asp Leu Ala Lys Arg Ser

        145                 150                 155

aag ctt gaa gct cag cct ttt gct cat ctc act att aat gcc acc gac    650

Lys Leu Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Thr Asp

    160                 165                 170

atc cca tct ggt tcc cat aaa gtg agt ctg tcc tct tgg tac cat gat    698

Ile Pro Ser Gly Ser His Lys Val Ser Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp

175                 180                 185                 190

cgg ggt tgg gcc aag atc tcc aac atg act ttt agc aat gga aaa cta    746

Arg Gly Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Phe Ser Asn Gly Lys Leu

                195                 200                 205

ata gtt aat cag gat ggc ttt tat tac ctg tat gcc aac att tgc ttt    794

Ile Val Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe

            210                 215                 220

cga cat cat gaa act tca gga gac cta gct aca gag tat ctt caa cta    842

Arg His His Glu Thr Ser Gly Asp Leu Ala Thr Glu Tyr Leu Gln Leu

        225                 230                 235

atg gtg tac gtc act aaa acc agc atc aaa atc cca agt tct cat acc    890

Met Val Tyr Val Thr Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Thr

    240                 245                 250

ctg atg aaa gga gga agc acc aag tat tgg tca ggg aat tct gaa ttc    938

Leu Met Lys Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe

255                 260                 265                 270

cat ttt tat tcc ata aac gtt ggt gga ttt ttt aag tta cgg tct gga    986

His Phe Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ser Gly

                275                 280                 285

gag gaa atc agc atc gag gtc tcc aac ccc tcc tta ctg gat ccg gat    1034

Glu Glu Ile Ser Ile Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp

            290                 295                 300

cag gat gca aca tac ttt ggg gct ttt aaa gtt cga gat ata gat tga    1082

Gln Asp Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Arg Asp Ile Asp

        305                 310                 315

gccccagttt ttggagtgtt atgtatttcc tggatgtttg gaaacatttt ttaaaacaag  1142

ccaagaaaga tgtatatagg tgtgtgagac tactaagagg catggcccca acggtacacg  1202

actcagtatc catgctcttg accttgtaga gaacacgcgt atttacctgc cagtgggaga  1262

tgttagactc atggtgtgtt acacaatggt ttttaaattt tgtaatgaat tcctagaatt  1322

aaaccagatt ggagcaatta cgggttgacc ttatgagaaa ctgcatgtgg gctatgggag  1382

gggttggtcc ctggtcatgt gccccttcgc agctgaagtg gagagggtgt catctagcgc  1442

aattgaagga tcatctgaag gggcaaattc ttttgaattg ttacatcatg ctggaacctg  1502

caaaaaatac tttttctaat gaggagagaa aatatatgta tttttatata atatctaaag  1562

ttatatttca gatgtaatgt tttctttgca aagtattgta aattatattt gtgctatagt  1622

atttgattca aaatatttaa aaatgtcttg ctgttgacat atttaatgtt ttaaatgtac  1682

agacatattt aactggtgca ctttgtaaat tccctgggga aaacttgcag ctaaggaggg  1742

gaaaaaaatg ttgtttccta atatcaaatg cagtatattt cttcgttctt tttaagttaa  1802

tagatttttt cagacttgtc aagcctgtgc aaaaaaatta aaatggatgc cttgaataat  1862

aagcaggatg ttggccacca ggtgcctttc aaatttagaa actaattgac tttagaaagc  1922

tgacattgcc aaaaaggata cataatgggc cactgaaatt tgtcaagagt agttatataa  1982

ttgttgaaca ggtgtttttc cacaagtgcc gcaaattgta cctttttttt tttttcaaaa  2042

tagaaaagtt attagtggtt tatcagcaaa aaagtccaat tttaatttag taaatgttat  2102

tttatactgt acaataaaaa cattgccttt gaatgttaat tttttggtac aaaaataaat  2162

ttatatgaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa                         2201

 

<210>2

<211>317

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>2

 

Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Thr Lys Tyr Leu Arg Gly Ser Glu

1               5                   10                  15

Glu Met Gly Gly Gly Pro Gly Ala Pro His Glu Gly Pro Leu His Ala

            20                  25                  30

Pro Pro Pro Pro Ala Pro His Gln Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser Met

        35                  40                  45

Phe Val Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys Ser Val

    50                  55                  60

Ala Leu Phe Phe Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg Ile Ser

65                  70                  75                  80

Glu Asp Gly Thr His Cys Ile Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu Asn

                85                  90                  95

Ala Asp Phe Gln Asp Thr Thr Leu Glu Ser Gln Asp Thr Lys Leu Ile

            100                 105                 110

Pro Asp Ser Cys Arg Arg Ile Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln

        115                 120                 125

Lys Glu Leu Gln His Ile Val Gly Ser Gln His Ile Arg Ala Glu Lys

    130                 135                 140

Ala Met Val Asp Gly Ser Trp Leu Asp Leu Ala Lys Arg Ser Lys Leu

145                 150                 155                 160

Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Thr Asp Ile Pro

                165                 170                 175

Ser Gly Ser His Lys Val Ser Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly

            180                 185                 190

Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Phe Ser Asn Gly Lys Leu Ile Val

        195                 200                 205

Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His

    210                 215                 220

His Glu Thr Ser Gly Asp Leu Ala Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Met Val

225                 230                 235                 240

Tyr Val Thr Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Thr Leu Met

                245                 250                 255

Lys Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe

            260                 265                 270

Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ser Gly Glu Glu

        275                 280                 285

Ile Ser Ile Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp

    290                 295                 300

Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Arg Asp Ile Asp

305                 310                 315

 

<210>3

<211>3133

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(39)..(1889)

 

<400>3

ccgctgaggc cgcggcgccc gccagcctgt cccgcgcc atg gcc ccg cgc gcc cgg   56

                                          Met Ala Pro Arg Ala Arg

                                          1               5

cgg cgc cgc ccg ctg ttc gcg ctg ctg ctg ctc tgc gcg ctg ctc gcc    104

Arg Arg Arg Pro Leu Phe Ala Leu Leu Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ala

            10                  15                  20

cgg ctg cag gtg gct ttg cag atc gct cct cca tgt acc agt gag aag    152

Arg Leu Gln Val Ala Leu Gln Ile Ala Pro Pro Cys Thr Ser Glu Lys

        25                  30                  35

cat tat gag cat ctg gga cgg tgc tgt aac aaa tgt gaa cca gga aag    200

His Tyr Glu His Leu Gly Arg Cys Cys Asn Lys Cys Glu Pro Gly Lys

    40                  45                  50

tac atg tct tct aaa tgc act act acc tct gac agt gta tgt ctg ccc    248

Tyr Met Ser Ser Lys Cys Thr Thr Thr Ser Asp Ser Val Cys Leu Pro

55                  60                  65                  70

tgt ggc ccg gat gaa tac ttg gat agc tgg aat gaa gaa gat aaa tgc    296

Cys Gly Pro Asp Glu Tyr Leu Asp Ser Trp Asn Glu Glu Asp Lys Cys

                75                  80                  85

ttg ctg cat aaa gtt tgt gat aca ggc aag gcc ctg gtg gcc gtg gtc    344

Leu Leu His Lys Val Cys Asp Thr Gly Lys Ala Leu Val Ala Val Val

            90                  95                  100

gcc ggc aac agc acg acc ccc cgg cgc tgc gcg tgc acg gct ggg tac    392

Ala Gly Asn Ser Thr Thr Pro Arg Arg Cys Ala Cys Thr Ala Gly Tyr

        105                 110                 115

cac tgg agc cag gac tgc gag tgc tgc cgc cgc aac acc gag tgc gcg    440

His Trp Ser Gln Asp Cys Glu Cys Cys Arg Arg Asn Thr Glu Cys Ala

    120                 125                 130

ccg ggc ctg ggc gcc cag cac ccg ttg cag ctc aac aag gac aca gtg    488

Pro Gly Leu Gly Ala Gln His Pro Leu Gln Leu Asn Lys Asp Thr Val

135                 140                 145                 150

tgc aaa cct tgc ctt gca ggc tac ttc tct gat gcc ttt tcc tcc acg    536

Cys Lys Pro Cys Leu Ala Gly Tyr Phe Ser Asp Ala Phe Ser Ser Thr

                155                 160                 165

gac aaa tgc aga ccc tgg acc aac tgt acc ttc ctt gga aag aga gta    584

Asp Lys Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Thr Phe Leu Gly Lys Arg Val

            170                 175                 180

gaa cat cat ggg aca gag aaa tcc gat gcg gtt tgc agt tct tct ctg    632

Glu His His Gly Thr Glu Lys Ser Asp Ala Val Cys Ser Ser Ser Leu

        185                 190                 195

cca gct aga aaa cca cca aat gaa ccc cat gtt tac ttg ccc ggt tta    680

Pro Ala Arg Lys Pro Pro Asn Glu Pro His Val Tyr Leu Pro Gly Leu

    200                 205                 210

ata att ctg ctt ctc ttc gcg tct gtg gcc ctg gtg gct gcc atc atc    728

Ile Ile Leu Leu Leu Phe Ala Ser Val Ala Leu Val Ala Ala Ile Ile

215                 220                 225                 230

ttt ggc gtt tgc tat agg aaa aaa ggg aaa gca ctc aca gct aat ttg    776

Phe Gly Val Cys Tyr Arg Lys Lys Gly Lys Ala Leu Thr Ala Asn Leu

                235                 240                 245

tgg cac tgg atc aat gag gct tgt ggc cgc cta agt gga gat aag gag    824

Trp His Trp Ile Asn Glu Ala Cys Gly Arg Leu Ser Gly Asp Lys Glu

            250                 255                 260

tcc tca ggt gac agt tgt gtc agt aca cac acg gca aac ttt ggt cag    872

Ser Ser Gly Asp Ser Cys Val Ser Thr His Thr Ala Asn Phe Gly Gln

        265                 270                 275

cag gga gca tgt gaa ggt gtc tta ctg ctg act ctg gag gag aag aca    920

Gln Gly Ala Cys Glu Gly Val Leu Leu Leu Thr Leu Glu Glu Lys Thr

    280                 285                 290

ttt cca gaa gat atg tgc tac cca gat caa ggt ggt gtc tgt cag ggc    968

Phe Pro Glu Asp Met Cys Tyr Pro Asp Gln Gly Gly Val Cys Gln Gly

295                 300                 305                 310

aca tgt gta gga ggt ggt ccc tac gca caa ggc gaa gat gcc agg atg    1016

Thr Cys Val Gly Gly Gly Pro Tyr Ala Gln Gly Glu Asp Ala Arg Met

                315                 320                 325

ctc tca ttg gtc agc aag acc gag ata gag gaa gac agc ttc aga cag    1064

Leu Ser Leu Val Ser Lys Thr Glu Ile Glu Glu Asp Ser Phe Arg Gln

            330                 335                 340

atg ccc aca gaa gat gaa tac atg gac agg ccc tcc cag ccc aca gac    1112

Met Pro Thr Glu Asp Glu Tyr Met Asp Arg Pro Ser Gln Pro Thr Asp

        345                 350                 355

cag tta ctg ttc ctc act gag cct gga agc aaa tcc aca cct cct ttc    1160

Gln Leu Leu Phe Leu Thr Glu Pro Gly Ser Lys Ser Thr Pro Pro Phe

    360                 365                 370

tct gaa ccc ctg gag gtg ggg gag aat gac agt tta agc cag tgc ttc    1208

Ser Glu Pro Leu Glu Val Gly Glu Asn Asp Ser Leu Ser Gln Cys Phe

375                 380                 385                 390

acg ggg aca cag agc aca gtg ggt tca gaa agc tgc aac tgc act gag    1256

Thr Gly Thr Gln Ser Thr Val Gly Ser Glu Ser Cys Asn Cys Thr Glu

                395                 400                 405

ccc ctg tgc agg act gat tgg act ccc atg tcc tct gaa aac tac ttg    1304

Pro Leu Cys Arg Thr Asp Trp Thr Pro Met Ser Ser Glu Asn Tyr Leu

            410                 415                 420

caa aaa gag gtg gac agt ggc cat tgc ccg cac tgg gca gcc agc ccc    1352

Gln Lys Glu Val Asp Ser Gly His Cys Pro His Trp Ala Ala Ser Pro

        425                 430                 435

agc ccc aac tgg gca gat gtc tgc aca ggc tgc cgg aac cct cct ggg    1400

Ser Pro Asn Trp Ala Asp Val Cys Thr Gly Cys Arg Asn Pro Pro Gly

    440                 445                 450

gag gac tgt gaa ccc ctc gtg ggt tcc cca aaa cgt gga ccc ttg ccc    1448

Glu Asp Cys Glu Pro Leu Val Gly Ser Pro Lys Arg Gly Pro Leu Pro

455                 460                 465                 470

cag tgc gcc tat ggc atg ggc ctt ccc cct gaa gaa gaa gcc agc agg    1496

Gln Cys Ala Tyr Gly Met Gly Leu Pro Pro Glu Glu Glu Ala Ser Arg

                475                 480                 485

acg gag gcc aga gac cag ccc gag gat ggg gct gat ggg agg ctc cca    1544

Thr Glu Ala Arg Asp Gln Pro Glu Asp Gly Ala Asp Gly Arg Leu Pro

            490                 495                 500

agc tca gcg agg gca ggt gcc ggg tct gga agc tcc cct ggt ggc cag    1592

Ser Ser Ala Arg Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ser Ser Pro Gly Gly Gln

        505                 510                 515

tcc cct gca tct gga aat gtg act gga aac agt aac tcc acg ttc atc    1640

Ser Pro Ala Ser Gly Asn Val Thr Gly Asn Ser Asn Ser Thr PheIle

    520                 525                 530

tcc agc ggg cag gtg atg aac ttc aag ggc gac atc atc gtg gtc tac    1688

Ser Ser Gly Gln Val Met Asn Phe Lys Gly Asp Ile Ile Val Val Tyr

535                 540                 545                 550

gtc agc cag acc tcg cag gag ggc gcg gcg gcg gct gcg gag ccc atg    1736

Val Ser Gln Thr Ser Gln Glu Gly Ala Ala Ala Ala Ala Glu Pro Met

                555                 560                 565

ggc cgc ccg gtg cag gag gag acc ctg gcg cgc cga gac tcc ttc gcg    1784

Gly Arg Pro Val Gln Glu Glu Thr Leu Ala Arg Arg Asp Ser Phe Ala

            570                 575                 580

ggg aac ggc ccg cgc ttc ccg gac ccg tgc ggc ggc ccc gag ggg ctg    1832

Gly Asn Gly Pro Arg Phe Pro Asp Pro Cys Gly Gly Pro Glu Gly Leu

        585                 590                 595

cgg gag ccg gag aag gcc tcg agg ccg gtg cag gag caa ggc ggg gcc    1880

Arg Glu Pro Glu Lys Ala Ser Arg Pro Val Gln Glu Gln Gly Gly Ala

    600                 605                 610

aag gct tga gcgcccccca tggctgggag cccgaagctc ggagccaggg            1929

Lys Ala

615

 

ctcgcgaggg cagcaccgca gcctctgccc cagccccggc cacccaggga tcgatcggta  1989

cagtcgagga agaccacccg gcattctctg cccactttgc cttccaggaa atgggctttt  2049

caggaagtga attgatgagg actgtcccca tgcccacgga tgctcagcag cccgccgcac    2109

tggggcagat gtctcccctg ccactcctca aactcgcagc agtaatttgt ggcactatga    2169

cagctatttt tatgactatc ctgttctgtg gggggggggg tctgttttcc ccccatattt    2229

gtattccttt tcataacttt tcttgatatc tttcctccct cttttttaat gtaaaggttt    2289

tctcaaaaat tctcctaaag gtgagggtct ctttcttttc tcttttcctt ttttttttct    2349

ttttttggca acctggctct ggcccaggct agagtgcagt ggtgcgatta tagcccggtg    2409

cagcctctaa ctcctgggct caagcaatcc aagtgatcct cccacctcaa ccttcggagt    2469

agctgggatc acagctgcag gccacgccca gcttcctccc cccgactccc cccccagaga    2529

cacggtccca ccatgttacc cagcctggtc tcaaactccc cagctaaagc agtcctccag    2589

cctcggcctc ccaaagtact gggattacag gcgtgagccc ccacgctggc ctgctttacg    2649

tattttcttt tgtgcccctg ctcacagtgt tttagagatg gctttcccag tgtgtgttca    2709

ttgtaaacac ttttgggaaa gggctaaaca tgtgaggcct ggagatagtt gctaagttgc    2769

taggaacatg tggtgggact ttcatattct gaaaaatgtt ctatattctc atttttctaa    2829

aagaaagaaa aaaggaaacc cgatttattt ctcctgaatc tttttaagtt tgtgtcgttc    2889

cttaagcaga actaagctca gtatgtgacc ttacccgcta ggtggttaat ttatccatgc    2949

tggcagaggc actcaggtac ttggtaagca aatttctaaa actccaagtt gctgcagctt    3009

ggcattcttc ttattctaga ggtctctctg gaaaagatgg agaaaatgaa caggacatgg    3069

ggctcctgga aagaaagggc ccgggaagtt caaggaagaa taaagttgaa attttaaaaa    3129

aaaa                                                                 3133

 

<210>4

<211>616

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>4

 

Met Ala Pro Arg Ala Arg Arg Arg Arg Pro Leu Phe Ala Leu Leu Leu

1               5                   10                  15

Leu Cys Ala Leu Leu Ala Arg Leu Gln Val Ala Leu Gln Ile Ala Pro

            20                  25                  30

Pro Cys Thr Ser Glu Lys His Tyr Glu His Leu Gly Arg Cys Cys Asn

        35                  40                  45

Lys Cys Glu Pro Gly Lys Tyr Met Ser Ser Lys Cys Thr Thr Thr Ser

    50                  55                  60

Asp Ser Val Cys Leu Pro Cys Gly Pro Asp Glu Tyr Leu Asp Ser Trp

65                  70                  75                  80

Asn Glu Glu Asp Lys Cys Leu Leu His Lys Val Cys Asp Thr Gly Lys

                85                  90                  95

Ala Leu Val Ala Val Val Ala Gly Asn Ser Thr Thr Pro Arg Arg Cys

            100                 105                 110

Ala Cys Thr Ala Gly Tyr His Trp Ser Gln Asp Cys Glu Cys Cys Arg

        115                 120                 125

Arg Asn Thr Glu Cys Ala Pro Gly Leu Gly Ala Gln His Pro Leu Gln

    130                 135                 140

Leu Asn Lys Asp Thr Val Cys Lys Pro Cys Leu Ala Gly Tyr Phe Ser

145                 150                 155                 160

Asp Ala Phe Ser Ser Thr Asp Lys Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Thr

                165                 170                 175

Phe Leu Gly Lys Arg Val Glu His His Gly Thr Glu Lys Ser Asp Ala

            180                 185                 190

Val Cys Ser Ser Ser Leu Pro Ala Arg Lys Pro Pro Asn Glu Pro His

        195                 200                 205

Val Tyr Leu Pro Gly Leu Ile Ile Leu Leu Leu Phe Ala Ser Val Ala

    210                 215                 220

Leu Val Ala Ala Ile Ile Phe Gly Val Cys Tyr Arg Lys Lys Gly Lys

225                 230                 235                 240

Ala Leu Thr Ala Asn Leu Trp His Trp Ile Asn Glu Ala Cys Gly Arg

                245                 250                 255

Leu Ser Gly Asp Lys Glu Ser Ser Gly Asp Ser Cys Val Ser Thr His

            260                 265                 270

Thr Ala Asn Phe Gly Gln Gln Gly Ala Cys Glu Gly Val Leu Leu Leu

        275                 280                 285

Thr Leu Glu Glu Lys Thr Phe Pro Glu Asp Met Cys Tyr Pro Asp Gln

    290                 295                 300

Gly Gly Val Cys Gln Gly Thr Cys Val Gly Gly Gly Pro Tyr Ala Gln

305                 310                 315                 320

Gly Glu Asp Ala Arg Met Leu Ser Leu Val Ser Lys Thr Glu Ile Glu

                325                 330                 335

Glu Asp Ser Phe Arg Gln Met Pro Thr Glu Asp Glu Tyr Met Asp Arg

            340                 345                 350

Pro Ser Gln Pro Thr Asp Gln Leu Leu Phe Leu Thr Glu Pro Gly Ser

        355                 360                 365

Lys Ser Thr Pro Pro Phe Ser Glu Pro Leu Glu Val Gly Glu Asn Asp

    370                 375                 380

Ser Leu Ser Gln Cys Phe Thr Gly Thr Gln Ser Thr Val Gly Ser Glu

385                 390                 395                 400

Ser Cys Asn Cys Thr Glu Pro Leu Cys Arg Thr Asp Trp Thr Pro Met

                405                 410                 415

Ser Ser Glu Asn Tyr Leu Gln Lys Glu Val Asp Ser Gly His Cys Pro

            420                 425                 430

His Trp Ala Ala Ser Pro Ser Pro Asn Trp Ala Asp Val Cys Thr Gly

        435                 440                 445

Cys Arg Asn Pro Pro Gly Glu Asp Cys Glu Pro Leu Val Gly Ser Pro

    450                 455                 460

Lys Arg Gly Pro Leu Pro Gln Cys Ala Tyr Gly Met Gly Leu Pro Pro

465                 470                 475                 480

Glu Glu Glu Ala Ser Arg Thr Glu Ala Arg Asp Gln Pro Glu Asp Gly

                485                 490                 495

Ala Asp Gly Arg Leu Pro Ser Ser Ala Arg Ala Gly Ala Gly Ser Gly

            500                 505                 510

Ser Ser Pro Gly Gly Gln Ser Pro Ala Ser Gly Asn Val Thr Gly Asn

        515                 520                 525

Ser Asn Ser Thr Phe Ile Ser Ser Gly Gln Val Met Asn Phe Lys Gly

    530                 535                 540

Asp Ile Ile Val Val Tyr Val Ser Gln Thr Ser Gln Glu Gly Ala Ala

545                 550                 555                 560

Ala Ala Ala Glu Pro Met Gly Arg Pro Val Gln Glu Glu Thr Leu Ala

                565                 570                 575

Arg Arg Asp Ser Phe Ala Gly Asn Gly Pro Arg Phe Pro Asp Pro Cys

            580                 585                 590

Gly Gly Pro Glu Gly Leu Arg Glu Pro Glu Lys Ala Ser Arg Pro Val

        595                 600                 605

Gln Glu Gln Gly Gly Ala Lys Ala

    610                 615

 

<210>5

<211>2291

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

 

<220>

<221>CDS

<222>(252)..(1457)

 

<400>5

ctttccgccc cagccctgaa agcgttaacc ctggagcttt ctgcacaccc cccgaccgct   60

cccgcccaag cttcctaaaa aagaaaggtg caaagtttgg tccaggatag aaaaatgact  120

gatcaaaggc aggcgatact tcctgttgcc gggacgctat atataacgtg atgagcgcac  180

gggctgcgga gacgcaccgg agcgctcgcc cagccgccgc ctccaagccc ctgaggtttc  240

cggggaccac a atg aac aag ttg ctg tgc tgc gcg ctc gtg ttt ctg gac   290

             Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp

             1               5                   10

atc tcc att aag tgg acc acc cag gaa acg ttt cct cca aag tac ctt    338

Ile Ser Ile Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu

    15                  20                  25

cat tat gac gaa gaa acc tct cat cag ctg ttg tgt gac aaa tgt cct    386

His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro

30                  35                  40                  45

cct ggt acc tac cta aaa caa cac tgt aca gca aag tgg aag acc gtg    434

Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val

                50                  55                  60

tgc gcc cct tgc cct gac cac tac tac aca gac agc tgg cac acc agt    482

Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser

            65                  70                  75

gac gag tgt cta tac tgc agc ccc gtg tgc aag gag ctg cag tac gtc    530

Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val

        80                  85                  90

aag cag gag tgc aat cgc acc cac aac cgc gtg tgc gaa tgc aag gaa    578

Lys Gln Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu

    95                  100                 105

ggg cgc tac ctt gag ata gag ttc tgc ttg aaa cat agg agc tgc cct    626

Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro

110                 115                 120                 125

cct gga ttt gga gtg gtg caa gct gga acc cca gag cga aat aca gtt    674

Pro Gly Phe Gly Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val

                130                 135                 140

tgc aaa aga tgt cca gat ggg ttc ttc tca aat gag acg tca tct aaa    722

Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys

            145                 150                 155

gca ccc tgt aga aaa cac aca aat tgc agt gtc ttt ggt ctc ctg cta    770

Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu

        160                 165                 170

act cag aaa gga aat gca aca cac gac aac ata tgt tcc gga aac agt    818

Thr Gln Lys Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser

    175                 180                 185

gaa tca act caa aaa tgt gga ata gat gtt acc ctg tgt gag gag gca    866

Glu Ser Thr Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala

190                 195                 200                 205

ttc ttc agg ttt gct gtt cct aca aag ttt acg cct aac tgg ctt agt    914

Phe Phe Arg Phe Ala Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser

                210                 215                 220

gtc ttg gta gac aat ttg cct ggc acc aaa gta aac gca gag agt gta    962

Val Leu Val Asp Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val

            225                 230                 235

gag agg ata aaa cgg caa cac agc tca caa gaa cag act ttc cag ctg   1010

Glu Arg Ile Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu  

        240                 245                 250

ctg aag tta tgg aaa cat caa aac aaa gac caa gat ata gtc aag aag   1058

Leu Lys Leu Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile Val Lys Lys

    255                 260                 265

atc atc caa gat att gac ctc tgt gaa aac agc gtg cag cgg cac att   1106

Ile Ile Gln Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile

270                 275                 280                 285

gga cat gct aac ctc acc ttc gag cag ctt cgt agc ttg atg gaa agc    1154

Gly His Ala Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu Ser

                290                 295                 300

tta ccg gga aag aaa gtg gga gca gaa gac att gaa aaa aca ata aag    1202

Leu Pro Gly Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr Ile Lys

            305                 310                 315

gca tgc aaa ccc agt gac cag atc ctg aag ctg ctc agt ttg tgg cga    1250

Ala Cys Lys Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg

        320                 325                 330

ata aaa aat ggc gac caa gac acc ttg aag ggc cta atg cac gca cta    1298

Ile Lys Asn Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met His Ala Leu

    335                 340                 345

aag cac tca aag acg tac cac ttt ccc aaa act gtc act cag agt cta    1346

Lys His Ser Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu

350                 355                 360                 365

aag aag acc atc agg ttc ctt cac agc ttc aca atg tac aaa ttg tat    1394

Lys Lys Thr Ile Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr

                370                 375                 380

cag aag tta ttt tta gaa atg ata ggt aac cag gtc caa tca gta aaa    1442

Gln Lys Leu Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys

            385                 390                 395

ata agc tgc tta taa ctggaaatgg ccattgagct gtttcctcac aattggcgag    1497

Ile Ser Cys Leu

        400

 

atcccatgga tgagtaaact gtttctcagg cacttgaggc tttcagtgat atctttctca  1557

ttaccagtga ctaattttgc cacagggtac taaaagaaac tatgatgtgg agaaaggact  1617

aacatctcct ccaataaacc ccaaatggtt aatccaactg tcagatctgg atcgttatct  1677

actgactata ttttccctta ttactgcttg cagtaattca actggaaatt aaaaaaaaaa  1737

aactagactc cattgtgcct tactaaatat gggaatgtct aacttaaata gctttgagat  1797

ttcagctatg ctagaggctt ttattagaaa gccatatttt tttctgtaaa agttactaat  1857

atatctgtaa cactattaca gtattgctat ttatattcat tcagatataa gatttgtaca  1917

tattatcatc ctataaagaa acggtatgac ttaattttag aaagaaaatt atattctgtt  1977

tattatgaca aatgaaagag aaaatatata tttttaatgg aaagtttgta gcatttttct  2037

aataggtact gccatatttt tctgtgtgga gtatttttat aattttatct gtataagctg  2097

taatatcatt ttatagaaaa tgcattattt agtcaattgt ttaatgttgg aaaacatatg  2157

aaatataaat tatctgaata ttagatgctc tgagaaattg aatgtacctt atttaaaaga  2217

ttttatggtt ttataactat ataaatgaca ttattaaagt tttcaaatta ttttttaaaa  2277

aaaaaaaaaa aaaa                                                    2291

 

<210>6

<211>401

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

 

<400>6

 

Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser Ile

1               5                   10                  15

Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp

            20                  25                  30

Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr

        35                  40                  45

Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro

    50                  55                  60

Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys

65                  70                  75                  80

Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu

                85                  90                  95

Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr

            100                 105                 110

Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe

        115                 120                 125

Gly Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg

    130                 135                 140

Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys

145                 150                 155                 160

Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys

                165                 170                 175

Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr

            180                 185                 190

Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg

        195                 200                 205

Phe Ala Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val

    210                 215                 220

Asp Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile

225                 230                 235                 240

Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu

                245                 250                 255

Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile Ile Gln

            260                 265                 270

Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile Gly His Ala

        275                 280                 285

Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly

    290                 295                 300

Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr Ile Lys Ala Cys Lys

305                 310                 315                 320

Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn

                325                 330                 335

Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met His Ala Leu Lys His Ser

            340                 345                 350

Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr

        355                 360                 365

Ile Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu

    370                 375                 380

Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys

385                 390                 395                 400

Leu

 

<210>7

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成的

 

<220>

<223>第2个Cys与第8个Cys通过二硫键相连接

 

<400>7

 

Tyr Cys Trp Ser Gln Tyr Leu Cys Tyr

1               5

 

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>8

gggggtggcc ggaaatacat    20

 

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>9

gggggccaga ccaaagatag agtt      24

 

<210>10

<211>20

<212>DNA    

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>10

attccagttc gagtatggcg           20

 

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>11

ttttgtattc aatcactgtc ttgcc     25

 

<210>12

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>12

tgaaggtcgg agtcaacgga tttggt    26

 

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>13

catgtgggcc atgaggtcca ccac                                          24

 

<210>14

<211>1236

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>GST-RANKL(aa140-317)

 

<400>14

atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt   60

ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa  120

tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat  180

ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac  240

atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg  300

gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt  360

gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa  420

acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat  480

gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa  540

aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca  600

tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat  660

ctggttccgc gtggatcccc aggaattccc gggtcgacta tcagagcaga gaaagcgatg  720

gtggatggct catggttaga tctggccaag aggagcaagc ttgaagctca gccttttgct   780

catctcacta ttaatgccac cgacatccca tctggttccc ataaagtgag tctgtcctct   840

tggtaccatg atcggggttg ggccaagatc tccaacatga cttttagcaa tggaaaacta   900

atagttaatc aggatggctt ttattacctg tatgccaaca tttgctttcg acatcatgaa   960

acttcaggag acctagctac agagtatctt caactaatgg tgtacgtcac taaaaccagc  1020

atcaaaatcc caagttctca taccctgatg aaaggaggaa gcaccaagta ttggtcaggg  1080

aattctgaat tccattttta ttccataaac gttggtggat tttttaagtt acggtctgga  1140

gaggaaatca gcatcgaggt ctccaacccc tccttactgg atccggatca ggatgcaaca  1200

tactttgggg cttttaaagt tcgagatata gattga                            1236

 

<210>15

<211>429

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>GST-RANKL(aa140-317)

 

<400>15

 

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1               5                   10                  15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

            20                  25                  30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

        35                  40                  45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

    50                  55                  60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65                  70                  75                  80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

                85                  90                  95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

            100                 105                 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

        115                 120                 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

    130                 135                 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145                 150                 155                 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

                165                 170                 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

            180                 185                 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

        195                 200                 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg

    210                 215                 220

Gly Ser Pro Gly Ile Pro Gly Ser Thr Arg Ala Ala Ala Ser Leu Val

225                 230                 235                 240

Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ile Pro Gly Ser Thr Ile Arg Ala Glu Lys

                245                 250                 255

Ala Met Val Asp Gly Ser Trp Leu Asp Leu Ala Lys Arg Ser Lys Leu

            260                 265                 270

Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Thr Asp Ile Pro

        275                 280                 285

Ser Gly Ser His Lys Val Ser Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly

    290                 295                 300

Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Phe Ser Asn Gly Lys Leu Ile Val

305                 310                 315                 320

Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His

                325                 330                 335

His Glu Thr Ser Gly Asp Leu Ala Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Met Val

            340                 345                 350

Tyr Val Thr Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Thr Leu Met

        355                 360                 365

Lys Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe

    370                 375                 380

Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ser Gly Glu Glu

385                 390                 395                 400

Ile Ser Ile Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp

                405                 410                 415

Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Arg Asp Ile Asp

            420                 425

 

<210>16

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成的

 

<220>

<223>第2个Cys与第8个Cys通过二硫键相连接

 

<400>16

 

Tyr Cys Trp Ser Gln Asn Leu Cys Tyr

1               5

 

<210>17

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>17

ggcaagcctg aggcccagcc attt    24

 

<210>18

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>18

gtctcagtct atgtcctgaa cttt                                           24

 

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>19

caccatggag aaggccgggg                                                20

 

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>20

gacggacaca ttgggggtag                                                20

 

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

<400>21

ccaagcaggc tctgcatgaa                                                  20

 

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>22

gccagaccaa agatggagtt                                                  20

 

<210>23

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>23

tctgacaaag ccttcatgtc                                                  21

 

<210>24

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>24

aaatagtgat accatagatg g                                                22

 

<210>25

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>25

cctggtaaag atggtgcc                                                18

 

<210>26

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>26

caccaggttc acctttcgca cc                                           22

 

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>27

atgagggatc tttaccggct                                              20

 

<210>28

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

<400>28

tttatacggt ggaagccctg    20

 

<210>29

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>29

agtgtgcact gccaaagatg    20

 

<210>30

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>30

ggccaaatgt gtcttccagt    20

 

<210>31

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>31

aagcggctct actgcaagaa    20

 

<210>32

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>32

tcgtttcagt gccacatacc                                              20

 

<210>33

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>33

ctttggcctg gccagggata tcaac                                        25

 

<210>34

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>34

ccaactgctt gaatgtgggt ctct                                         24

 

<210>35

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

<400>35

cccgctgttc ggtttgcata c                                            21

 

<210>36

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>36

acggttggca cggcttgaag                                              20

 

<210>37

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>37

agcgtaactg gacatcacag cag                                          23

 

<210>38

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>38

cggtgtcaca gtgctttctt gttg                                         24

 

<210>39

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>39

gtctggtctt ttgggatcct actct                                        25

 

<210>40

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>40

ctcctcatct acctgctggt act                                          23

 

<210>41

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>41

ctgattcggt acctagagcc agat                                         24

 

<210>42

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

<400>42

ctgtcctctt tagctcttcc cgt                                          23

 

<210>43

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>43

ctactgctgg agccagtacc tgtgctacgg tggaggtggt agcg                   44

 

<210>44

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>44

gatccgctac cacctccacc gtagcacagg tactggctcc agcagtag               48

 

<210>45

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>45

ctactgcgct gcagctgcag cttgctacgg tggaggtggt agcg                   44

 

<210>46

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>46

gatccgctac cacctccacc gtagcaagct gcagctgcag cgcagtag               48

 

<210>47

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成的

 

<400>47

 

Tyr Cys Ala Ala Ala Ala Ala Cys Tyr

1               5

 

<210>48

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>48

gatccggtgg aggtggtagc tactgctgga gccagtacct gtgctactga g           51

 

<210>49

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>引物

 

<400>49

aattctcagt agcacaggta ctggctccag cagtagctac cacctccacc g           51

 

<210>50

<211>795

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成的

 

<220>

<221>CDS    

<222>(1)..(795)

 

<400>50

atg tac agg atg caa ctc ctg tct tgc att gca cta agt ctt gca ctt    48

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1               5                   10                  15

gtc acg aat tcg atc tac tgc tgg agc cag tac ctg tgc tac ggt gga    96

Val Thr Asn Ser Ile Tyr Cys Trp Ser Gln Tyr Leu Cys Tyr Gly Gly

            20                  25                  30

ggt ggt agc gga tct gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca    144

Gly Gly Ser Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

        35                  40                  45

cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc    192

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

    50                  55                  60

aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg    240

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65                  70                  75                  80

gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg    288

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

                85                  90                  95

gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag    336

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

            100                 105                 110

tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag    384

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

        115                 120                 125

gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc    432

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

    130                 135                 140

ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc    480

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145                 150                 155                 160

cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc    528

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

                165                 170                 175

aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc    576

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

            180                 185                 190

gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac    624

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

        195                 200                 205

aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac    672

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

    210                 215                 220

agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc    720

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

225                 230                 235                 240

tca tgc tcc gtg atg cat gag ggt ctg cac aac cac tac acg cag aag    768

Ser Cys Ser Val Met His Glu Gly Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

                245                 250                 255

agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga    795

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

            260

 

<210>51

<211>264

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成构建体

 

<400>51

 

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1               5                   10                  15

Val Thr Asn Ser Ile Tyr Cys Trp Ser Gln Tyr Leu Cys Tyr Gly Gly

            20                  25                  30

Gly Gly Ser Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

        35                  40                  45

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

    50                  55                  60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65                  70                  75                  80

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

                85                  90                  95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

            100                 105                 110

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

        115                 120                 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

    130                 135                 140

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145                 150                 155                 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

                165                 170                 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

            180                 185                 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

        195                 200                 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

    210                 215                 220

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

225                 230                 235                 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Gly Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

                245                 250                 255

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

            260

 

<210>52

<211>795

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成的

 

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(795)

 

<400>52

atg tac agg atg caa ctc ctg tct tgc att gca cta agt ctt gca ctt    48

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1               5                   10                  15

gtc acg aat tcg atc tac tgc gct gca gct gca gct tgc tac ggt gga    96

Val Thr Asn Ser Ile Tyr Cys Ala Ala Ala Ala Ala Cys Tyr Gly Gly

            20                  25                  30

ggt ggt agc gga tct gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca    144

Gly Gly Ser Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

        35                  40                  45

cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc    192

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

    50                  55                  60

aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg    240

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65                  70                  75                  80

gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg    288

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

                85                  90                  95

gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag    336

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln  

            100                 105                 110

tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag    384

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

        115                 120                 125

gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc    432

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

    130                 135                 140

ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc    480

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145                 150                 155                 160

cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc    528

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

                165                 170                 175

aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc    576

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

            180                 185                 190

gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac    624

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

       195                 200                 205

aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac    672

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

    210                 215                 220

agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc    720

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

225                 230                 235                 240

tca tgc tcc gtg atg cat gag ggt ctg cac aac cac tac acg cag aag    768

Ser Cys Ser Val Met His Glu Gly Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

                245                 250                 255

agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga                                795

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

            260

 

<210>53

<211>264

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成构建体

 

<400>53

 

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1               5                   10                  15

Val Thr Asn Ser Ile Tyr Cys Ala Ala Ala Ala Ala Cys Tyr Gly Gly

            20                  25                  30

Gly Gly Ser Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

        35                  40                  45

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

    50                  55                  60

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

65                  70                  75                  80

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

                85                  90                  95

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

            100                 105                 110

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

        115                 120                 125

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

    130                 135                 140

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

145                 150                 155                 160

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr

                165                 170                 175

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

            180                 185                 190

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

        195                 200                 205

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

    210                 215                 220

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

225                 230                 235                 240

Ser Cys Ser Val Met His Glu Gly Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

                245                 250                 255

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

            260

 

<210>54

<211>723

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成的

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(723)

 

<400>54

atg tcc cct ata cta ggt tat tgg aaa att aag ggc ctt gtg caa ccc    48

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1               5                   10                  15

act cga ctt ctt ttg gaa tat ctt gaa gaa aaa tat gaa gag cat ttg    96

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

            20                  25                  30

tat gag cgc gat gaa ggt gat aaa tgg cga aac aaa aag ttt gaa ttg    144

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

        35                  40                  45

ggt ttg gag ttt ccc aat ctt cct tat tat att gat ggt gat gtt aaa    192

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

    50                  55                  60

tta aca cag tct atg gcc atc ata cgt tat ata gct gac aag cac aac    240

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65                  70                  75                  80

atg ttg ggt ggt tgt cca aaa gag cgt gca gag att tca atg ctt gaa    288

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

                85                  90                  95

gga gcg gtt ttg gat att aga tac ggt gtt tcg aga att gca tat agt    336

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

            100                 105                 110

aaa gac ttt gaa act ctc aaa gtt gat ttt ctt agc aag cta cct gaa    384

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

        115                 120                 125

atg ctg aaa atg ttc gaa gat cgt tta tgt cat aaa aca tat tta aat    432

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

    130                 135                 140

ggt gat cat gta acc cat cct gac ttc atg ttg tat gac gct ctt gat    480

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145                 150                 155                 160

gtt gtt tta tac atg gac cca atg tgc ctg gat gcg ttc cca aaa tta    528

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

                165                 170                 175

gtt tgt ttt aaa aaa cgt att gaa gct atc cca caa att gat aag tac    576

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

            180                 185                 190

ttg aaa tcc agc aag tat ata gca tgg cct ttg cag ggc tgg caa gcc    624

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

        195                 200                 205

acg ttt ggt ggt ggc gac cat cct cca aaa tcg gat ctg gtt ccg cgt    672

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg

    210                 215                 220

gga tcc ggt gga ggt ggt agc tac tgc tgg agc cag tac ctg tgc tac    720

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Cys Trp Ser Gln Tyr Leu Cys Tyr

225                 230                 235                 240

tga                                                                723

 

<210>55

<211>240

<212>PRT

<213>人工序列

 

<220>

<223>合成构建体

 

<400>55

 

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1               5                   10                  15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

            20                  25                  30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

        35                  40                  45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

    50                  55                  60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65                  70                  75                  80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

                85                  90                  95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

            100                 105                 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

        115                 120                 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

    130                 135                 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp    

145                 150                 155                 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

                165                 170                 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

            180                 185                 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

        195                 200                 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg

    210                 215                 220

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Cys Trp Ser Gln Tyr Leu Cys Tyr

225                 230                 235                 240