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达托霉素生产菌玫瑰孢链霉菌的代谢网络分析方法

摘要

发明涉及达托霉素生产菌玫瑰孢链霉菌的代谢网络分析方法。1)根据糖酵解途径、戊糖磷酸途径、柠檬酸循环、回补反应和细胞合成反应的达托霉素合成反应,构建出中心代谢网络模型;2)将代谢网络模型转化为矩阵S(m×n),收集发酵液,测量细胞干重、葡萄糖消耗速率、达托霉素生成速率和细胞生长速率;根据已知通量,求出未知通量。本发明将代谢网络分析技术应用于玫瑰孢链霉菌的代谢通量分析,通过测量胞外物质的代谢通量,计算得到胞内反应的代谢通量,反应出葡萄糖被菌体利用后在糖酵解途径、戊糖磷酸途径、柠檬酸循环和回补反应的分布情况,为定量化研究玫瑰孢链霉菌胞内的代谢特性提供了一个新的方法。

著录项

  • 公开/公告号CN101777094A

    专利类型发明专利

  • 公开/公告日2010-07-14

    原文格式PDF

  • 申请/专利权人 天津大学;

    申请/专利号CN201010103477.4

  • 发明设计人 闻建平;王国英;贾晓强;黄笛;

    申请日2010-02-01

  • 分类号G06F19/00(20060101);

  • 代理机构12201 天津市北洋有限责任专利代理事务所;

  • 代理人王丽

  • 地址 300072 天津市南开区卫津路92号天津大学

  • 入库时间 2023-12-18 00:05:42

法律信息

  • 法律状态公告日

    法律状态信息

    法律状态

  • 2011-11-16

    授权

    授权

  • 2010-09-15

    实质审查的生效 IPC(主分类):G06F19/00 申请日:20100201

    实质审查的生效

  • 2010-07-14

    公开

    公开

说明书

技术领域

本发明属于代谢工程领域,特别涉及达托霉素生产菌玫瑰孢链霉菌的代谢网络分析方法。

背景技术

“玫瑰孢链霉菌”(拉丁名称为:“Streptomyces roseosporus”)是一种链霉菌属的放线菌,其生长指数增长后期到稳定期合成的达托霉素(英文名“daptomycin”)为N-癸酰-L-色氨酰-L-天冬酰胺酰-L-天冬氨酰-L-苏氨酰-甘氨酰-L-鸟氨酰-L-天冬氨酰-D-丙氨酰-L-天冬氨酰-甘氨酰-D-丝氨酰-L-threo-3-甲基-谷氨酰-L-犬尿氨酰ε1-内酯,是由-个十碳烷侧链与-个环状β氨基酸肽链N-末端的色氨酸连接而成,是一种新型脂肽类抗生素。

达托霉素是一种钙离子依赖型的抗生素,在钙离子存在的条件下,达托霉素以非共价键的形式结合到细胞膜蛋白上,细胞膜上的达托霉素结合蛋白为其作用靶位,达托霉素可扰乱细胞膜对氨基酸的转运,从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的磷壁酸脂质的生物合成,改变细胞质膜的性质;另外,它还能通过破坏细菌的细胞膜,使其内容物外泄而达到杀灭细菌的目的。也有报道是其与细胞膜的结合,导致膜电位的降低,从而破坏胞内RNA和DNA的合成,最终抑制细菌生长。达托霉素由于独特的结构特征和作用机理,对于耐药菌,如耐万古霉素的肠球菌,耐甲氧西林的金葡菌,糖肽类敏感的金葡菌,凝固酶阴性的葡萄球菌和耐青霉素的肺炎链球菌的感染具有显著的治疗效果。是继万古霉素之后一种新型的抗生素,在治疗皮肤感染和心膜炎方面有着显著的疗效。2003年达托霉素成为第一个被美国FDA批准上市的首个脂肽类抗生素。2006年,达托霉素再次获得了欧洲药品评价署在整个欧洲的认证。

对生物代谢网络的研究日益受到人们的重视,主要是生物中的各组分成分的功能都是通过与其他部分的相互作用体现出来的,因此只有在系统水平上对所有成分进行整体分析才能对生物的生理功能有全面正确的了解。利用所构建的代谢网络模型,通过代谢通量分析,可以求得胞内物质代谢的分布情况。对于达托霉素的生产菌玫瑰孢链霉菌,目前还没有对其代谢网络分析的报道,因此构建玫瑰孢链霉菌的代谢网络模型,计算其胞内的代谢通量分布,能够更好地了解该菌种的代谢特性。

发明内容

本发明的目的是应用构建的玫瑰孢链霉菌的代谢网络模型计算碳代谢分布的方法,通过测量胞外反应的通量,计算出代谢网络模型中各胞内反应的代谢通量。

达托霉素生产菌玫瑰孢链霉菌的代谢网络分析方法如下:

1)根据糖酵解途径、戊糖磷酸途径、柠檬酸循环、回补反应和细胞合成反应的达托霉素合成反应,构建出中心代谢网络模型;

2)将代谢网络模型转化为矩阵S(m×n),其中m为胞内代谢物,n为反应,S(m,n)表示代谢物m在反应n中的计量系数,且有V表示反应通量(n维向量),在稳态条件下胞内代谢物的累积速率为0,则有SCVC+SKVK=0,其中下标C表示未知通量,K表示已知通量,未知通量由公式求出;

3)将玫瑰孢链霉菌在发酵罐中进行恒化培养,收集发酵液,测量细胞干重、葡萄糖消耗速率、达托霉素生成速率和细胞生长速率;

4)将步骤3中测得的葡萄糖消耗速率、达托霉素生成速率和细胞生长速率分别除以细胞干重,得到比葡萄糖消耗速率、比达托霉素生成速率和比细胞生长速率,则为3个已知通量,带入步骤2中的公式,求出未知通量。

本发明将代谢网络分析技术应用于玫瑰孢链霉菌的代谢通量分析,通过测量胞外物质的代谢通量,计算得到胞内反应的代谢通量,反应出葡萄糖被菌体利用后在糖酵解途径、戊糖磷酸途径、柠檬酸循环和回补反应的分布情况,为定量化研究玫瑰孢链霉菌胞内的代谢特性提供了一个新的方法。

附图说明

图1为实施例1中构建的代谢网络示意图。

图2为实施例1中矩阵S、SC和SK以及向量V、VC和VK的示意图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明:

实施例1:

根据生物化学中关于代谢反应的知识,构建中心碳代谢网络,包括糖酵解途径、戊糖磷酸途径、柠檬酸循环、回补反应、细胞合成反应和达托霉素合成反应;根据达托霉素的氨基酸组成和合成这些氨基酸的前体物质,将达托霉素表示为由前体物质合成,氨基酸合成的前体物质参照Stephanopoulos等人所著的《代谢工程-原理与方法》(赵学明等译,化学工业出版社,1998);细胞的前体物质组成参照Schilling等人在《Biotechnology andBioengineering》(Vol.71:286-306,2001)发表的“Combining pathway analysis with fluxbalance analysis for the comprehensive study of metabolic systems”,得到的代谢网络包括15个胞内代谢物和18个反应。

表1代谢网络反应列表

表1中,“→”表示不可逆反应,表示表示可逆反应,反应18中“细胞”的单位为1/h,所有其它反应物的单位为mmol/(g细胞干重·h);反应1为葡萄糖活化反应,反应2-6为糖酵解途径,反应7-11为磷酸戊糖途径,反应12为回补反应,反应13-16为柠檬酸循环,反应17为达托霉素合成反应,反应18为细胞合成反应。

图1中V1-V18分别为表1中反应1-18的代谢通量,V17和V18的“前体物质”的见表1中的反应17和18。

表2为实施例1中代谢网络的胞内代谢物列表。其中代谢物为表1所列反应中胞内的代谢物质,共有15个。

表2代谢网络中胞内代谢物列表

2.将构建的代谢网络转化为矩阵S(m×n),其中m为胞内代谢物(15个),n为反应(18个),S(m,n)表示代谢物m在反应n中的计量系数,矩阵的自由度为n-m=3,已知通量有反应1、17和18的代谢通量共3个,自由度=已知通量个数,为正定矩阵;未知通量为反应2,3…16的代谢通量,用下列公式求解

>VC=-(SCT)-1SKTVK>

其中V表示反应通量,上标T表示转置矩阵,下标C表示未知通量,K表示已知通量。如图2所示,其中图(1)-(6)分别表示S、SC、SK、V、VC和VK,图中(1)-(3)的横坐标1-18分别表示表1中的反应1-18,纵坐标1-15分别表示表2中胞内代谢物1-15。

3.在室温下将玫瑰孢链霉菌在3升自动发酵罐进行恒化培养,装液量为2升,控制pH 7.0,温度30℃,转速400rpm,通气量0.8vvm,以2ml/h的速度向发酵罐中流加癸酸∶氨水(体积比2∶1)溶液,并以48ml/h的速度流加发酵培养基,同时以50ml/h的速度从发酵罐中抽取发酵液,保持发酵罐中液量的稳定。发酵培养基的组成及质量含量为:葡萄糖40g/l,MgSO4·7H2O 1g/l,K2HPO4·3H2O 2g/l,CaCl2·2H2O 1g/l,FeSO4·7H2O 0.05g/l,pH 7.0。测量的葡萄糖消耗速率、细胞生长速率、达托霉素生成速率和细胞干重分别为2.285mmol/(1·h)、0.251g/(1·h)、0.001mmol/(1·h)和5.02g/l。

4.将步骤3中测得的葡萄糖消耗速率、细胞生长速率和达托霉素生成速率分别除以细胞干重,得到比葡萄糖消耗速率、比达托霉素生成速率和比细胞生长速率分别为0.4552mmol/(g细胞干重·h)、0.0002mmol/(g细胞干重·h)和0.051/h,分别为V1,V17和V18,带入步骤2中的公式,求出未知通量V2,V3…V16。

表3为实施例1中计算得到的代谢通量,其中反应1-18分别对应表1中的反应,反应1-17的代谢通量单位为mmol/(g细胞干重·h),反应18的代谢通量单位为1/h。

表3实施例1中计算得到的代谢通量分布

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