具有降低绝经期妇女骨相关疾病发病风险的接骨木活性部位及其应用

摘要

本发明公开了一种具有改善绝经后骨量丢失作用的接骨木活性部位，其化学成分明确，主要含有7个化合物：香草酸、松柏醇、左旋赤式愈创木基丙三醇-β-O-4′-松柏醇基醚、右旋苏式-1-(4羟基-3-甲氧苯基)-2-[-4-(3-羟丙基)-2-羟基苯氧基]-1，3-丙二醇、右旋苏式愈创木基丙三醇-β-O-4′-松柏醇基醚、去氢二松柏醇，二氢去氢二松柏醇。该活性部位能够显著改善去卵巢小鼠的骨质流失，提高股骨及胫骨骨密度，增加骨容积，且不增加子宫重量，是一种安全有效地缓解和改善绝经期妇女骨相关疾病各种症状的成分。本发明的有益效果是提供了一种接骨木活性部位，可用于制备具有防治绝经后骨相关疾病作用的药物、食品或食品添加剂。

说明书

技术领域

本发明涉及接骨木活性部位对绝经后骨的保护作用，具体的说是接骨木活性部位及所含活性成分在制备预防或治疗绝经后骨相关疾病的药物或保健品中的应用。

背景技术

20世纪随着医疗水平的进步、人类寿命的延长，女性绝经后的生存时间有了显著的延长。因此，由绝经所引发的更年期综合征、肥胖症、骨质疏松、泌尿生殖道萎缩、糖尿病、心血管疾病与老年痴呆等疾病的发病率也有了显著的增加。这些疾病不仅影响了患者个人的生活质量，亦给社会和家庭带来了沉重的负担。

女性绝经后1～10年内，体内会出现钙的快速丢失，易于发生骨质疏松症。骨质疏松是一种骨量减少，骨组织显微结构破坏，骨骼脆性增加，从而易于发生骨折的全身性骨骼疾病[1]。WHO资料显示，骨质疏松居于老年人常见病、多发病的第六位[2]。在欧洲、日本和美国，每年有超过7500万人患有骨质疏松症。50％的女性可因骨质疏松而发生骨折；据统计，骨质疏松骨折所致的死亡率超过乳腺癌、宫颈癌和子宫内膜癌的总和[3-6]。我国是全世界老龄人口最多的国家，目前受到骨质疏松症威胁的老年人群有8400万，随着人口老龄化加剧，这个数字还在逐步增长[7]。

近几十年来，治疗绝经后骨质疏松症的药物发展迅速。目前所用的治疗药物主要为合成药，包括雌激素、降钙素、二磷酸盐等抗骨质吸收药物，氟化物等促进骨形成药物，钙剂、维生素D等骨矿化药物。这些药物能够不同程度地预防骨质疏松症的发生，缓解病痛症状、降低骨折发生率，但也存在着毒副作用大、远期疗效不肯定，价格昂贵等多方面的缺点。至今尚无一种集高效、安全、毒副作用小、经济等优点于一身的理想药物。

我国先民在2000多年前的传统医学著作《素问》中，就对男女在生长发育不同阶段骨的变化作了详细描述。传统医学认为：肾为先天之本，肾主骨生髓，骨的生长、发育、强劲、衰弱都与肾精的盛哀有密切关系。肾精亏损，则骨髓生长乏源，骨骼失养，骨矿含量下降，骨密度下降，则会产生“骨枯”、“骨极”、“骨痿”，即现代医学定义的骨质疏松。中医药的辩证施治也将骨与肾紧密相连，提出补肾益精、补肾益肝、补肾健脾、补肾活血益气等治疗方法。中草药资源丰富、毒副作用小、价格相对低廉且有丰富的中医理论和临床实践支持，已成为当代寻找治疗骨质疏松药物的重要源泉。

接骨木(Sambucus williamsii Hance)始载于《唐本草》，别名续骨木(《纲目》)、铁骨散(《植物名实图考》)、接骨丹(《草木便方》)等，为忍冬科接骨木的干燥茎枝。其味甘、苦，性平，无毒，归肝经。接骨木具有祛风利湿、活血止痛、接骨续筋的功效，主要用于治疗风湿筋骨疼痛、腰痛、跌打肿痛、骨折、创伤出血等症[8]。现代药理学研究表明接骨木所含的部分木脂素成分在体外能够促进成骨样细胞增殖和ALP活性。然而对于上述成分的研究缺乏体内动物药效学实验证据，同时接骨木抗骨质疏松活性部位及其作用机理也尚未明晰。为此，有必要对其提取物及其馏分，采用国际公认的药效学动物模型，开展深入的研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是确定接骨木活性部位及所含的主要活性成分。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种接骨木活性部位，用于制备预防或治疗绝经后骨相关疾病的药物、食品或食品添加剂，以及接骨木活性部位与具有缓解和改善骨相关疾病的药物、传统中药、天然产物混合，制备具有防治绝经后骨相关疾病作用的药物、食品或食品添加剂。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明公开了接骨木活性部位，及其所含的主要活性成分，该活性部位的成分主要有7个化合物：香草酸、松柏醇、左旋苏式愈创木基丙三醇-β-O-4′-松柏醇基醚、右旋赤式-1-(4羟基-3-甲氧苯基)-2-[-4-(3-羟丙基)-2-甲氧苯氧基]-1，3-丙二醇、右旋苏式愈创木基丙三醇-β-O-4′-松柏醇基醚、去氢二松柏醇，二氢去氢二松柏醇，所述7个化合物的化学结构式分别是：

所述接骨木活性部位按重量百分比该活性部位由以下化学成分组成：

香草酸(1)                                        0.5％-5％

松柏醇(2)                                        0.5％-10％

左旋赤式愈创木基丙三醇-β-O-4′-松柏醇基醚(3)    1.0％-15％

右旋苏式-1-(4羟基-3-甲氧苯基)-2-[-4-(3-羟丙基)

-2-羟基苯氧基]-1，3-丙二醇(4)                    1.0％-15％

右旋苏式愈创木基丙三醇-β-O-4′-松柏醇基醚(5)    1.0％-15％

去氢二松柏醇(6)                                  2.0％-20％

二氢-去氢二松柏醇(7)                            2.0％-20％

其他组分                                        余量

所述其他组分主要是提取过程中得到的其他苯丙素、木脂素、酚酸及糖苷类物质。

所述接骨木活性部位的HPLC指纹图谱包含10个主要色谱峰，其中7个色谱峰的化学结构已经被准确指认，以去氢二松柏醇(峰9)的保留时间为1计算得到的各色谱峰的相对保留时间，分别为0.40±0.02(香草酸)、0.55±0.02(松柏醇)、0.67±0.02(左旋赤式愈创木基丙三醇-β-0-4′-松柏醇基醚)、0.69±0.02(右旋苏式-1-(4羟基-3-甲氧苯基)-2-[-4-(3-羟丙基)-2-羟基苯氧基]-1，3-丙二醇)、0.71±0.02(右旋苏式愈创木基丙三醇-β-O-4′-松柏醇基醚)、1.00(去氢二松柏醇)、1.02±0.02(二氢-去氢二松柏醇)。

所述接骨木活性部位的HPLC指纹图谱是采用反相高效液相色谱法建立的，所述反相高效液相色谱法的条件是：以十八烷基硅氧键和硅胶为固定相；以含有0.1％醋酸的甲醇-水溶液作为流动相，梯度洗脱：流速为0.8mL/min；检测波长为280nm；色谱柱温度为35℃，以去氢二松柏醇计算理论塔板数，不低于2000。

本发明公开了一种接骨木活性部位的制备方法，其特征是通过以下步骤实现：

(1)接骨木干燥茎枝适当粉碎后，用甲醇、乙醇或水，采用不同提取次数和时间，通过冷提取、热提取或者超声提取提取，收集提取液，将提取液减压浓缩后得到接骨木总提物；

(2)以适量水溶解接骨木总提物，进行大孔树脂开放柱层析，用水或30％-95％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得到洗脱部分即为接骨木活性部位。

上述提取步骤中，在步骤(1)中优选用10倍量的60％乙醇，加热回流提取3次，每次2小时；在步骤(2)中优选用50％乙醇洗脱。

本发明公开了接骨木活性部位在制备缓解及改善绝经期妇女骨相关疾病的药物中的应用。所述药物是药学上可接受的剂型，所述剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、口服液。

本发明公开了接骨木活性部位在制备缓解及改善绝经期妇女骨相关疾病的食品或食品添加剂中的应用。

将前述接骨木活性部位，直接与适量药物制剂辅料或食品混合，制成适于服用的药物、食品或食品添加剂。或将前述接骨木活性部位与一种或多种具有缓解或改善骨相关疾病的药物、传统中药、天然产物(淫羊藿、仙茅、女贞子、熟地、当归、泽泻等)及适量辅料混合，制成药品、食品或食品添加剂。对制得的含有接骨木活性部位的药品、食品或食品添加剂进行去卵巢小鼠骨相关疾病的活性评价，结果显示与病理模型组比较，上述含有接骨木活性部位的药品、食品或食品添加剂可以不同程度的抑制去卵巢所引发的股骨及胫骨的骨量丢失，而对子宫指数无影响。表明上述含有接骨木活性部位的药品、食品或食品添加剂具有不同程度的缓解和改善绝经后骨质丢失，提高股骨及胫骨骨密度，增加骨容积，且不增加子宫重量，提示上述药品、食品或食品添加剂能够安全有效地缓解和改善绝经后妇女骨相关疾病各种症状。

综上，本发明公开的接骨木活性部位能够显著改善去卵巢小鼠的骨质流失，提高股骨及胫骨骨密度，增加骨容积，且不增加子宫重量，是一种安全有效地缓解和改善绝经期妇女骨相关疾病各种症状的成分。本发明的有益效果是提供了一种接骨木活性部位，可以用于制备具有防治绝经后骨相关疾病作用的药物、食品或食品添加剂。

附图说明

图1是通过HPLC分析液相确定的接骨木50％乙醇洗脱部分的指纹图谱；

图2是从接骨木50％乙醇洗脱部分中分离得到的7个化合物的化学结构图；

图3是从接骨木50％乙醇洗脱部分中分离得到的化合物1在相同HPLC条件下的色谱峰指认图谱；

图4是从接骨木50％乙醇洗脱部分中分离得到的化合物2在相同HPLC条件下的色谱峰指认图谱；

图5是从接骨木50％乙醇洗脱部分中分离得到的化合物3在相同HPLC条件下的色谱峰指认图谱；

图6是从接骨木50％乙醇洗脱部分中分离得到的化合物4在相同HPLC条件下的色谱峰指认图谱；

图7是从接骨木50％乙醇洗脱部分中分离得到的化合物5在相同HPLC条件下的色谱峰指认图谱；

图8是从接骨木50％乙醇洗脱部分中分离得到的化合物6在相同HPLC条件下的色谱峰指认图谱；

图9是从接骨木50％乙醇洗脱部分中分离得到的化合物7在相同HPLC条件下的色谱峰指认图谱；

图10是本发明接骨木各馏分对小鼠子宫重量的影响分析图；

图11是本发明接骨木各馏分对小鼠股骨及胫骨骨密度的影响分析图；

图12是本发明接骨木各馏分对小鼠股骨及胫骨骨容积的影响分析图。

具体实施方式

以下结合实施例以及应用研究、验证的数据进一步阐述本发明的技术方案，但发明内容并不局限于所列实施例。

实施例1：接骨木活性部位的制备方法

取接骨木的干燥茎枝50公斤，经适当粉碎后，用10倍量的60％乙醇加热回流提取3次，每次2小时。合并提取液，减压蒸去溶剂，得到接骨木总提物2160克。随后取接骨木总提物1250克，以适量水溶解，进行大孔树脂开放柱层析，依次用5倍柱床体积的水、30％、50％、95％的乙醇-水溶液梯度洗脱，收集各部分洗脱液，分别减压回收溶剂，得到水洗脱部分712.5克，30％乙醇洗脱部分160克，50％乙醇洗脱部分125克及95％乙醇洗脱部分111克，其中50％乙醇洗脱部分即为接骨木活性部位(活性筛选数据，参见实施例4、5)。

实施例2：接骨木活性部位中主要成分的分离及鉴定

实施例1中制备的接骨木50％乙醇洗脱部分通过HPLC分析液相确定了其指纹图谱，见图1。在指纹图谱指导下经过ODS柱色谱、HW 40柱色谱、RP-HPLC制备液相等分离手段，通过HPLC、MS、NMR等分析鉴定方法，确定了7个化合物，香草酸(1)、松柏醇(2)、左旋苏式愈创木基丙三醇-β-O-4′-松柏醇基醚(3)、右旋赤式-1-(4-羟基-3-甲氧苯基)-2-[-4-(3-羟丙基)-2-羟基苯氧基]-1，3-丙二醇(4)、右旋赤式愈创木基丙三醇-β-O-4′-松柏醇基醚(5)、去氢二松柏醇(6)，二氢去氢二松柏醇(7)。

分离得到化合物结构式见图2。在与接骨木50％乙醇洗脱部分HPLC指纹图谱相同的色谱条件下，对分离得到的化合物进行指认，具体指认过程见图3。

2.1具体分离过程如下

接骨木50％乙醇洗脱部分(SWC)20.33g，60％乙醇-水溶解、过滤，滤液进行ODS中低压柱色谱分离(φ2.2×30cm)，30％、50％、100％甲醇-水梯度洗脱，得到三个馏分：SWC1(5.20g)，SWC2(7.68g)，SWC3(4.19g)。SWC1经过HW 40柱色谱分离(φ3×60cm)，20％、40％、100％甲醇-水梯度洗脱得到6个馏分(fraction A-F)，其中fraction C(40％甲醇-水洗脱物)再经过ODS柱色谱分离，30％、50％、100％甲醇-水梯度洗脱得到7个馏分(subfractionC1-7)，对得到的馏分SubfractionC2(30％甲醇-水洗脱物)进行制备型高效液相分离，以28％甲醇-水洗脱，得到化合物2(7.2mg)；对SubfractionC3(30％甲醇-水洗脱物)进行制备型高效液相分离，30％甲醇-水洗脱，随后进一步通过Sephadex LH 20柱色谱纯化后，得到化合物3(15.3mg)。同样fraction D(40％甲醇-水洗脱物)经过ODS柱色谱，30％、50％、100％甲醇-水梯度洗脱及制备型高效液相分离，30％甲醇-水洗脱，得到化合物1(31.0mg)、4(15.2mg)、5(15.4mg)。SWC2经过HW 40柱色谱分离(φ3×60cm)，20％、40％、100％甲醇-水梯度洗脱得到7个馏分(fraction A-G)，其中fraction C(20％甲醇-水洗脱物)进行制备型高效液相分离，40％甲醇-水洗脱，得到化合物7(180.0mg)；fractionD(40％甲醇-水洗脱物)经过ODS柱色谱分离(φ3×60cm)，30％、50％、100％甲醇-水梯度洗脱后得到5个馏分(subfraction D 1-5)，其中subfraction D3进一步进行ODS柱色谱分离(φ1×30cm)，30％甲醇-水等度洗脱后得到4个馏分(subfraction D3a-d)，其中subfraction D3c进行制备型高效液相分离，38％甲醇-水洗脱，得到化合物6(22.7mg)。

2.2化合物结构解析过程如下

2.21化合物1

白色粉末(甲醇)。ESI-MS实验给出m/z 167[M-H]^-，提示这是一个分子量为168的小分子化合物。

化合物1的¹H NMR图谱较简单，低场区只有三组信号，δ7.55(1H，d，J＝8.7，1.9Hz，H-6)；δ7.54(1H，d，J＝1.9Hz H-2)；δ6.83(1H，d，J＝8.7Hz，H-5)和，为典型的苯环ABX耦合系统氢信号。高场区有一个甲氧基信号δ3.88(3H，s，3-OMe)。

化合物的¹³C NMR显示一个羰基信号δ170.1，由于化学位移相对于醛羰基偏向高场，说明这是一个酸羰基或酯羰基。此外在低场区还出现6个苯环上的碳信号：δ152.7(C-4)，δ148.7(C-3)，δ125.3(C-6)，δ123.2(C-1)，δ113.9(C-2)及在高场区出现1个甲氧基碳信号。

经过与文献[9]比较，化合物1的结构确定为3-甲氧基-4-羟基苯甲酸，即香草酸，vanillic acid，化合物的¹³C NMR参见表1。

2.22化合物2

淡黄色胶状固体(甲醇)。ESI-MS实验给出m/z 179[M-H]^-，提示这是一个分子量为180的小分子化合物。

显示在低场区有一组典型的苯环ABX耦合氢信号δ6.98(1H，d，J＝1.9Hz，H-2)；δ6.83(1H，dd，J＝8.1，1.9Hz，H-6)；δ6.72(1H，d，J＝8.1Hz，H-5)和一对反式烯氢信号δ6.52(1H，d，J＝15.8Hz，H-7)；δ6.49(1H，dt，J＝15.8，5.9Hz，H-8)。高场区显示一个亚甲基氢信号δ4.18(2H，dd，J＝5.9，1.4Hz，H-9)，由其裂分情况可知其连接在双键上，此外还有一个甲氧基氢信号δ3.85(3H，s，H-10)。

在化合物的¹³C NMR和DEPT-135图谱上，可以清楚的看到在δ132.1，121.0处的不饱和双键的碳信号，δ63.9处的亚甲基碳信号及δ56.4处的甲氧基碳信号，其余为苯环上碳信号。因此确定化合物2结构为松柏醇(Coniferylalcohol)。化合物的核磁数据参见表1。

表1化合物1和2的¹H NMR(400MHz，CD₃OD)和¹³C NMR(100MHz，CD₃OD)数据

2.23化合物3

黄色油状(甲醇)，[α]²⁷_D-1.5°(c＝0.67，MeOH)。结合¹H NMR、¹³C NMR和DEPT-135确定化合物的分子式为C₂₀H₂₄O₇，计算其不饱和度为9。

在化合物3的¹H NMR(400MHz，in CD₃OD)图谱上，低场区给出8组氢信号，其中一个单峰积分值为2。尽管有信号重叠，但根据化学位移值及耦合常数仍可以判断存在2个ABX耦合系统和1个反式双键耦合，ABX耦合系统分别为δ7.01(1H，d，J＝1.8Hz，H-2)，δ6.72(1H，d，J＝8.1Hz，H-5)和δ6.83(1H，dd，J＝8.1，1.8Hz，H-6)；δ6.98(1H，d，J＝1.9Hz，H-2′)，δ6.86(1H，H-5′)和δ6.86(1H，H-6′)，反式双键为δ6.50(1H，d，J＝16.0Hz，H-7′)和δ6.22(1H，dt，J＝15.8，5.8Hz，H-8′)。

1H NMR图谱在高场区有2个明显的甲氧基信号：δ3.86(3H，s，3-OMe)，δ3.82(3H，s，3′-OMe)；2个连氧次甲基氢信号：δ4.82(1H，d，J＝5.8Hz，H-7)，δ4.35(1H，m，H-8)；1个连氧亚甲基氢信号：δ4.18(2H，dd，J＝5.8，1.4Hz，H-9′)以及1个被甲氧基氢掩盖的连氧亚甲基氢信号：δ3.81(2H，o，H-9)。

化合物3的¹³C NMR (100MHz，in CD3OD)图谱给出20个碳信号，结合DEPE-135图谱，显示低场区有6个SP2杂化的季碳信号：δ151.9(C-3′)、148.9(C-4′)、148.7(C-3)、147.0(C-4)、134.1(C-1)、133.1(C-1′)，8个SP2杂化叔碳信号：δ131.4(C-7′)、128.5(C-8′)、121.0(C-6)、120.7(C-6′)、118.9(C-5′)、115.7(C-5)、111.9(C-2)、111.4(C-2′)；2个连氧的次甲基碳信号：δ86.2(C-8)、74.1(C-7)，还有2个连氧的亚甲基碳信号：δ63.7(C-9′)、62.2(C-9)以及2个甲氧基碳信号δ56.5(3-OMe)、56.3(3′-OMe)。核磁数据与文献[10，11]报道的核磁数据基本一致，化合物3确定为左旋赤式愈创木基丙三醇-β-O-4′-松柏醇基醚，即(-)-erythro-guaiacylglycerol-β-O-4′-conifery ether。核磁数据见表2。

2.24化合物4

黄色油状(甲醇)，[α]²⁶_D11.3°(c＝0.67，MeOH)。ESI-MS给出m/z387[M+Na]⁺，363[M-H]^-提示化合物的分子量为364。结合¹H NMR、¹³C NMR和DEPT-135确定化合物的分子式为C₁₉H₂₄O₇，计算其不饱和度为8。

化合物4与化合物3在¹HNMR (400MHz，in CD₃OD)低场区的图谱比较相似，除少了1个反式烯键耦合的氢外，也类似的有2个ABX耦合系统：δ7.00(1H，d，J＝1.8Hz，H-2)，δ6.75(1H，d，J＝8.1Hz，H-5)和δ6.84(1H，dd，J＝8.2，1.8Hz，H-6)；δ6.68(1H，d，J＝2.0Hz，H-2′)，δ6.90(1H，d，J＝8.2Hz H-5′)和δ6.55(1H，dd，J＝8.3，2.1Hz H-6′)。

在高场，除了只有一个甲氧基氢信号及在最低场出现2个亚甲基氢信号外，其余氢信号也与化合物3类似，甲氧基氢信号：δ3.80(3H，s，3-OMe)；2个亚甲基氢信号：δ2.54(2H，t，J＝7.4Hz，H-7′)，δ1.77(2H，m，H-8′)；2个连氧次甲基氢信号：δ4.89(1H，d，J＝6.2Hz，H-7)，δ4.07(1H，dd，J＝10.5，4.8Hz，H-8)；2个连氧亚甲基氢信号：δ3.72(1H，dd，J＝11.8，4.1Hz，H-9′b)，δ3.47(1H，dd，J＝11.8，5.0Hz，H-9′a)，δ3.53(2H，t，J＝6.5Hz H-9)。

化合物4的¹³C NMR(100MHz，in CD₃OD)图谱给出19个碳信号，结合DEPE-135图谱，可以看出与化合物3比较少了一个甲氧基碳信号及两个烯碳信号，其余碳信号较类似。低场区6个SP2杂化的季碳信号：δ149.3(C-3′)、146.0(C-4′)、148.9(C-3)、147.3(C-4)、134.0(C-1)、138.6(C-1′)，6个SP2杂化叔碳信号：120.8(C-6)、120.6(C-6′)、119.5(C-5′)、117.2(C-2′)、116.0(C-5)、111.5(C-2)；高场区有2个连氧的次甲基碳信号：δ87.8(C-8)、74.2(C-7)，还有2个连氧的亚甲基碳信号：δ62.3(C-9′)、61.8(C-9)以及1个甲氧基碳信号δ56.3(3-OMe)。

由于化合物4中C-8的化学位移值δ87.8(C-8)与化合物3中的δ86.2(C-8)相比向低场位移，由此推断，该化合物相对构型为反式。参照文献[12]，确定化合物4为右旋苏式-1-(4-羟基-3-甲氧苯基)-2-[-4-(3-羟丙基)-2-羟基苯氧基]-1，3-丙二醇，即(+)-thero-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-[-4-(3-hydroxypropanyl)-2-hydroxy-phenoxy]-1，3-propanediol。

核磁数据见表2。

2.25化合物5

黄色油状(甲醇)，[α]²⁷_D11.9°(c＝0.67，MeOH)。ESI-MS给出m/z399[M+Na]⁺，775[2M+Na]⁺提示化合物的分子量为376。结合¹H NMR、¹³C NMR和DEPT-135确定化合物的分子式为C₂₀H₂₄O₇，计算其不饱和度为9。

化合物5的与化合物3的¹H NMR(400MHz，in CD₃OD)图谱比较相似，在低场区给出8组氢信号，根据化学位移和耦合常数可以确定也存在两个ABX耦合系统和一个反式双键耦合，ABX耦合系统为：δ7.02(1H，d，J＝1.8Hz，H-2)，δ6.75(1H，d，J＝8.1Hz，H-5)和δ6.85(1H，dd，J＝8.1，1.8Hz，H-6)；δ7.04(1H，d，J＝1.9Hz，H-2′)，δ6.99(1H，d，J＝8.3Hz H-5′)和δ6.90(1H，dd，J＝8.3，1.9HzH-6′)，反式双键为δ6.52(1H，d，J＝16.0Hz，H-7′)和δ6.24(1H，dt，J＝16.0，5.7Hz，H-8′)，不过这里的H-5和H-6未重叠，有了很好的裂分。

在高场区有2个明显的甲氧基信号：δ3.86(3H，s，3-OMe)，δ3.82(3H，s，3′-OMe)；2个连氧次甲基氢信号：δ4.89(1H，d，J＝5.8Hz，H-7)，δ4.28(1H，m，H-8)和1个连氧亚甲基氢信号：δ4.19(2H，dd，J＝5.8，1.4Hz，H-9′)都发生了一些变化；而被掩藏在甲氧基里的1个亚甲基氢信号在该化合物中向高场位移至δ3.72(1H，dd，J＝11.9，4.1Hz，H-9b)，δ3.47(1H，dd，J＝11.9，5.4Hz H-9a)。

化合物5与化合物3的¹³C NMR数据更为接近，仅是化合物3中C-8的化学位移值δ86.2(C-8)在化合物5中向低场位移至δ87.2(C-8)。根据核磁数据推测化合物5与3结构相同，仅立体构型不同，与文献[11]对比，肯定了这种推测，确定化合物5为右旋苏式愈创木基丙三醇-β-O-4′-松柏醇基醚，即(+)-thero-guaiacylglycerol-β-O-4′-conifery ether。核磁数据见表2。

表2化合物3、4和5的¹H NMR(400MHz，CD₃OD)和¹³C NMR(100MHz，CD₃OD)数据

2.26化合物6

黄色油状，[α]²⁶_D10.4°(c＝0.67，MeOH)。结合¹H NMR、¹³C NMR和DEPT-135确定化合物的分子式为C₂₀H₂₂O₆，计算其不饱和度为10。

在化合物6的¹H NMR(400MHz，in CD₃OD)图谱上，低场显示8组氢信号。根据化学位移值和耦合常数推断含1个ABX耦合系统、1个四取代的苯环及1个反式双键耦合。ABX耦合系统：δ6.94(1H，d，J＝1.8Hz，H-2)，δ6.81(1H，d，J＝8.1Hz，H-5)和δ6.82(1H，dd，J＝8.1，1.8Hz，H-6)；四取代苯环：δ6.95(1H，s，H-2′)，δ6.93(1H，s，H-6′)；反式双键耦合：δ6.53(1H，d，J＝15.9Hz，H-7′)，δ6.21(1H，dt，J＝15.8，5.9Hz，H-8′)。

在¹H NMR图谱的高场区，可以看到两个明显的甲氧基信号：δ3.86(3H，s，3-OMe)，δ3.80(3H，s，3′-OMe)；2个次甲基氢信号：δ5.51(1H，d，J＝6.3Hz，H-7)，δ3.48(1H，dd，J＝12.3，6.2Hz，H-8)；1个连氧亚甲基氢信号：δ4.19(2H，dd，J＝5.9，1.3Hz，H-9′)以及1个被甲氧基氢掩盖的连氧亚甲基氢信号：δ3.73-3.85(2H，o，H-9)。

化合物6的¹³C NMR(100MHz，in CD₃OD)图谱给出20个碳信号，结合DEPE-135图谱，显示低场区有7个SP2杂化的季碳信号：149.2(C-4′)、δ145.5(C-3′)、149.1(C-3)、147.6(C-4)、134.5(C-1)、132.5(C-5′)、130.3(C-1′)，7个SP2杂化叔碳信号：δ132.0(C-7′)、127.5(C-8′)、119.8(C-6)、116.5(C-6′)、116.2(C-5)、112.1(C-2′)、110.5(C-2)；1个连氧的次甲基碳信号：1个次甲基碳信号δ55.1(C-8)；2个连氧的亚甲基碳信号：δ64.8(C-9)、63.9(C-9′)以及2个甲氧基碳信号δ56.7(3-OMe)、56.4(3′-OMe)。核磁数据与文献[13]报道的核磁数据基本一致，化合物6确定为去氢二松柏醇，即dehydrodiconiferylalcohol。核磁数据见表3。

2.27化合物7

黄色油状，[α]²⁶_D17.3°(c＝0.67，MeOH)。ESI-MS给出m/z 383[M+Na]⁺，359[M-H]^-提示化合物的分子量为360。结合¹H NMR、¹³C NMR和DEPT-135确定化合物的分子式为C₂₀H₂₄O₆，计算其不饱和度为9。

化合物7的¹H NMR(400MHz，in CD₃OD)图谱，在低场区显示一个典型的ABX耦合系统和一个积分值为2的单峰，ABX耦合系统：δ6.94(1H，d，J＝1.8Hz，H-2)，δ6.83(1H，dd，J＝8.2，1.7Hz，H-6)和δ6.75(1H，d，J＝8.1Hz，H-5)；单峰：δ6.71(1H，s，H-2′)，δ6.71(1H，s，H-6′)。

在¹H NMR图谱的高场区，可以看到两个明显的甲氧基氢信号：δ3.80(3H，s，3-OMe)，δ3.84(3H，s，3′-OMe)；此外还有1个连氧亚甲基氢信号：δ3.56(2H，t，J＝6.5Hz，H-9′)；2个亚甲基信号：δ2.60(2H，t，J＝8.0Hz，H-7′)，δ1.80(2H，m，H-8′)；2个次甲基氢信号：δ5.48(1H，d，J＝6.2Hz，H-7)，δ3.46(1H，dd，J＝12.4，6.2Hz，H-8)以及2个单氢信号：δ3.82(1H，m)，δ3.76(1H，m)。

化合物7的¹³C NMR(100MHz，in CD₃OD)图谱与化合物6较相似，除了在低场区少了两个烯碳而在高场区增加了两个仲碳外，其余较接近，由此推断化合物7是化合物6双键氢化后的衍生物。核磁数据与文献[10，14]基本一致，该化合物确定为二氢去氢二松柏醇，即dihydrodehydodiconiferyl alcohol。核磁数据见表3。

表3化合物6和7的¹H NMR(400MHz，CD₃OD)和¹³C NMR(100MHz，CD₃OD)数据

实施例3：指纹图谱的建立及各化合物的指认

3.1指纹图谱的建立

取上述接骨木50％乙醇洗脱部分40mg，溶解于2mL 60％甲醇-水后过ODS固相萃取柱，10mL甲醇洗脱，洗脱液蒸干后，溶于2mL甲醇，再过0.45μm滤膜，即得接骨木活性部位的供试品溶液。

精密取上述供试品溶液10μL，参照国家药典附录中规定的高效液相分析方法，注入高效液相色谱仪进行色谱分析，记录色谱图(见图1)。液相色谱条件为：采用十八烷基硅氧键合硅胶为固定相；以含有0.1％醋酸的甲醇-水溶液作为流动相，梯度洗脱；流速为0.8mL/min；检测波长为280nm；色谱柱温度为35℃。获得的接骨木活性部位高效液相标准指纹图谱有10个色谱峰，以9号峰的色谱保留时间为1.00计算得到的各色谱峰的相对保留时间，分别为0.40±0.02(峰1)、0.55±0.02(峰2)、0.67±0.02(峰3)、0.69±0.02(峰4)、0.71±0.02(峰5)、0.73±0.02(峰6)、0.86±0.02(峰7)、0.93±0.02(峰8)、1.00(峰9)、1.02±0.02(峰10)。以去氢二松柏醇(9号峰)计算，理论塔板数不低于2000。

3.2各化合物的色谱峰指认

各化合物适量分别溶于甲醇中，过0.45μm的滤膜后，制得供试品溶液。参照国家药典附录中规定得高校液相分析方法，依次注入高效液相色谱仪进行色谱分析，分别记录色谱图(见图3、图4、图5、图6、图7、图8、图9)，色谱条件与实施例3.1相同。从而，借助分离得到的化合物1-7作为对照品，完成了对HPLC特征图谱中主要色谱峰的化学指认。

实施例4：实施例1制得的接骨木总提物及总提物的各洗脱馏分对体外培养的类成骨UMR 106细胞的影响

以大鼠成骨样UMR 106细胞的增殖和ALP活性，评价实施例1中得到化合物的体外抗骨质疏松活性。

4.1实验样品

取实施例1制得的馏分，即指实施例1制得的接骨木总提物、接骨木总提物水洗脱部分、30％乙醇洗脱部分、50％乙醇洗脱部分及95％乙醇洗脱部分。

4.2实验方法

UMR 106细胞经胰蛋白酶消化分散后，以5000细胞/孔的密度接种于96孔板，置于37℃、湿度95％、含5％CO₂的培养箱中进行培养。在10％FBS(胎牛血清)-DMEM培养液中培养2天后，用1％Charcoal Stripped FBS(活性炭处理去除激素的胎牛血清)-Phenol red-free DMEM(去除酚红的DMEM)再培养1天。将实施例1中所述的馏分以Phenol red-free DMEM稀释成不同浓度(0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL)加入到96孔板中，每个浓度4个复孔，再培养24或48小时。17β-雌二醇(E2，10nM)为阳性对照组，无样品加入的细胞为正常组。

4.3细胞增殖活性检测

细胞检测：细胞在药物的作用下培养24或48小时后，去除培养液，PBS清洗后，加入MTS/PMS试剂培养3小时，于490nm处测定吸光度值，以吸光度值来评价细胞的增殖情况。实验结果经单因素方差分析，表示为：mean±S.E.M.。

实验结果：见表4。

表4各馏分对UMR 106细胞增殖的影响

注：与正常组比较，^**P＜0.01，^***P＜0.001

结论：与正常组比较，接骨木总提物在1μg/mL时对细胞的增殖有显著性的差异，而水洗脱部分及50％乙醇洗脱部分在0.1μg/mL即较正常组有十分显著的差异，且50％乙醇洗脱部分表现出更强的促进细胞增殖的活性，提示总提物中的活性成分大多被富集到50％乙醇洗脱部分。

4.4细胞ALP活性检测

ALP活性检测：ALP(alkaline phosphatase)，碱性磷酸酶，成骨细胞分化的一种酶，也是参与骨代谢的重要蛋白质，通过分解磷酸酯，增加局部无机磷的浓度，从而促进骨基质的钙化[15]。细胞在药物作用下培养24小时后，去除培养液，PBS清洗两次，3个复孔各加入20μL裂解液，5个复孔加入100μLALP试剂(4-NPP)，96孔板置于培养箱中培养15、30、45分钟，405nm测定ALP吸收值，595nm测定蛋白的吸收值。ALP活性以单位蛋白碱性磷酸酶活性的变化率来表示。实验结果经单因素方差分析，表示为：mean±S.E.M.。

实验结果：见表5。

表5各馏分对UMR 106细胞ALP活性的影响

注：与正常组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001

结论：从实验结果可以看出，与正常组比较，接骨木总提物在0.1μg/mL表现出显著性差异，而30％乙醇洗脱部分及50％乙醇洗脱部分在该浓度可以极其显著的促进细胞的分化，且50％较30％乙醇洗脱部分的活性更强。

综合体外实验结果可以看出，无论对细胞的增殖还是ALP活性，50％乙醇洗脱部分都表现出最强的活性。

实施例5：接骨木总提物及总提物的各洗脱馏分对去卵巢骨质疏松模型小鼠的影响

5.1实验样品及试剂

实施例1制得的各馏分，即指实施例1制得的接骨木总提物、接骨木总提物水洗脱部分、30％乙醇洗脱部分以及50％部分(由50％及95％乙醇洗脱部分合并而成)。17β-雌二醇(Sigma，USA)

5.2实验动物

清洁级C57BL/6J小鼠，雌性，3月龄，购自于香港中文大学实验动物中心。

5.3实验方法

分组及给药：小鼠乙醚麻醉后俯位固定，在背部脊柱处切口，于无菌条件下摘除双侧卵巢作为骨质疏松症模型小鼠，假手术组背部脊柱两侧切口后再缝合作为对照。手术后恢复两周，存活下来健康的小鼠55只，随机分为7组，分别灌胃给予以下药物。小鼠每天给予双蒸水和去除雌激素的鼠粮(AIN93M)。

假手术组(Sham，n＝8)    0.1％乙醇水    10mL/Kg体重/d

病理模型组(OVX，n＝8)    0.1％乙醇水    10mL/Kg体重/d

阳性对照组(OVX+E2，n＝8)    17β-雌二醇    3.2mg/Kg体重/d

受试药组

接骨木总提物(OVX+SWT，n＝7)：1g/Kg体重/d

水洗脱部分(OVX+SWA，n＝8)：570mg/Kg体重/d

30％乙醇洗脱部分(OVX+SWB，n＝8)：128mg/Kg体重/d

50％+95％乙醇洗脱部分(OVX+SWC，n＝8)：189mg/Kg体重/d

5.4对小鼠子宫重量的影响

连续灌胃给药三个月后，小鼠乙醚麻醉，腹主动脉取血后，摘出子宫，迅速称重，计算子宫脏器系数。实验结果经单因素方差分析，表示为：mean±S.E.M.。

实验结果：见表6及附图10。

表6各馏分对小鼠子宫系数的影响

注：与模型组比较，^***P＜0.001

结论：小鼠去卵巢后，病理模型OVX组与假手术Sham组比较，子宫系数显著下降，表明造模成功。与OVX组比较，雌激素组使子宫指数急剧的增加，可以看出雌激素的副作用非常显著。与OVX组比较接骨木各馏分子宫系数与模型组无差异，说明接骨木各馏分无雌激素样副作用。

5.5骨密度及骨容积的测定

小鼠乙醚麻醉，腹主动脉取血后，取出小鼠左侧的股骨和胫骨，剔除肌肉和软骨，用浸润了PBS的纱布包好，采用Micro-CT技术测定股骨远端和胫骨近端的骨密度及形态计量学参数骨容积(BV/TV)。实验结果经T检验分析，表示为：mean±S.E.M.。

实验结果，见表7、图11及图12：

表7各馏分对小鼠股骨及胫骨骨密度及骨容积的影响

注：与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001

结论：Micro-CT扫描结果表明，模型组大鼠股骨及胫骨骨密度与假手术Sham组比较明显降低。与OVX组比较，SWT(接骨木乙醇总提物)、SWA(水洗脱部分)及SWC(50％+95％乙醇洗脱部分)可以显著的促进股骨及胫骨的骨密度，同时可以显著的增加骨容积。其中SWC的作用，接近或强于SWT。

实施例6：接骨木活性部位相关制剂的制备

6.1接骨木活性部位片剂的制备

处方：接骨木活性部位(50％乙醇洗脱部分)，20克；可压性淀粉，20克；50％糖浆，适量；硬脂酸镁，1％。

制备方法：将接骨木50％乙醇洗脱部分在60℃-80℃烘箱中烘干，磨成细粉过80目筛，加50％糖浆制成合适软材，用16目筛网制粒，60℃干燥，整粒(16目)，加入硬脂酸镁混合均匀，压片，即得。

6.2接骨木活性部位胶囊剂的制备

处方：接骨木活性部位(50％乙醇洗脱部分)，45克；淀粉，2克；微晶纤维素，3克；75％乙醇，适量。

制备方法：将接骨木50％乙醇洗脱部分在60℃-80℃烘箱中烘干，粉碎成细粉过80目筛，60℃干燥。按比例加入药粉、微晶纤维素、打糊后的淀粉及75％乙醇适量，制成合适软材，40目筛网制粒，70℃烘干，整粒，60目筛去细粉，灌装胶囊，即得。

6.3接骨木活性部位口服液的制备

处方：接骨木活性部位(50％乙醇洗脱部分)，100克；甜菊晶，10克；苯甲酸，1克；尼泊金乙酯，0.3克；1％甲壳素稀醋酸溶液，适量。

制备方法：取接骨木50％乙醇洗脱部分，溶解于适量60％乙醇中，搅拌均匀，静置于2℃-8℃冷库沉淀48小时，过滤，滤液回收乙醇，至无醇味，加入适量水及处方剂量的甜菊晶、苯甲酸、尼泊金乙酯，搅拌均匀，再加入1％的甲壳素稀醋酸溶液适量，过滤，分装，压盖，100℃流通蒸汽灭菌30分钟，即得。

6.4接骨木复方药酒的制备

药物组成：接骨木活性部位10克，淫羊藿10克，仙茅10克，女贞子8克，熟地8克，当归8克，泽泻8克，茯苓8克，白酒适量(50度以上)。

制备方法：将接骨木50％乙醇洗脱部分在60℃-80℃烘箱中烘干，粉碎成细粉；将药材仙茅、熟地、当归、泽泻、茯苓切成3毫米薄的药片；淫羊藿切成2～3厘米的段；女贞子粉碎。处理后的药材按处方配比装入布袋，置于酒坛内，加入8～12倍白酒，密封，于常温下浸泡15～25天，即得。

6.5接骨木牦牛骨髓骨粉的制备

药物组成：接骨木活性部位(50％乙醇洗脱部分)，牦牛骨粉，香菇，杏仁，薏米，黄豆。

制备方法：将接骨木50％乙醇洗脱部分在60℃-80℃烘箱中烘干，粉碎成细粉过80目筛。香菇、杏仁、薏米、黄豆均干燥后粉碎过80目筛。接骨木50％乙醇洗脱部分、牦牛骨粉、香菇、杏仁、薏米、黄豆按1∶2∶1∶2∶3∶3混合均匀，即得。

实施例7：接骨木活性部位制剂对骨质疏松模型小鼠骨的影响

7.1动物实验方法

动物实验方法，同实施例5。

组别如下：

假手术组            双蒸水                  10mL/Kg体重/d

病理模型组          空白片剂                10mL/Kg体重/d

片剂处方组          接骨木活性部位片剂      300mg/Kg体重/d

胶囊剂处方组        接骨木活性部位胶囊剂    300mg/Kg体重/d

口服液处方组        接骨木活性部位口服液    15ml/Kg体重/d

药酒处方组          接骨木活性部位酒剂      15ml/Kg体重/d

牦牛骨髓骨粉处方组  接骨木牦牛骨髓骨粉      300mg/Kg体重/d

7.2实验样品

片剂：分别取空白片剂及接骨木活性部位片剂，研磨、混悬于双蒸水中，灌胃给药。

胶囊剂：分别取空白胶囊剂及接骨木活性部位胶囊剂，取出内容物，混悬于双蒸水中，灌胃给药。

口服液：取出口服液用双蒸水配成适宜的浓度，灌胃给药。

药酒：按照剂量灌胃给药。

牦牛骨髓骨粉：取出适量的接骨木牦牛骨髓骨粉，沸水调成糊状，灌胃给药。

7.3实验结果

实验结果，见表8。

表8灌胃给予接骨木活性部位各种制剂对小鼠骨密度的影响

注：与模型组比较，^**P＜0.01，^***P＜0.001

7.4结论

实验结果显示，与模型组比较，实施例6制得的接骨木活性部位片剂、胶囊剂及口服液，均能显著改善由于去卵巢所引起的小鼠股骨及胫骨骨量的流失，可以作为治疗骨量流失相关疾病的药物使用。同时结果显示，胶囊剂对骨的保护作用最好，其次是片剂，再次是口服液。接骨木活性部位药酒组与骨髓骨粉组对骨的作用虽然没有统计学意义，却表现出抑制骨量流失的趋势，可以作为预防骨质疏松的保健品应用。

实施例8：接骨木活性部位及其制剂主要活性成分的含量测定

取接骨木活性部位片剂20片，研磨后称取40mg，溶解于2mL 60％甲醇-水后过ODS固相萃取柱，10mL甲醇洗脱，洗脱液蒸干后，溶于2mL甲醇，再过0.45μm滤膜，即得接骨木活性部位片剂的供试品溶液。

分别取接骨木胶囊内容物和牦牛骨髓骨粉各40mg，用与上述相同的方法制得接骨木胶囊剂和牦牛骨髓骨粉的供试品溶液。

分别取接骨木口服液和药酒各4mL，蒸干后，溶解于2mL 60％甲醇-水，用与上述相同的方法制得接骨木口服液与酒剂的供试品溶液。

采用实施例3.1中所述液相条件进行液相分析。参照2005版药典附录中高效液相法项下含量测定中的面积归依化法计算各化合物的含量，含量测定结果如下：

表9接骨木活性部位及其制剂中各活性成分的含量

  化合物  活性部位  (％)  片剂  (％)  胶囊剂  (％)  口服液  (％)  酒剂  (％)  牦牛骨髓骨  粉(％)  含量范围  (％)  1  2.90  3.10  3.74  2.64  1.04  0.54  0.5-5.0  2  3.23  5.43  7.82  3.02  1.38  0.73  0.5-10.0

  化合物  活性部位  (％)  片剂  (％)  胶囊剂  (％)  口服液  (％)  酒剂  (％)  牦牛骨髓骨  粉(％)  含量范围  (％)  3  7.15  8.36  10.21  7.03  2.96  1.42  1.0-15.0  4  7.36  8.71  10.44  7.27  3.05  1.55  1.0-15.0  5  7.56  10.98  11.37  7.45  3.11  1.62  1.0-15.0  6  15.80  17.49  19.05  15.58  7.37  2.37  2.0-20.0  7  13.63  16.28  17.46  13.43  6.53  2.16  2.0-20.0

目前几乎没有市售的疗效好、副作用小且价格相对较低的用于治疗绝经后骨相关性疾病的药物，本发明提供了一种接骨木活性部位提取物，结合体内和体外实验证明了该活性部位对子宫无副作用且对骨有很好的保护作用，同时应用该活性部位制备了多种剂型，为充分的开发、研制绝经后骨保护作用的药物及保健品提供了依据。

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