对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌及其制备方法

摘要

本发明涉及对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌及其制备方法，本发明获得的菌株，现保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2007年5月8日，保藏登记号为CGMCC NO.2036。以16S rRNA序列为基础构建的系统发育树中，BPS28菌株与17株模式链霉菌聚成一支，其中与一株名为S.griseoruber NBRC 12873菌株的同源性达到94％，判断BPS28菌株通过发酵途径产生的次级代谢产物为蒽醌类抗生素，具有抗肿瘤活性。通过链霉菌Streptomyces baichenggensis BPS28菌株的发酵途径获得的对水稻稻瘟病等真菌病害有抑制作用的次级代谢产物，效果稳定而持久，对开发成新型的生物农药品种有大的价值。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌及其制备方法。

背景技术

传统化学农药的长期使用带来了种种弊端，因此许多国家已开始限制化学农药的使用，同时生物农药因具有开发和使用成本低、不杀伤天敌、残留低、病虫害不易产生抗药性等优点，得到了许多国家的广泛重视，并投入了大量的人力物力进行开发和研究。因此，发展无公害的生物农药已是各国研究者追求的目标，而且随着公众对“绿色食品”、“无公害食品”的要求越来越高，生物农药的市场前景也越来越广阔。另外，从农药科学的发展来看，在农药研制和使用上，“回归自然”及农药的“无公害化”，也是自然科学发展的必然趋势。

水稻稻瘟病是目前粮食生产上危害严重的主要病害之一，是由pyricularia grisea引起的水稻病害。虽然目前已经有生物农药应用于防治水稻稻瘟病，但是随着抗药性等问题日益突显，针对水稻稻瘟病的生物农药研发迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于提供具有抗真菌作用，特别是对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌；另一个目的在于提供该链霉菌的制备方法。

实现本发明的技术方案如下：本发明所述的对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌，是从吉林省白城市采集的土样经分离制备获得。其学名为链霉菌Streptomyces sp.BPS28。

本发明所述的对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌的菌株已经在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”保藏，地址为：北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所，邮编：100080，保藏日期为2007年05月08日，保藏登记号为CGMCC NO.2036。

根据聚类分析结果表明链霉菌Streptomyces sp.BPS28与S.griseoruber NBRC 12873的同源性达到94％，初步判断链霉菌Streptomyces sp.BPS28的菌株产生蒽醌类抗生素。

链霉菌Streptomyces sp.BPS28菌株的形态特征：

链霉菌Streptomyces sp.BPS28菌株基内菌丝发育良好，无横隔、不断裂；气生菌丝生长良好，多分枝，可形成孢子链，孢子丝直，孢子短圆柱形、表面光滑(见图1)。

链霉菌Streptomyces sp.BPS28菌株的生理生化特征：

对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌Streptomyces sp.BPS28，该菌株能分解纤维素、能使淀粉水解、能产生硫化氢、能利用酪氨酸产生黑色素、能使牛奶胨化、能使明胶液化、不能产生卵磷脂酶分解卵磷脂；能够利用蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖，不能利用肌醇。细胞壁类型属于I型；全细胞水解液中含有半乳糖，糖型属于V型。G+C摩尔百分含量为67％。

链霉菌Streptomyces baichenggensis BPS28菌株的培养特征如表1所示。

表1链霉菌Streptomyces baichenggensis BPS28菌株的培养特征

培养基 气生菌丝 基内菌丝 可溶性色素 高氏一号琼脂马铃薯琼脂察贝克琼脂 克氏一号琼脂 淀粉铵琼脂葡萄糖天门冬素 灰色棕色浅灰 灰白 灰色深灰 鲜黄棕色灰白 土黄 鲜黄淡黄 淡黄棕色无 无 淡黄无

对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌Streptomycesbaichenggensis BPS28的菌株的16S rDNA序列为：

ataaatcgag ccggtaccgg ggatctctac agattagagt ttgatcctgg ctcaggacga

acgctggcgg cgtgcttaac acatgcaagt cgaacgatga agcccttcgg ggtggattag

tggcgaacgg gtgagtaaca cgtgggcaat ctgccctgca ctctgggaca agccctggaa

acggggtcta ataccggata tcactcttgc aggcatctgt gagggtcgaa agctccggcg

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gacgggtagc cggcctgaga gggcgaccgg ccacactggg actgagacac ggcccagact

cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg aaagcctgat gcagcgacgc

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gacgaagtcg taacaagtag cagtaatcgt c

对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌Streptomycesbaichenggensis BPS28菌株的制备方法、步骤和条件如下：

(1)放线菌的分离、纯化、保存

1.制备土壤菌悬液  从白城市采集的土壤样品，风干土样后、研细称取10克加入到250ml无菌的三角瓶中，再加入90ml无菌水，制成土壤菌悬液(此悬液即为10^-1浓度的土悬液)。吸取1ml此悬液加入到10ml的试管中，再加入9ml无菌水，制成10^-2浓度的悬液。依次同上，制成10^-3、10^-4、10^-5、10^-6浓度的菌悬液。

2.平板接种分别从10^-4、10^-5、10^-6浓度的土壤悬液中吸取0.2ml，分别加入到高氏一号培养基的平板上，用涂布棒涂平板。将涂好的平板放入温箱28℃恒温倒置培养。

3.纯化培养7-10天，用接种环挑取无污染的单菌落接入到高氏一号平板培养基上，再放入温箱28℃恒温倒置培养。

4.保存根据放线菌菌落的形状、大小、颜色、气生菌丝与基内菌丝的生长情况，将不同菌落编号并转入高氏一号斜面培养基中保存。对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌Streptomycesbaichenggensis BPS28菌株是其中编号为28的菌株。

所述的高氏一号培养基的质量配比为：K₂HPO₄ 0.5g，NaCl0.5g KNO₃ 1g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，可溶性淀粉20g，琼脂20g，H₂O 1000ml，pH7.2-7.4，于1×10⁵pa灭菌30min。

(2)对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌Streptomycesbaichenggensis BPS28单菌落的获得

用无菌水洗下链霉菌Streptomyces baichenggensis BPS28高氏一号斜面培养基上的孢子制成孢子悬液，然后用无菌水依次稀释成10^-1、10^-2、……10^-10浓度的孢子悬液，之后从每个浓度的孢子悬液中吸取0.1ml的孢子悬液涂高氏一号平板，将此平板置于温箱28℃恒温倒置培养，即可获得链霉菌Streptomycesbaichenggensis BPS28菌株不同浓度的单菌落。

对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌Streptomycesbaichenggensis BPS28发酵液的制备方法、步骤和条件如下：

(1)对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌Streptomycesbaichenggensis BPS28发酵液的种子培养基的制备

把按照本发明所述的“对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌Streptomyces baichenggensis BPS28单菌落的获得方法”所获得的链霉菌Streptomyces baichenggensis BPS28菌株的单菌落接入到发酵培养基中，培养基装量的体积比为30ml/250ml每个三角瓶，接种后的发酵培养基于摇床上26℃，190r/min培养40小时，即可得到链霉菌Streptomyces baichenggensis BPS28发酵液的种子培养基，此种子培养基用于进一步扩大培养发酵液。

发酵培养基质量配比为：葡萄糖2.0％，可溶性淀粉1.5％，黄豆饼粉2.0％，蛋白胨0.6％，硫酸铵0.3％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.30％，磷酸二氢钾0.05％，碳酸钙0.40％，PH：6.5-6.8；于1×10⁵pa灭菌30min。

(2)对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌Streptomycesbaichenggensis BPS28发酵液的制备

按照体积比为4％的接种量，把种子培养基接种到发酵培养基中进行摇床培养，摇床温度为26℃、转速为190r/min，培养72小时后即可得到对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌Streptomycesbaichenggensis BPS28的发酵液(以下简称为BPS28的发酵原液)，即有抑制真菌作用的放线菌次级代谢产物。

对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌Streptomycesbaichenggensis BPS28发酵液抑菌谱的测定

采用生长速率法用BPS28的发酵原液对18种病原真菌、4种细菌进行抑菌谱测定。18种病原真菌分别为构巢曲霉菌、大豆立枯丝核病菌、大豆灰斑病菌、玉米穗腐病原菌、小麦赤霉病菌、禾谷镰刀商原菌、烟草赤星病菌、辣椒黑斑病原菌、玉米弯孢病菌、茄早疫病菌、黄瓜黑星病菌、大豆霜霉病菌、白菜白斑菌、番茄炭疽病菌、高粱豹纹病菌、番茄叶霉病菌、番茄灰霉病菌和葡萄霜霉病菌，4种细菌分被为金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、分枝杆菌。结果表明，菌株BPS28的发酵原液对实验中所采用的植物病原真菌都有很好的抑菌作用，其中对番茄炭疽、大豆霜霉、构巢曲霉、水稻恶苗的抑菌率达到80％，对番茄叶霉、番茄灰霉、玉米穗腐、小麦赤霉病原菌的抑菌率达到70％，对其他病原菌的抑菌作用为60％左右；对细菌的抑制作用中，对大肠杆菌的抑制作用最好，达到90％，对分枝杆菌的抑制作用较差，仅为50％。

对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌Streptomycesbaichenggensis BPS28发酵液抑制稻瘟病分生孢子萌发实验

把在燕麦培养基(所述的燕麦培养基质量配比为：燕麦片30g，琼脂粉20g，水1000ml，PH：7.0-7.2；于1×10⁵pa灭菌30min后使用)上培养的稻瘟病菌用无菌水洗下，得到稻瘟病孢子悬液，使其最终浓度为1×10⁸cfu/ml。对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌Streptomyces baichenggensis BPS28发酵液抑制稻瘟病分生孢子萌发实验中采用四组对照处理，四组对照处理分别为：BPS28发酵原液、稀释500倍的质量分数为6％的春雷霉素(以下简称为春雷霉素×500)、稀释600倍的金福士-I号(以下简称为金福士-I×600)和水，对这四组对照均采用体积比为1∶5的浓度处理，即将1ml的处理液加入到5ml的上述的稻瘟病孢子悬液中，得到四组体积比1∶5的对照，即春雷霉素×500 1∶5、金福士-I×600 1∶5、发酵原液1∶5和水；同时对BPS28发酵原液设计了体积比为1∶10、1∶20和1∶50三个梯度的浓度处理，即将500μl、250μl和100μl的BPS28发酵原液分别加入到5ml浓度为1×10⁸cfu/ml的上述稻瘟病孢子悬液中，得到三个浓度的处理，即发酵原液1∶10、发酵原液1∶20和发酵原液1∶50。将上述七个处理混匀后，分别倒入培养皿中，将培养皿放入28℃培养箱中培养16小时后，观察记录结果如表2所示。结果表明化学农药金福士-I×600 1∶5对稻瘟病分生孢子萌发的抑制作用最强，抑制率达到91.86％，发酵原液1∶5的抑制效果小于金福士-I×600，抑制率达到69.77％但大于生物农药春雷霉素×500 1∶5的抑制率60.93％；发酵原液1∶5、发酵原液1∶10、发酵原液1∶20和发酵原液1∶50对稻瘟病分生孢子的萌发抑制作用越来越小，也就是说随着稻瘟病分生孢子悬液中发酵原液有效成分的减少，对孢子萌发的抑制作用越来越小。

表2 BPS28发酵液对分生孢子萌发的影响

处理 孢子萌发个数 孢子萌发抑制率 水春雷霉素×500 1∶5金福士-I×6001∶5发酵原液1∶5发酵原液1∶10发酵原液1∶20发酵原液1∶508633.672631.13647 60.9391.8669.7763.8458.1445.35

对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌Streptormycesbaichenggensis BPS28发酵液对水稻稻瘟病防效的盆栽试验

对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌Streptomyces baichenggensisBPS28发酵液对水稻稻瘟病防效的盆栽试验采用的稻瘟病品种为：吉丰十号。本发明的盆栽实验同时对水稻稻瘟病叶瘟和穗瘟防治效果进行治疗和预防两种处理。盆栽实验共计60盆水稻，每盆5颗水稻，治疗试验和预防试验分别30盆。用于治疗试验的水稻先接种稻瘟病的孢子悬液，使水稻感病，24小时后喷处理液；用于预防试验的水稻先喷处理液，24小时后接种稻瘟病的孢子悬液。每种试验的处理组分别为：BPS28发酵原液、稀释五倍的BPS28发酵原液(以下简称为发酵原液五倍稀释液)、稀释500倍的质量分数为2％的春雷霉素(以下简称为春雷霉素×500)、稀释600倍的金福士-I号(以下简称为金福士-I×600)和水。BPS28发酵液对稻瘟病叶瘟和穗瘟的防效试验结果如表3和表4所示，结果表明，无论是叶瘟，还是穗瘟的防效，从横向上看各种处理的保护实验效果总体上大于治疗实验的效果。发酵原液的防治和治疗效果和金福士-I的防治和治疗效果相当，防效都大于50％，而春雷霉素的预防和治疗效果都小于50％，但远远高于发酵原液稀释五倍的预防和治疗效果。从纵向上来看，对叶瘟的防效大于对穗瘟的防效。基于以上我们可以看出菌株BPS28发酵液的保护作用大于治疗作用，对叶瘟的预防和治疗效果都比较好，对穗瘟的预防有很好的作用。

表3B PS28发酵液对稻瘟病叶瘟的防效

处理 防效(％)  治疗 保护  发酵原液发酵原液五倍稀释液2％春雷霉素×500金福士-I×600 45.2415.9238.2547.38 50.6216.8946.6153.09

表4 BPS28发酵液对稻瘟病穗瘟的防效

处理 防效(％)  治疗 保护  发酵原液发酵原液五倍稀释液2％春雷霉素×500金福士-I×600 25.6512.1329.4643.24 47.7526.6332.8347.51

本发明的有益效果：本发明筛选出一株对水稻稻瘟病有拮抗作用的菌株，并对筛选出的这株菌株进行分类地位的研究，确定其为链霉菌Streptomyces baichenggensis BPS28菌株；对链霉菌Streptomycesbaichenggensis BPS28发酵液的抑菌谱进行了研究，确定其对多种病原真菌及细菌都有抑制作用；对链霉菌Streptomyces baichenggensisBPS28发酵液抑制分生孢子萌发实验进行了研究，确定其发酵原液五倍稀释液对分生孢子的抑制率为69.76％；对链霉菌Streptomycesbaichenggensis BPS28发酵液防治水稻稻瘟病的盆栽试验进行了研究，确定其发酵液对水稻稻瘟病有保护和治疗的双重作用，其中保护作用大于治疗作用，且对水稻稻瘟病叶瘟的预防和治疗效果都比较好，对穗瘟的预防有很好的作用。这些数据为今后稻瘟病的生防制剂的开发和应用奠定基础。

附图说明

图1是扫描电镜下对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌

Streptomyces baichenggensis BPS28的菌丝及孢子形态图。

具体实施方式

下面结合实施实例对本发明作进一步的说明

实施例1 从吉林省白城市采集土样，按照下述方法进行分离、培养即可获得链霉菌Streptomyces baichenggensis BPS28菌株，采用摇床液体发酵培养的方法即可获得对水稻稻瘟病等真菌有抑制作用的次级代谢产物。

(1)放线菌的分离、纯化、保存

1.制备土壤菌悬液 从白城市采集的土壤样品，风干土样后、研细称取10克加入到250ml无菌的三角瓶中，加入90ml无菌水，制成土壤菌悬液，此悬液即为10^-1浓度的土悬液；吸取1ml此悬液加入到10ml的试管中，再加入9ml无菌水，制成10^-2浓度的悬液；依次同上，制成10^-3、10^-4、10^-5、10^-6浓度的菌悬液；

2平板接种从10^-4、10^-5、10^-6浓度的土壤悬液中分别吸取0.2ml，分别加入到有高氏一号培养基的平板上，用涂布棒涂平板，将涂好的平板放入温箱28℃恒温倒置培养；

3纯化培养大约7-10天，用接种环挑取无污染的单菌落接入到高氏一号平板培养基上，根据放线菌菌落的形状、大小、颜色、气生菌丝与基内菌丝的生长情况，将不同菌落编号，再放入温箱28℃恒温倒置培养。其中编号为28的菌株即为对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌Streptomyces baichenggensis BPS28菌株；

所用的高氏一号培养基的质量配比为：K₂HPO₄ 0.5g，NaCl 0.5gKNO₃ 1g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，可溶性淀粉20g，琼脂20g，H₂O 1000ml，pH7.2-7.4，于1×10⁵pa灭菌30min；

(2)对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌Streptomycesbaichenggensis BPS28单菌落的获得

用无菌水洗下链霉菌Streptomyces baichenggensis BPS28高氏一号斜面培养基上的孢子制成孢子悬液，然后用无菌水依次稀释成10^-1、10^-2、……10^-10浓度的孢子悬液，之后从每个浓度的孢子悬液中吸取0.1ml的孢子悬液分别涂平板，将此平板置于温箱28℃恒温倒置培养，即可获得链霉菌Streptomyces baichenggensis BPS28菌株不同浓度的单菌落；

(3)对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌Streptomycesbaichenggensis BPS28发酵液的种子培养基的制备

把按上述方法获得的链霉菌Streptomyces baichenggensisBPS28菌株的单菌落接入到发酵培养基中，培养基装量的体积比为30ml/250ml每个三角瓶，接种后的发酵培养基于摇床上26℃，190r/min培养40小时，即可得到链霉菌Streptomyces baichenggensisBPS28发酵液的种子培养基，此种子培养基用于扩大培养发酵液；

发酵培养基质量配比为：葡萄糖2.0％，可溶性淀粉1.5％，黄豆饼粉2.0％，蛋白胨0.6％，硫酸铵0.3％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.30％，磷酸二氢钾0.05％，碳酸钙0.40％，PH：6.5-6.8；于1×10⁵pa灭菌30min；

对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌Streptomycesbaichenggensis BPS28发酵液的制备方法、步骤和条件如下：

(1)对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌Streptomycesbaichenggensis BPS28发酵液的种子培养基的制备

把按照本发明所述的“对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌Streptomyces baichenggensis BPS28单菌落的获得方法”所获得的链霉菌Streptomyces baichenggensis BPS28菌株的单菌落接入到发酵培养基中，培养基装量的体积比为30ml/250ml每个三角瓶，接种后的发酵培养基于摇床上26℃，190r/min培养40小时，即可得到链霉菌Streptomyces baichenggensis BPS28发酵液的种子培养基，此种子培养基用于扩大培养发酵液。

发酵培养基质量配比为：葡萄糖2.0％，可溶性淀粉1.5％，黄豆饼粉2.0％，蛋白胨0.6％，硫酸铵0.3％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.30％，磷酸二氢钾0.05％，碳酸钙0.40％，PH：6.5-6.8；于1×10⁵pa灭菌30min。

(2)对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌Streptomycesbaichenggensis BPS28发酵液的制备

按照体积比为4％的接种量，把种子培养基接种到发酵培养基中摇床培养，摇床温度26℃，转速190r/min，培养72小时，即可得到对水稻稻瘟病有拮抗作用的链霉菌Streptomyces baichenggensis BPS28的发酵液(以下简称为BPS28的发酵原液)。