一种碱性果胶酶基因工程菌培养条件的优化方法

摘要

本发明涉及一种碱性果胶酶基因工程菌培养条件的优化方法，步骤如下：(1)采用单因素实验对碱性果胶酶基因工程菌的发酵培养基组成进行优化，得到初步优化的发酵培养基；(2)响应面方法对目标菌种培养基进行优化，得到目标菌种培养基；(3)采用后优化培养基，对目标菌种进行发酵培养条件优化，得到优化培养条件。本发明摸索到一套最优的发酵培养条件，使工程菌发酵所产生的酶活达到758.7825U/ml，比原始野生型菌株产碱性果胶酶活性提高了50倍，比LB培养基发酵基因工程菌产碱性果胶的酶活力提高了3倍，对提高工业酶的市场竞争力有着非常重要的意义。

说明书

技术领域

本发明属微生物工程领域，尤其是一种碱性果胶酶基因工程菌培养条件的优化方法。

背景技术

果胶酶(pectinase)是一类分解果胶质的酶的总称，是含有多种组分的复合酶。果胶酶广泛分布于高等植物和微生物中，但从植物中提取受到资源、技术水平的诸多限制而一直未能真正实现产业化，因此微生物来源的果胶酶成为研究热点。国内外对酸性果胶酶的研究已经具有一定基础，但是对碱性果胶酶尤其是果胶裂解酶(pectate lyase)的研究报道较少。

碱性果胶酶是指最适作用pH在碱性范围内的果胶酶，是果胶酶研究领域中的新兴内容，主要应用于纺织工业中用作对环境友好的生物催化剂，用柔和的酶生物精练代替传统的碱高温蒸煮技术，实现绿色清洁生产，既可减少碱排放污染，又可降低加热能耗和漂洗用水量，同时提高纺织物的加工和使用性能。因而随着生物技术的不断快速发展，碱性果胶酶在纺织工业中的应用潜力也越来越受到大家的关注。

从1972年Horikoshi，K.发表第一篇关于芽孢杆菌生产碱性果胶酶的论文开始，日本等国开始致力于碱性果胶酶的研究。印度Mukesh Kapoor于2001年报道了Bacillus sp.MG-cp-2碱性聚半乳糖醛酸酶的生产、纯化和酶学性质，确定该菌株发酵活力为47u/mL，培养基优化后活力提升为98u/mL，室温时在pH7.0～12.0范围内稳定，可有效应用于苎麻和菽麻纤维脱胶；德国学者2004年测定了果胶酶菌种Bacillus licheniformis DSM13的基因组序列。美国、荷兰、英国、西班牙等国的学者也分别对碱性果胶酶的菌种资源、发酵、纯化方法、酶学性质、分泌调控及分子生物学等内容进行了报道，研究对象除了上述芽孢杆菌之外，还包括一些植物病原菌，如菊欧文氏菌、洋葱伯克霍尔德菌等。

为了获得高产、优质的碱性果胶酶产品，自1990年以来，国外学者把研究重点从筛选产碱性果胶酶菌种方面逐步转向产酶基因及基因工程菌的研究上，尤其是随着1999年丹麦Novo Nordisk(诺和诺德)碱性果胶酶Bioprep(是一种基因改良的芽孢杆菌经发酵制成的酶制剂，其最适pH值为7.5～9.5，适用温度为55℃左右)和碱性果胶裂解酶ScourzymeL(最佳pH值为7.5～9.5，对温度的选用则根据pH值而定，如pH值在8～8.5时，温度掌握在55℃～60℃)的产品问世，人们将注意力越来越多地转向了酶基因及其克隆技术的研究。西班牙、法国、荷兰、日本学者分别将Bacillus sp.(2000年)、Erwiniachrysanthemi3937、Thermotoga maritima(海栖热袍菌，2003年)、Bacillus subtilis(2002年)四种菌株的碱性果胶酶基因克隆到大肠杆菌中成功进行了表达。

国内对果胶酶的研究始于20世纪60年代，1990年初开始对碱性果胶酶进行研究，大量文献对果胶酶菌种的筛选、传统诱变育种、生产工艺和酶的工业应用等方面做了报道，但关于碱性果胶酶的发酵、酶制剂制备和分子生物学遗传育种方面的研究内容较少。菌种主要是芽孢杆菌，如吉氏芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌No.46、XZ2、B13、LH-16、WSHB04-02以及小芽孢杆菌WSH03-09、RK9等，此外还有嗜盐嗜碱菌Alkalibacterium sp.F26等。2006年我国学者甄东晓等将Clostridium stercorarium(耐热梭状芽孢杆菌)的耐热果胶裂解酶基因pel9A克隆到表达载体pET28α然后转化大肠杆菌进行表达；同年，诸葛斌等利用温控载体构建了碱性果胶酶工程菌。越来越多的研究单位在基因工程菌应用于工业生产的总体趋势下进行了碱性果胶酶分子生物学操作的有效尝试，大多分子生物学操作或以大肠杆菌表达体系为主要内容，或以枯草芽孢杆菌表达体系为研究对象，但大多载体和宿主的选择在以生产为目的时均显示了某种不足，例如温控载体和穿梭质粒的使用会因表达中需要温度、诱导剂等条件而增加生产成本。

我国碱性果胶酶研究总体起步较晚，在国外酶制剂公司80％的工业用酶都是由基因工程菌发酵生产获得，本发明在成功构建一株碱性果胶酶基因工程菌后，力求寻找到产酶量较高的发酵培养方法，以拓宽民族工业酶制剂的竞争和发展空间。

发明内容

本发明的目的在于提供一种收率高、方法简单、经济实用的碱性果胶酶基因工程菌培养条件的优化方法，该方法可有效提高碱性果胶酶基因工程菌的产酶能力以及工业酶的市场竞争力。

本发明采取的技术方案是：

一种碱性果胶酶基因工程菌培养条件的优化方法，步骤如下：

(1)采用单因素实验对碱性果胶酶基因工程菌的发酵培养基组成进行优化，得到初步优化的发酵培养基；

(2)通过响应面方法对优化的发酵培养基再进一步优化，得到目标菌种优化培养基；

(3)采用优化后培养基，对目标菌种进行发酵培养条件优化，得到优化培养条件。

而且，所述单因素实验对碱性果胶酶基因工程菌的发酵培养基组成进行优化的步骤为：

(1)不同碳源及浓度对产酶的影响，确定最佳碳源以及最佳添加量；

(2)不同氮源及浓度对产酶的影响，确定最佳氮源以及最佳添加量；

(3)不同金属离子和无机盐及其浓度对产酶的影响，确定最佳金属离子和无机盐的种类以及最佳添加量。

而且，所述响应面方法对培养基进行优化的步骤为：

(1)根据Plackett-Burman法设计实验步骤及运用minitab软件进行数据分析；

(2)确定因素水平：根据Plackett-Burman实验结果设计的爬坡实验，筛选出对产酶有重要影响的因素；

(3)采用中心组合设计实验优化培养基组成：根据Box-Benhnken的中心组合设计原理和爬坡实验所得结果设计响应面分析实验，对重要因素进行优化，最终确定的发酵培养基组成。

而且，所述目标菌种优化培养基进行发酵培养条件优化的步骤为：在优化培养基条件下，采用单因素实验对碱性果胶酶基因工程菌发酵培养条件进行优化，确定最佳目标菌种的最佳发酵培养条件。

而且，所述发酵培养条件包括：菌种种龄、初始pH、接种量、发酵温度和摇瓶转速。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明以基因工程菌株为培养对象，以单因素实验和响应面方法进行培养基发酵试验，运用计算机软件对实验数据进行分析，对其进行全面优化，并在此基础上进一步对发酵培养条件进行优化，摸索到一套最优的发酵培养条件，使工程菌发酵所产生的酶活达到758.7825U/ml，比原始野生型菌株产碱性果胶酶活性提高了50倍，比LB培养基发酵基因工程菌产碱性果胶酶的活力提高了3倍，对提高工业酶的市场竞争力有着非常重要的意义。

2、本发明以碱性果胶酶基因工程菌WB600/pWB-pelG₂521为例对枯草芽孢杆菌产碱性果胶酶的发酵培养条件进行优化，建立了碱性果胶酶基因工程菌的发酵工艺，得到最佳的发酵条件，该发酵条件适用于工业化的生产和应用，具有很大的理论和应用价值。

附图说明

图1为本发明基因工程菌WB600/pWB-pelG₂521的电镜图；

图2和图3分别为本发明X₃＝0时Y₁＝f(X₁，X₂)的立体分析图和等高线图；

图4和图5分别为本发明X₂＝0时Y₁＝f(X₁，X₃)的立体分析图和等高线图；

图6和图7分别为本发明X₁＝0时Y₁＝f(X₂，X₃)的立体分析图和等高线图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

一、实验说明

1、实验菌种为基因工程菌株WB600/pWB-pelG₂521，该菌株为枯草芽孢杆菌(带有六个蛋白酶缺陷型)，该菌种及构建方法已经申请专利，专利号申请为：200910068617.6，申请日为：2009年4月24日。该生产菌株在琼脂斜面上37℃恒温培养24h，菌体在斜面上已完全长好，从外观上看呈乳白色，在电镜下菌体形状多为短杆状，4℃保藏待用。

2、实验菌株WB600/pWB-pelG₂521斜面培养基：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl1％，pH值为6.8～7.0，琼脂粉1.5％。

3、实验菌株WB600/pWB-pelG₂521种子培养基：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl1％，pH值为6.5～7.0，灭菌条件为121℃，20min。

4、实验原料的预处理

麸皮：取50g麸皮+约500ml水，搅拌煮沸1h，定容至500ml，4000r/min离心5min。取上清得10％的麸皮水提液使用时按100g/L计算。

豆饼粉：市售豆饼粉经40目筛处理，取50g豆饼粉+约450ml水+0.02g中性蛋白酶，45℃水浴处理45min，定容至500mL，4000r/min离心5min，取上清，得到10％的豆饼粉水提液使用时按100g/L计算。

玉米粉：市售玉米粉经40目筛处理，取50g玉米粉+约450mL水+38μLα-中温淀粉酶，65℃水浴处理1h，定容至500mL，4000r/min离心5min，取上清，得到10％的玉米粉水提液，使用时按100g/L计算。

薯干粉：取50g薯干粉+约450mL水+40μLα-中温淀粉酶，65℃水浴处理1h，定容至500mL，4000r/min离心5min，取上清，得到10％的薯干粉水提液使用时按100g/L计算。

5、碱性果胶酶活力的测定

酶活力单位定义：1mL酶液在45℃，pH为9.0条件下，每分钟使聚半乳糖醛酸裂解产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸的酶量。

测定方法如下：

酶液制备：果胶酶菌种经发酵培养结束后，8000转离心5分钟，取上清液。用缓冲液稀释不同倍数，和原液平行测定；酶活测定方法：反应体系中包括粗酶稀释液20μL，0.2％聚半乳糖醛酸的甘氨酸-NaOH(0.2mol/L)缓冲液(pH 9.0，含有0.44mmol/L的CaCl₂)2mL，反应条件为45℃温育15min，用3mL0.03mol/L的磷酸终止反应，在235nm处测定其吸光度值。酶空白：将2mL上述缓冲体系配制的底物保温2min后，依次加入3mL0.03mol/L的磷酸和20μL与实验样相同稀释倍数的灭活的酶液，混匀。其他操作与实验样相同。

式中：4600(L·mol^-1cm^-1)-不饱和聚半乳糖醛酸在235nm处的摩尔吸光系数

      t(min)-酶促反应时间(在酶反应的线性范围内)

      b(cm)-比色杯厚度

经简化：酶活力(U/mL)＝3.6232×稀释倍数×OD₂₃₅

二、一种碱性果胶酶基因工程菌培养条件的优化方法，方法的步骤如下：

1、单因素实验对碱性果胶酶基因工程菌(WB600/pWB-pelG₂521)的发酵培养基组成进行优化。

(1)不同碳源及浓度对产酶的影响

根据所查阅的大量文献及实验室的条件，分别以相同含碳量的葡萄糖、蔗糖、乳糖、糊精、玉米粉、甘薯淀粉、玉米淀粉、薯干粉、麸皮以及玉米浆为碳源进行发酵实验，并与LB培养基进行比较，根据实验结果和原料成本综合考虑，以麸皮作为碳源，且添加量为30g/L时酶活最高。

(2)不同氮源及浓度对产酶的影响

根据所查阅的大量文献及实验室的条件，以麸皮(30g/L)为碳源，分别以蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、玉米粉、(NH₄)₂SO₄、KNO₃、酵母粉、尿素以及棉籽饼粉为氮源进行产酶实验，根据实验结果和成本综合考虑，以豆饼粉作为氮源，且添加量为40g/L时产酶最高。

(3)不同金属离子和无机盐及浓度对产酶的影响

某些金属离子会对细菌的生长及代谢起到一定的影响作用，因此以麸皮(30g/L)为碳源，豆饼粉(40g/L)为氮源分别对Na⁺、Fe²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、K⁺等进行了考察。

通过单因素优化，确定了发酵产酶培养基为：麸皮30g/L、豆饼粉40g/L、NaCl 5g/L、磷酸盐0.05mol/L、FeSO₄ 0.005mol/L。

2、响应面方法(RSM)对优化培养基

(1)Plackett-Burman设计法是部分析因法，试验选用N＝12的设计安排，对麸皮(X₁)、豆饼粉(X₂)、磷酸盐(X₄)、NaCl(X₅)、FeSO₄·7H₂O(X₇)五个因素进行考察，每个因素分别取两个水平，低水平为单因素实验的结果，高水平取低水平的1.25倍，设计添加两个空项X₃、X₆，一个中心点，响应值为酶活(Y)，实验设计及实验结果见表1、2。

表1 Plackett-Burman实验设计及结果

运用minitab软件对表1的实验设计进行回归分析，并进行方差分析检验，可信度＞95％的几个因素为：豆饼粉、磷酸盐和FeSO₄，而其他几个因素的可信度均＜95％。分析结果如下：

表2 PB实验分析结果

Effect Estimates for Y1

  Term  Estimate  Std Err  t  Pr＞|t|  -3.446667  6.530464  -0.52778  0.634196  X1  8.3223333  3.265232  2.548773  0.084033  X2  -30.21867  3.265232  -9.25468  0.002669  X3  -5.742333  3.265232  -1.75863  0.17688  X4  -16.11733  3.265232  -4.93605  0.015945  X5  -19.70833  3.265232  -6.03581  0.009119  X6  -7.505333  3.265232  -2.29856  0.105127

  Term  Estimate  Std Err  t  Pr＞|t|  X7  7.611  3.265232  2.330922  0.102062

Fit Statistics for Y1

  Mean  671.7695  R-square  98.24％  Adj.R-square  93.53％  RMSE  5.655547  CV  0.841888

(2)确定因素水平

由Plackett-Burman实验可知，在碱性果胶酶的发酵过程中，豆饼粉、磷酸盐和NaCl这三个因素对产酶有较重要的影响，且均为负效应，应减小，根据Plackett-Burman实验结果设计的爬坡实验，结果如表3。

表3 爬坡实验设计及结果

(3)采用中心组合设计实验优化培养基组成

根据Box-Benhnken的中心组合设计原理和爬坡实验所得结果3因素各取3水平，设计了3因素3水平共15个试验点的响应面分析实验及结果与分析(如表4、5)。

表4 中心组合设计因素水平的选取

表5中心组合设计及结果

经过回归和方差等分析，结果如下：Effect Estimates for Y1

  Term  Estimate  Std Err  t  Pr＞|t|  X1  -14.10075  4.487011  -3.14257  0.025592  X2  12.016625  4.487011  2.678091  0.04392  X3  -15.86413  4.487011  -3.53557  0.016641  X1*X1  -27.02225  6.604702  -4.09137  0.009434  X1*X2  -2.28025  6.345592  -0.35934  0.734015  X1*X3  -13.28325  6.345592  -2.0933  0.090519  X2*X2  -50.204  6.604702  -7.60125  0.000626  X2*X3  4.9805  6.345592  0.784876  0.468066  X3*X3  -16.3265  6.604702  -2.47195  0.056395

ANOVA for Y1

 Source  DF  SS  MS  F  Pr＞F Model  9  17319.9  1924.433  11.94809  0.006926 (Linear)  3  4759.207  1586.402  9.849384  0.015369 (Quadratic)  3  11734.89  3911.632  24.28587  0.00208 (Cross Product)  3  825.7986  275.2662  1.709026  0.279855 Error  5  805.3308  161.0662 (Lack of fit)  3  740.6978  246.8993  7.640037  0.117936 (Pure Error)  2  64.633  32.3165

Fit Statistics for Y1

  Mean  703.9012  R-square  95.56％  Adj.R-square  87.56％  RMSE  12.69118  CV  1.802978

经过回归和方差等分析结果说明：一次项对Y₁有显著影响，P＝0.277说明交叉乘积项影响不显著。R²＝95.56％，表示可信度很高，失拟项的F值也很小，说明该方程对实验拟和很好，实验误差小。由实验结果得到回归方程：Y₁＝-7519.67+153.0928*X₁+178277.3*X₂+705.4752*X₃-1.688891*X₁*X₁-114.0125*X₁*X₂-6.641625*X₁*X₃-2008160*X₂*X₂+1992.2*X₂*X₃-65.306*X₃*X₃

软件所得出的立体分析图和等高线图，很直观地显示了豆饼粉、磷酸盐和NaCl的添加量对产酶的影响，并表现出Y₁有最优值，经岭脊分析，豆饼粉添加35.3345g/L，磷酸盐添加0.04552mol/L，NaCl添加4.2988g/L时，酶活有最大值，最大值为758.7825U/mL。

最终确定发酵培养基组成为：麸皮30g/L、豆饼粉35.3345g/L，磷酸盐0.04552mol/L，NaCl 4.2988g/L，FeSO₄ 0.005mol/L。

3、发酵培养条件优化方法

采用单因素实验对碱性果胶酶基因工程菌(WB600/pWB-pelG₂521)发酵实验中的种龄、初始pH、接种量、发酵温度和摇瓶转速等发酵条件进行了优化。结果表明种龄为12h，初始pH为7.0，接种量为4％，发酵温度为37℃，摇瓶转速为200r/min时，酶活可达780U/mL。