一种改善与提高烟草品质的烟草加工活性复合酶制剂及制备方法

摘要

一种改善与提高烟草品质的烟草加工活性复合酶制剂及制备方法，涉及烟草复烤前添加的多酶复合制剂。本发明以氧化-还原酶为主处理对烟草品质贡献率较大的前体物色质体和Maillard反应前置的蛋白质降解物。配比为葡萄糖氧化酶12000U/mL，叶绿素酶370U/mL，类胡萝卜素氧化酶230U/mL，烟碱脱氢酶190U/mL，含PMSF抑制剂和EDTA络合剂。原液浓缩制剂中蛋白酶酶活性相当于40℃下中性蛋白酶36000U/mL。用制剂稀释250倍代替第二次烟叶湿润剂，能改善品质、提升品级，稳定商品货架期，深受用户欢迎。

说明书

技术领域

本发明属于烟草复烤前添加的提高烟草品级的多酶复合制剂。

背景技术

烟草属(Nicotiana L.)茄科植物，全世界约有100余种，主要分布于美洲及大洋洲，传入我国大约是17世纪初，是我国主要的财政与税收来源之一，特别是云南省的支柱产业。吸食烟草的嗜好不易戒除，优质烟叶要求吸食安全性高，香气纯正，吃味醇和，余味舒适雅致，且劲头适中。

烟叶的醇化或发酵方式分为自然发酵和人工发酵。我国在20世纪80年代以前，以人工发酵为主，之后，积极开展烟叶自然陈化。本世纪普及打叶复烤技术，为之提供理论基础和依据的研究随之成热点，公认陈化是改善烟叶品质提高其可用性必不可少的重要环节[王晓辉，赵云川，李炎强，王异，胡有持。陈化过程中云南烤烟复烤片烟和某些理化指标的变化。烟草科技，2004，(10)：18～20]。质体色素对烟叶的内外在质量有重要的影响。叶绿素和类胡萝卜素是主要质体色素，它决定了调制后烟叶的色泽，其降解产物与烟叶的香气质和香气量密切相关[赵铭钦，等。烟草质体色素与烟叶品质的关系综述。中国农学通报，2007，23(7)：135～138]。对质体色素及相关因素研究认为：①在烟叶的调制过程中，叶绿素的降解是黄色品质和香气物质形成的基础。叶绿素没有充分降解就烤干烟叶会出现不同程度的青黄烟，影响外观和内在品质。叶绿素含量与评吸劲头得分呈负相关，叶绿素含量过高不利于烟叶品质；②叶绿素在成熟和调制过程中降解形成叶醇，叶醇进一步脱水形成新植二烯和植物呋喃等降解产物。当叶绿素和叶醇充分降解转化为新植二烯和植物呋喃等化合物，烤后烟叶的青杂气和刺激性才会得到有效控制。新植二烯占烟草挥发性香气75％～87％，燃烧时可直接进入烟气，具有减轻刺激性和醇和烟气的作用，与烟气品质密切相关；③新植二烯作为捕集烟气气溶胶内香气物质的载体，具有携带烟叶挥发性香气物质和致香成分进入烟气的能力，是烟叶的重要致香剂。周冀衡等研究认为新植二烯与其他香气物质含量的比值是烟叶形成清香特色的主要因素之一[周冀衡，等。不同烤烟产区烟叶中主要挥发性香气物质的研究。湖南农业大学学报，2004，30(1)：20～23]。另一方面，在烟叶总挥发性香气成分中，类胡萝卜素类降解产物的含量为8％～12％，仅次于叶绿素降解产物，类胡萝卜素含量的增加会相应地提高烟碱、全氯及钾的含量，以及降低钙含量、全氮/烟碱和还原糖/烟碱比值。在统计范围内，烟叶中类胡萝卜含量的增加对于评吸结果是较为有利的。但烟叶的香味与类胡萝卜素的存在成反比，在调制陈化中类胡萝卜素不分解会使烟叶的香味不足。在高等级烟叶中通常类胡萝卜素及其降解产物含量较高。烟叶醇化过程中类胡萝卜素类物质因双键断裂的部位不同可产生很多致香物质，如大马酮、紫罗兰酮、二氢弥猴桃内酯等。提高烟叶质量，类胡萝卜素类降解产物的含量就明显增加，烟叶刺激性较小，香气质较好。

不同烤烟样品质体色素及中性挥发性香气物质分析比较，发现云南、津巴布韦烤烟的质体色素及其降解形成的中性致香物质明显高于其它产区，云南烤烟类胡萝卜素及其降解物质含量较高，烤烟质体色素及其降解物质之间达到一定的协调平衡时，对烤烟的香气风格和香气质、香气量产生重要影响[周冀衡，等。产烟国部分烟区烤烟质体色素及主要挥发性香气物质含量比较。湖南农业大学学报，2005，(2)：128～132]。云南复烤片烟进行自然陈化研究发现，烤烟中多数香味成分的含量随陈化时间的增加呈先升后降趋势，比较突出的有β-大马酮、β-二氢大马酮、香叶基丙酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮(a、b、c、d异构体)以及3-羟基大马酮等[胡有持，等。云南烤烟复烤片烟自然陈化时间与质量关系的研究。中国烟草学报，2004，10(4)：1～7]。云南烤烟B₂F在约3年的陈化过程中，二氢猕猴桃内酯的含量持续增加[李炎强，等。云南烤烟复烤叶片陈化过程香味成分的变化及与感官评价的关系研。中国烟草学报，2004，10(1)：1～8]。在烤烟陈化过程中，β-二氢大马酮、紫罗兰酮等6种成分在醇化12个月时达最高值[朱大恒，等。烤烟自然醇化和人工发酵过程中香气成分变化的研究。中国烟草学报，1999，5(4)：6～11]。

从生物质的角度，任何生物化学进程与代谢都离不开酶的参与。近年来，在烟草发酵与加工过程中，利用酶制剂控制烟叶的内在化学成分，使之向着人们所期望的方向转化，弥补烟叶由于生长不理想或其他原因造成的吸味质不足。但是酶学体系是一个庞杂的体系，针对复烤、发酵、配方等待调制的烟叶，去除废物或者将废物变为增香提质的过程涉及物质千差万别，对应特异性的酶及协同作用的酶甚为繁杂。诸多研究中，高春亮等认为色素和多酚的降解使烟叶外观质量明显改善，这是由于多酚作为一种深棕色色素，能够在多酚氧化酶的作用下降解生成一种铁-蛋白质-绿原酸芸香苷复合物，多酚的降解促使叶色由陈化前的浅黄、正黄色向金黄、深黄及棕黄色转变；色素的降解导致烟叶颜色变浅，色泽均匀一致[陈化期间空气湿度对山东和贵州烟片质量的影响中国烟草科学，2008，29(5)：32～36]。由于酶在烟草调制研究和应用中尚处在探索阶段，孙敬国等论述了烤烟醇化过程中不同的酶在烤烟醇化过程中的变化规律，希望充分利用酶的高效性和专一性等特点，在醇化增香、缩短醇化时间等方面开辟广阔应用前景[孙敬国，等。烤烟醇化过程中酶的作用与变化特征研究进展。湖北农业科学，2008，47(10)：1207～1211]。

相关的专利文献中，“一种促进打叶复烤烟叶自然醇化的生物酶处理方法”[中国发明专利ZL 02116594.7]，利用蛋白酶、果胶酶等生物酶来处理烟草，以降解烟草中的蛋白质和果胶，并配以生化反应促进剂丙酮酸、色氨酸、亮氨酸及金属离子Mn²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、K⁺来激活烟叶自身酶类活性。“一种用于提高烟草吸味质量的烟草生物糖酶”[中国发明专利CN101194753A]由果糖或麦芽糖、蛋白酶、纤维素酶和麦芽糖酶组成的稠状液体的烟草生物糖酶，以及“利用多种生物酶增强和改善烟草浸膏香气的方法”[中国发明专利ZL200510029565.3]，是以添加果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶及β-葡萄糖苷酶，对市售的烟草浸膏进行酶解，以增强和改善烟草浸膏香气。这些研究发明中所涉及的酶仅是水解酶类，而且除后者外，有非烟草本身来源的非酶成份添加物。

发明内容

本发明目的是首次提出以氧化-还原酶类，包括葡萄糖氧化酶、叶绿素酶、脂氧合酶，作用于对烟草品质贡献较大的色质体，并配以常规蛋白酶和对烟草安全性起主要作用的烟碱脱氢酶，从而提供一种提高烟草品质的多酶复合制剂。

上述的脂氧合酶也称类胡萝卜素氧化酶等多种称谓，简记为LOX。

本发明另一个目的是保持现有片烟调制工业化工艺条件，在新鲜烟草烘烤后，在复烤前的加工过程中辅助添加的多酶复合制剂，达到提高烟草品质的效果。

本发明的目的通过以下方式实现：

            (一)作为本发明产品的多酶复合制剂

该制剂以氧化-还原催化反应为主的酶成份组成，酶及酶活力配比为：

叶绿素酶250～450U/mL，

类胡萝卜素氧化酶200～300U/mL，

葡萄糖氧化酶10000～15000U/mL，

烟碱脱氢酶150～250U/mL，

蛋白酶30000～40000U/mL。

该制剂中含有PMSF蛋白酶活性抑制剂和去除金属离子的EDTA络合剂。

所述制剂浓缩原液的酶及最佳酶活力配比为：

叶绿素酶370U/mL，

类胡萝卜素氧化酶230U/mL，

葡萄糖氧化酶12000U/mL，

烟碱脱氢酶190U/mL，

蛋白酶36000U/mL。

所述制剂使用时的稀释液的酶及酶活力范围和最佳酶活力配比为：

叶绿素酶1.0～1.8U/mL，最佳1.48U/mL，

类胡萝卜素氧化酶0.8～1.2U/mL，最佳0.92U/mL，

葡萄糖氧化酶40～60U/mL，最佳48U/mL，

烟碱脱氢酶0.6～1.0U/mL，最佳0.76U/mL，

蛋白酶120～160U/mL。最佳144U/mL。

PMSF是抑制蛋白酶活性表现的常用生化试剂。

EDTA化学名为乙二胺四乙酸二钠，是常用的金属离子络合剂。

        (二)制备本发明复合酶制剂的方法

包括以下步骤：

a.以烟草顶杈叶作为提取叶绿素酶的原料，合并叶绿素酶酶活力相近顶杈叶；

b.用pH8.0缓冲液溶解PMSF蛋白酶抑制剂使其浓度为0.01mol/L，加入顶杈叶，顶杈叶质量与缓冲液体积比为1g∶4mL，打碎匀浆，过滤，收集滤液，静置1h；

c.将叶绿素酶静置液以3500r/min离心20min，取上清液，加入(NH₄)₂SO₄，使硫酸铵终浓度为25％，缓慢搅拌溶解，静置2h后补加(NH₄)₂SO₄使终浓度为80％，静置过夜，再4℃15000r/min离心30min，取上清液，补加浓度(W/V)为10％的(NH₄)₂SO₄过夜，再4℃15000r/min离心30min，收集沉淀、合并；

e.合并的沉淀用初始缓冲液总量的一半充分溶解后，用0.1％EDTA溶液补体积至原缓冲液体积，静置2h，离心，取上清液作为酶原液；

f.提取类胡萝卜素氧化酶，除在去顶杈叶后3～7日内割取烟草植株所保留的3～5片上部叶作为提取类胡萝卜素氧化酶的原料及用pH5.6缓冲液溶解PMSF蛋白酶抑制剂外，其余与步骤b～e相同；

g.混合叶绿素酶和类胡萝卜素氧化酶酶原液，作为复合酶制剂的基础物；

h.测定基础物的酶及酶活力后，依据叶绿素酶250～450U/mL，类胡萝卜素氧化酶200～300U/mL，葡萄糖氧化酶10000～15000U/mL，烟碱脱氢酶150～250U/mL，蛋白酶30000～40000U/mL进行兑配，获得复合酶制剂。

所述步骤h是将所用的蛋白酶预先等体积地加入0.1mol/L浓度的蛋白酶抑制剂溶液，再与其它组份混合。

所述步骤b进一步为在滤渣中加入含有PMSF的缓冲液，滤渣质量与缓冲液比为1g∶5mL，搅拌2h，过滤挤渣，滤液与前次滤液合并，静置1h。

所述步骤h兑配后复合酶制剂的最佳酶活力为：叶绿素酶370U/mL，类胡萝卜素氧化酶230U/mL，葡萄糖氧化酶12000U/mL，烟碱脱氢酶190U/mL和蛋白酶36000U/mL。

所述步骤h是在所得的复合酶制剂中加入蔗糖低聚物，经-8℃冷冻干燥浓缩8～10倍获得浓缩复合酶制剂原液。

所述步骤h中所用的葡萄糖氧化酶、烟碱脱氢酶及蛋白酶粗品进行精制的步骤为：

a.取葡萄糖氧化酶粗品固体或液体加入含有浓度为0.1mol/LPMSF蛋白酶抑制剂的缓冲液溶解或稀释，粗品酶与含有PMSF的pH7.0缓冲液配比为(W/V)1g∶20mL或为(V/V)1mL∶10mL，3500r/min离心20min，取上清液，加入(NH₄)₂SO₄，使硫酸铵终浓度为55％，静置24h，然后4℃15000r/min离心30min，取上清液，补加浓度(W/V)为10％的(NH₄)₂SO₄过夜，再4℃15000r/min离心30min，收集沉淀、合并；

b.测定合并物的葡萄糖氧化酶酶活力，加入浓度0.0001％～0.01％的蔗糖低聚物液调制，使其酶原液酶活力为10000～15000U/mL，最佳为12000U/mL；

c.用步骤a中缓冲液用量的一半充分溶解酶原液后，加0.1％EDTA溶液补体积至原缓冲液体积，静置2h，离心得上清液；

d.精制烟碱脱氢酶：除步骤a中缓冲液pH值为7.0、(NH₄)₂SO₄在上清液中的终浓度为62％、酶原液酶活力为150～250U/mL外，其余与步骤a～c相同；

e.精制蛋白酶：除步骤a中缓冲液pH值为7.5、(NH₄)₂SO₄在上清液中的终浓度为42％、酶原液酶活力为30000～40000U/mL外，其余与步骤a～c相同。

涉及的起始葡萄糖氧化酶、烟碱脱氢酶及蛋白酶粗品，来源于相应的微生物发酵产品。

            (三)本发明各组份酶的酶活力测定方法

                        I叶绿素酶

(1)在10mL无水乙醇中加入1.0g直径D≤1mm的鲜活烟叶片，加盖振荡浸泡60min，取上清液2.5mL与2.5mL蒸馏水混合作为叶绿素底物液；或贮存的干品烟叶粉末2.0g，用30mL 95％乙醇浸提120min，所得过滤深绿色清液2.5mL与2.5mL蒸馏水混合为叶绿素底物液；

(2)在8mL的比色杯中加入1mL待测酶液，加入5.0mL提取制备的叶绿素底物液，混匀后在分光光度计720nm波长下即刻读取起始A＝OD_720nm值，读取A值起准确计时20min时，读取B＝OD_720nm值；

定义每分钟反应体系在720nm波长下变化0.001 OD_720nm值为1个酶活力单位1U；

样品酶活力通过计算式：E(U)＝N(A-B)/20得到，其中N为样品稀释倍数。

所述的测定方法所用叶绿素底物可以是取新鲜的烟叶叶片，在105℃下杀青，再于80℃下烘干，研成粉末密闭贮存；使用时，称取2.0g于小烧杯中，加30mL 95％乙醇浸提120min，浸泡搅拌，待乙醇液呈深绿色，收集过滤液即得叶绿素底物液。

酶活力测定时，将需检样品稀释成适宜酶测定的稀释倍数，所用缓冲液每100mL中补加有0.3g Ca(NO₃)₂、0.3g MgSO₄和0.1g ZnSO₄作为基本的酶稳定与激活剂，以释放酶活性而检测，检测结果计算为产品浓缩液酶活。

上述检测方法中，依据[李合生，等。植物生理生化实验原理和技术。北京：高等教育出版社，2000，p131]制取与预备叶绿素底物。为了在较长时间内检测稳定和保证质量，可事先制取一定数量的叶绿素底物干粉。

                    II LOX(脂氧合酶)酶

在8mL的比色杯中加入1mL待测酶液，加入5.0mL提取制备的脂氧合酶底物液，混匀后在分光光度计，450nm波长下即刻读取起始A＝OD_450nm值，读取A值起准确计时20min时，读取B＝OD_450nm值；

定义每分钟反应体系在450nm波长下变化0.001 OD_450nm值为1个酶活力单位1U；

样品酶活力通过计算式：LOXE(U)＝N(A-B)/20得到，N为样品稀释倍数。

测定中所用脂氧合酶底物液为：

(1)取烟草收购中分级确定的C₁F等级烟叶，去除烟叶中主脉和叶梗物于80℃下烘干，研成粉末密闭贮存于棕色瓶中备用；

(2)在20mL无水乙醇中加入步骤(1)C₁F等级烟叶的粉末1.0g，加盖振荡浸泡60min，取上清液2.5mL与2.5mL蒸馏水混合为底物液。

酶活力测定时，样品稀释后在缓冲液中所补加的酶稳定与激活剂，与叶绿素酶相同。

                    III葡萄糖氧化酶

用3，5-二硝基水杨酸(DNS)显色，OD_540nm分析进行葡萄糖定量测定；

以温度30℃和pH5.6条件下1.0000mg/mL浓度葡萄糖标准底物液中每分钟被氧化减少1μg葡萄糖所需的酶量为1U，酶样品表示为：U/mL或U/g。

所述的测定方法进一步为：将需检样品稀释成适宜酶测定的稀释倍数，所用缓冲液每100mL中补加0.3g Ca(NO₃)₂和0.3g MgSO₄作为基本的酶稳定与激活剂，在检测中增强酶活性，并计算检测结果。

葡萄糖定量测定过程详见[李合生，等。植物生理生化实验原理和技术。北京：高等教育出版社，2000，p197～199；刘士清，等。农业生物环境中基础酶技术研究法修建探讨。农机化研究，2008，(10)：162～166，175]。

                    IV烟碱脱氢酶

(1)将两张质地和大小相同的直径D＝11cm定量滤纸精确称重，滤纸A＝W₁、滤纸B＝W₃；

(2)将1mL纯度为95％的烟碱加入到100mL 0.1mol/L的硅钨酸溶液振荡5min后，再加入1mL经灭菌处理的待测样品酶液，振荡20min，用滤纸A过滤完成，将滤纸A并同附着物一起置于110℃下烘烤6h干燥，准确称量A＝W₂，ΔA＝W₂-W₁；

(3)将1mL纯度为95％的烟碱注入到1mL待测样品酶液中，混匀准确计时振荡60min，到时加入100mL 0.1mol/L的硅钨酸溶液振荡20min后，用滤纸B过滤完成，将滤纸B并同附着物一起置于110℃下烘烤6h干燥，准确称量B＝W₄，ΔB＝W₄-W₃；

烟碱酶活力(U/mL或U/g)＝[(ΔA-ΔB)/162.23]×10⁶/60

式中，烟碱分子式C₁₀H₁₄N₂，分子量162.23，60为反应时间(min)。

烟碱酶活力单位定义为：在上述条件下1min烟碱量减少1μmoL所需的酶量定义为1个酶活力单位。

酶活力测定时，样品稀释后在缓冲液中所补加的酶稳定与激活剂，与叶绿素酶相同。

                        V蛋白酶

蛋白酶测定方法采用工业用液化型淀粉酶，糖化酶淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶质量标准(北京：中华人民共和国轻工部，1980)。测定中性蛋白酶，测定温度为40℃。

测定钝化液和浓缩液中的酶活，需将被测定样品稀释成适宜的稀释倍数，稀释及测定所用的缓冲液中每100mL中需补加有0.3g Ca(NO₃)₂、0.3g MgSO₄和0.4g ZnSO₄作为基本的酶稳定与激活剂，以释放酶活性。

            (四)本发明酶复合制剂的使用方法

将浓缩酶复合制剂稀释250倍作为片烟复烤前的第二次润叶用水，其使用的酶组份及酶活力范围为：

叶绿素酶1.0～1.8U/mL，

类胡萝卜素氧化酶0.8～1.2U/mL，

葡萄糖氧化酶40～60U/mL，

烟碱脱氢酶0.6～1.0U/mL，

蛋白酶120～160U/mL。

使用时，最佳酶活力为：

叶绿素酶1.48U/mL，

类胡萝卜素氧化酶0.92U/mL，

葡萄糖氧化酶48U/mL，

烟碱脱氢酶0.76U/mL，

蛋白酶144U/mL。

本发明初始设计主要针对背景技术中所述的叶绿素和类胡萝卜素以及许多水解性酶类的质体色素之降解，在研制中我们认识到氧化-还原酶的参与能够提高和改善烟草品级，是转化形成烟草品级的重要前体物。如同叶绿素和类胡萝卜素等质体色素降解，残存于烟叶中的多酚氧化酶类也能参与转化形成烟草品级提高和改善的重要前体物。本发明中，葡萄糖氧化酶能够提供H₂O₂并使复合酶制剂中的后续氧化酶起动，促进存在于烟叶中的多酚氧化酶类的活性。但未精制原液保存时间极短，不宜商品化，特别蛋白酶混入24小时后其他酶几乎无酶活力存在，原液状态下各酶几乎无酶活力显示。为此，本发明分别从烟草种植后期的顶杈和上部预留叶中提取叶绿素酶和LOX作为制备复合酶制剂的基础，兑配葡萄糖氧化酶、烟碱脱氢酶和蛋白酶，在各组份中加有蛋白酶抑制剂PMSF或/和EDTA，除去引起酶活力显示的中心离子和影响酶蛋白不稳定存在的金属离子，抑制已知酶活力的蛋白酶活性显示，控制因蛋白酶活性对其他酶所造成的破坏，使原液或浓缩液中的酶以无活性的可逆酶活钝化原蛋白形式稳定存在，从而产品具有较长的贮存期。

本发明显著的进步和积极的效果是：

1、本发明不仅为烟草调制加工提供了新思路，也为酶制剂应用开辟新市场。这是因为本发明率先提出了以氧化-还原酶为主体的烟草复合用酶，用抑制剂抑制蛋白酶对其它酶产生的破坏和干扰，并用络合剂钝化酶活，制备成为复合酶制剂或进一步浓缩的复合酶制剂。

2、制备本发明的酶源十分广泛。或者来源于动物的组织器官以及细胞培养物含有所需酶的材料，或者植物的根、茎、叶、花、果，新鲜的烟草嫩叶和顶杈，或者微生物发酵所得。而本发明除蛋白酶酶源为微生物获取外，其它均直接利用烟草采摘的废弃物进行制备。

3、保持了现有片烟调制片烟复烤工业化工艺。该工艺流程为烟叶解把、第一次润叶、第二次润叶、打叶、复烤、打包。本发明代替片烟复烤时的第二润叶用水，不增加任何工艺步骤，使用极其简易。

4、经过工业化应用证明：本发明不但能改善烟草内在品质、均衡品性、提升品级，而且具有稳定的商品货架期，深受用户欢迎。

附图说明

图1是本发明的产品制备工艺流程示意图。

以下结合附图对本发明做进一步说明。

本发明有关的单一酶制剂和相关的测定方法在本质上也构成了发明的保护内容，并将作为其它专利提出申请。因此，本发明的保护范围包括但不限于下述具体实施方式所列举的内容。

具体实施方式

                (一)制备本发明复合酶制剂

实施例1：

在烟草植株保留3～5个上部叶外，取顶杈叶作为提取叶绿素酶的原料，按田块分别收集存放阴凉3天后抽样检测叶绿素酶酶活力，合并酶活力相近顶杈叶；用pH8.0缓冲液溶解PMSF蛋白酶抑制剂，待浓度为0.01mol/L加入顶杈叶，顶杈叶质量与含有PMSF缓冲液体积的比为1g∶4mL，打碎匀浆，过滤，收集滤液，静置1h；将静置液分别以3500r/min离心20min，取上清液，加入(NH₄)₂SO₄，使硫酸铵终浓度为25％，缓慢搅拌溶解，静置2h，然后补加(NH₄)₂SO₄使终浓度为80％，静置过夜，再4℃15000r/min离心30min，取上清液，补加浓度(W/V)为10％的(NH₄)₂SO₄过夜，再4℃15000r/min离心30min，收集沉淀、合并；合并的沉淀用初始缓冲液总量的一半充分溶解后，用0.1％EDTA溶液补体积至原缓冲液体积，静置2h，离心，取上清液作为酶原液，待与类胡萝卜素氧化酶原液合并。

制备类胡萝卜素氧化酶原液是以去顶杈叶烟草植株所保留的3～5片上部叶作为提取原料，保留上部叶在3～7日内割取；提取中，用pH5.6缓冲液溶解PMSF蛋白酶抑制剂使其浓度为0.01mol/L，其它步骤与叶绿素酶相同。

混合叶绿素酶和类胡萝卜素氧化酶原液，作为复合酶制剂的基础物；测定基础物的酶及酶活力，依据叶绿素酶250～450U/mL，类胡萝卜素氧化酶200～300U/mL，葡萄糖氧化酶10000～15000U/mL，烟碱脱氢酶150～250U/mL，蛋白酶30000～40000U/mL兑配，获得复合酶制剂。

兑配后复合酶制剂的最佳酶活力为：叶绿素酶370U/mL，类胡萝卜素氧化酶230U/mL，葡萄糖氧化酶12000U/mL，烟碱脱氢酶190U/mL和蛋白酶36000U/mL。

实施例2：

混合叶绿素酶和类胡萝卜素氧化酶原液时，将蛋白酶预先等体积地加入0.1mol/L浓度的蛋白酶抑制剂溶液，再与其它组份混合，其它步骤与实施例1相同。

实施例3：

在第一次提取叶绿素酶和类胡萝卜素氧化酶的滤渣中加入含有PMSF的缓冲液，滤渣质量与缓冲液比为1g∶5mL，搅拌2h，过滤挤渣，滤液与前次滤液合并，静置1h，将静置液分别以3500r/min离心20min，取上清液，加入(NH₄)₂SO₄提取叶绿素酶和类胡萝卜素氧化酶。其它步骤与实施例1相同。

实施例4：

在实施例1、2、3所得的复合酶制剂中加入蔗糖低聚物，经-8℃冷冻干燥浓缩8～10倍获得浓缩复合酶制剂，其中，叶绿素酶370U/mL，类胡萝卜素氧化酶230U/mL，葡萄糖氧化酶12000U/mL，烟碱脱氢酶190U/mL，蛋白酶36000U/mL。

实施例5：

复合酶制剂所需的葡萄糖氧化酶、烟碱脱氢酶及蛋白酶粗品可以通过以下步骤获得：

a.取葡萄糖氧化酶粗品固体或液体加入含有浓度为0.1mol/LPMSF蛋白酶抑制剂的缓冲液溶解或稀释，粗品酶与含有PMSF的pH7.0缓冲液配比为(W/V)1g∶20mL或为(V/V)1mL∶10mL，3500r/min离心20min，取上清液，加入(NH₄)₂SO₄，使硫酸铵终浓度为55％，静置24h，然后4℃15000r/min离心30min，取上清液，补加浓度(W/V)为10％的(NH₄)₂SO₄过夜，再4℃15000r/min离心30min，收集沉淀、合并；

b.测定合并物的葡萄糖氧化酶酶活力，加入浓度0.0001％～0.01％的蔗糖低聚物液调制，使其酶原液酶活力为10000～15000U/mL，最佳为12000U/mL；

c.用步骤a中缓冲液用量的一半充分溶解酶原液后，加0.1％EDTA溶液补体积至原缓冲液体积，静置2h，离心得上清液；

d.精制烟碱脱氢酶：除(NH₄)₂SO₄在上清液中的终浓度为62％、酶原液酶活力为150～250U/mL外，其余与步骤a～c相同；

e.精制蛋白酶：除步骤a中缓冲液pH值为7.5、(NH₄)₂SO₄在上清液中的终浓度为42％、酶原液酶活力为30000～40000U/mL外，其余与步骤a～c相同。

            (二)本发明酶制剂的使用和效果

使用效果1：

经稀释及释放各酶的酶活力后，按相应酶的测定方法分别测定各酶的酶活力后，计算出浓缩酶复合制剂中相当于存在的各酶的酶活力。兑配连续制取的5批酶复合制剂产品，结果如下表：

样品  葡萄糖氧化  叶绿素酶  类胡萝卜素氧  烟碱脱氢酶  蛋白酶

编号  酶(U/mL)    (U/mL)    化酶(U/mL)    (U/mL)      (U/mL)

1     12168       382       258            219        31680

2     10298       298       196            187        34260

3     9846        368       210            156        41058

4     15830       420       284            192        38721

5     13630       376       211            176        35834

平均  12354       369       232            186        36311

将表1中样品编号1作为处理1；将样品编号2和5等体积混合作为处理2，葡萄糖氧化酶为11964U/mL、叶绿素酶337U/mL、类胡萝卜素氧化酶204U/mL、烟碱脱氢酶182U/mL和蛋白酶35047U/mL；将样品编号3和4等体积混合作为处理3，葡萄糖氧化酶为12838U/mL、叶绿素酶394U/mL、类胡萝卜素氧化酶247U/mL、烟碱脱氢酶174U/mL和蛋白酶39890U/mL。

处理方式：以云南玉溪红塔区有代表性的云85品种B2F(上橘二)等级为处理对象，在实验室条件下模拟烟叶片烟复烤醇化过程，考察活性添加剂浓缩复合酶制成品对醇化(自然发酵)前期的影响。活性添加剂用自来水代替第二次润叶用水，对照用相同量的自来水作为润叶水。打叶、复烤后，各个包装10kg烟叶，每个处理平行重复不少于3次，在相对湿度65％的室温下自然醇化60天，分别制成烟丝混匀，取样分析和卷成卷烟评吸。各处理烟叶常规分析为：

处理1：总糖量下降17.4％，还原糖下降6.5％，烟碱量下降11.2％，总氮量下降6.1％，烟碱氮下降17.2％，蛋白质下降6.3％，氮碱比(0.99)上升5.3％，糖蛋比(4.05)下降0.2％，糖氮比(9.26)下降0.4％，糖碱比(6.60)下降6.9％。

处理2：总糖量下降9.5％，还原糖下降2.9％，烟碱量下降8.3％，总氮量下降7.4％，烟碱氮下降29.0％，蛋白质下降5.9％，氮碱比(0.96)上升4.3％。糖蛋比(4.61)上升3.2％，糖氮比(10.80)上升4.9％，糖碱比(6.81)下降1.3％。

处理3：总糖量下降7.6％，还原糖下降11.4％，烟碱量下降6.0％，总氮量下降2.6％，烟碱氮下降23.1％，蛋白质下降7.5％，氮碱比(0.96)上升3.2％。糖蛋比(4.29)下降4.1％，糖氮比(9.20)下降9.0％，糖碱比(7.11)下降1.7％。

3个处理下烟碱量都比对照组不同程度地下降，接近较安全和适中劲头的范围0.5～3.5％，氮碱比都在适宜的0.8～1.1范围内。糖蛋比除处理2上升外，处理1缓慢、处理3较快地下降趋近优质烟的施木克值2.0～2.5。然而，糖碱比处理1过快，即偏离比值10较快。卷烟通过吸烟机分析的结果是：

处理1：平均卷烟重每支下降1.9％，燃吸口数上升0.9％，总粒相物下降7.9％，焦油量下降3.7％，烟气碱量下降22.5％，CO下降2.0％，焦油烟碱比(7.69)上升24.3％。

处理2：平均卷烟支重与对照相同，燃吸口数下降5.4％，总粒相物下降8.7％，焦油量下降6.7％，烟气碱量下降20.7％，CO下降1.3％，焦油烟碱比(7.61)上升17.7％。

处理3：平均卷烟重每支下降2.9％，燃吸口数与对照同，总粒相物下降6.5％，焦油量下降4.0％，烟气碱量下降22.4％，CO下降1.3.％，焦油烟碱比(8.00)上升23.7％。

从3个处理平均每支卷烟重较对照下降，烟丝疏松度有改善。烟气碱量下降最快；相反，焦油烟碱比上升幅度很大，但衡量安全性指标，可减少吸烟危害，又能刺激兴奋吸烟者，认为焦油烟碱比在10～15为宜的指标还不符合，反而符合美国的焦油烟碱比6～10要求。

以卷烟作为吸食消费品评吸的结果为：

处理1评得分：香韵上升0.4％，香气量上升2.5％，香气质下降1.1％，浓度上升2.7％，刺激下降3.0％，劲头下降3.8％，杂气上升2.3％，干净度上升1.0％，湿润度上升8.0％，回味下降5.0％，累加合计总得分(78.3分)上升0.2％。

处理2：评得分：香韵上升1.4％，香气量上升0.8％，香气质上升2.5％，浓度上升1.3％，刺激上升1.6％，劲头下降2.2％，杂气上升2.7％，干净度下降3.9％，湿润度上升8.3％，回味上升12.1％，累加合计总得分(79.5分)上升1.7％。

处理3：评得分：香韵上升1.3％，香气质上升3.4％，浓度无变化，刺激下降0.8％，香气量、劲头、杂气和湿润度相对于对照的得分无变化，干净度下降2.6％，，回味下降2.7％，累加合计总得分(79.0分)上升0.1％。

3个处理相对于对照的得分，在香韵、香气量、浓度和湿润度可认为均呈上升，其他则升降变化很大。

综上，本发明在前期60天能加速烟草物质降解，有利于改善烟叶品质。从动态变化还存在不稳定的状态，揭示各批次制品引起的少数指标变化差异较大，因此。将多批次制剂混合配制能够稳定烟草发酵品质和保障产品质量；另一方面，应用本发明产品并不产生立竿见影的效果，而是在醇化的中前期蓄积充分的前体物，为后期烟草发酵奠定物质基础。

使用效果2：红河烟草(集团)有限责任公司应用

经过两年试验和应用，2007年评价结果为：①酶制剂处理烟叶普遍能改善烟叶质量，主要是提升香气质，降低杂气，余味更加舒适，香气更为严重浓馥、优雅，劲头有所降低，烟气趋向柔和；②烟叶缺陷越明显，酶制剂处理效果越明显；③本试验酶制剂活性为6个月，在6个月处理期限内，随时间的增加，处理效果越明显。

使用效果3：川渝中烟工业公司应用

为提高四川烟草品质，川渝中烟工业公司采用云南万芳生物技术有限公司酶制剂产品试验应用。2008年总结评价结果：①应用烟草发酵酶制剂，改善了烟草的吸食品质。处理的烟叶陈香明显，香气质和香气量有较大的改善。生杂气明显减少，刺激性和劲头降低；②使用烟草发酵酶制剂能够使烟草化学成份协调、可用性提高。四川凉山地区烟叶总糖和烟碱偏高、化学成份不协调，在卷烟配方中应用难度大。2003年将试验扩大到工业生产应用，2004年处理凉山、宜宾烟叶十多万担，在会理复烤厂取样送云南烟草质量监督检测站分析，酶处理样总糖下降7.6％，烟碱下降11.6％，烟叶糖碱比趋向协调，2005年发酵酶制剂的应用加大应用于烟叶发酵的规模；③多年试验和应用结果表明酶制剂能够缩短烟叶发酵周期、提高效益。经100天左右的发酵后，即可进行工业配方在卷烟生产中使用，与传统相比节约了大量仓储费用和减少贷款利息支付。

使用效果4：玉溪红塔(烟草)集团公司技术中心

产品型号A110烟草发酵酶制剂为淡绿色液体，在充分搅拌下溶于水，用于复烤前回湿烤烟处理。A110在避光、24℃下密封保存，保存期1年。在不改变烟厂的原自然发酵条件下，该产品添加用于替代烟叶复烤前的第二次润叶用水，夏季烟叶发酵成熟需100～150天，冬季需150～200天。该酶制剂适应玉溪地区K326，云85等主导品种烟叶发酵。应用处理60万担，除了缩短发酵周期，烟叶品质提高带来仓储费、银行贷款利息下降、烟叶资源利用率上升、在工业化应用中创造了良好效益之外，更主要的是通过加酶发酵技术研究进一步揭示了烟叶发酵机理、促进了发酵工艺技术水平的改善及卷烟品质提高而具有重要意义。