一种白桂木提取物及其制备方法和用途

摘要

本发明属于医药和食品技术领域，涉及一种白桂木提取物及其制备方法和用途。本发明的白桂木提取物中，异戊烯基取代的黄酮类化合物的含量为20～40重量％。以白桂木的茎枝为原料，用溶剂提取制备得到总提取物；将总提取物溶于水后，依次以卤代烃类溶剂和酯类溶剂萃取；取酯类溶剂萃取相，回收溶剂后干燥，即得到本发明的白桂木提取物。经体外酪氨酸酶、B16黑色素瘤细胞、清除DPPH等活性测试，结果显示，本发明白桂木提取物具有强的抑制酪氨酸酶、黑色素生成和清除自由基作用，可作为黑色素生成抑制剂或美白剂或天然抗氧化剂应用于医药、日用化工和食品领域。

说明书

技术领域

本发明属于医药和食品技术领域，涉及一种白桂木提取物及其制备方法和用途。具体地，涉及一种白桂木的乙酸乙酯提取物及其制备方法和它作为黑色素生成抑制剂或天然抗氧化剂的用途。

背景技术

随着审美标准的提高，人们对拥有美白细致的肌肤的要求日益增加。近些年，皮肤美白及抗衰老类化妆品市场的开发日趋受到重视，美白同时抗衰老化妆品已成为护肤类化妆品的主流品种之一，其消费市场在不断扩大。

人类皮肤的颜色取决于黑色素的含量和分布。皮肤色素沉着是由于黑色素细胞内黑色素产生过多导致的，而酪氨酸酶是黑色素生物合成过程中必不可少的关键酶。酪氨酸酶催化酪氨酸氧化成多巴并且多巴再进一步氧化成黑色素的前体物多巴醌。因此酪氨酸酶抑制剂可以治疗目前常见的色素沉着皮肤病如雀斑、黄褐斑和老年斑等。虽然目前已有多种酪氨酸酶抑制剂用于美白，但依然存在问题，不能满足消费市场的需要。曲酸由于不稳定，美白效果较弱；氢醌化合物具有强烈的酪氨酸酶抑制作用，但由于其可以诱导皮肤病以及细胞毒性，许多国家已经禁止使用；熊果苷较安全，但作用微弱。因此，从天然植物中寻找安全、有效的美白成分已成为化妆品行业研究的趋向。

紫外线照射、电脑辐射、空气污染等均会使皮肤产生大量的自由基，自由基极不稳定，它使皮肤细胞的细胞膜发生脂质过氧化反应，破坏皮肤的胶原蛋白及弹性纤维，并刺激黑色素细胞，增加黑色素的分泌，从而导致皮肤干燥松弛，失去弹性，产生皱纹，皮肤变黄变黑，产生色素沉积和雀斑，从而加速皮肤衰老，并可以诱发皮肤癌变等。因此，美白并能抗自由基的“全美白概念型美白剂”具有良好的应用前景。目前市场上这样的产品如Vc曲酸酯和曲酸亚麻酸酯均拥有了良好的消费市场。具有这样多重功效的天然产物更是具有潜在的应用价值。

另外，随着生活水平的不断提高，人们对健康绿色食品也有了更新更高的要求。高效、安全、无毒、纯天然的食品添加剂越来越受到人们的青睐，因此开发高效天然的抗氧化剂以取代现有化学合成的抗氧化剂已成为今天国际食品界的主旋律。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供一种白桂木提取物。

本发明的另一个目的是提供上述白桂木提取物的制备方法。

本发明的又一目的是提供上述白桂木提取物的用途。

本发明的还一目的是提供一种组合物，其含有上述的白桂木提取物。

根据本发明的第一个目的，本发明提供了一种白桂木提取物，该提取物中，异戊烯基取代的黄酮类化合物的含量为20～40重量％，优选为28～40重量％；其中，所述异戊烯基取代的黄酮类化合物为artopetelin B、artonin A、artocarpin和brosimone I。

本发明白桂木提取物中异戊烯基取代的黄酮类化合物的含量采用以下方法进行测定：

采用高效液相色谱法(HPLC-UV)测定本发明白桂木提取物中异戊烯基取代的黄酮类化合物的含量。色谱条件为：色谱柱为C18分析柱，流动相为40-90％(v/v)甲醇-磷酸水溶液或40-90％(v/v)乙腈-磷酸水溶液，检测波长为300nm，检测时间为60分钟，用外标法测定保留时间为10.0～50.0min范围内的异戊烯基取代的黄酮类化合物的含量，计算含量为20～40重量％，优选为28～40重量％。其中，所述的异戊烯基取代的黄酮类化合物为artopetelin B、artonin A、artocarpin和brosimone I。

所述异戊烯基取代的黄酮类化合物artopetelin B、artonin A、artocarpin和brosimone I的结构式如下：

根据本发明的第二个目的，本发明提供了上述白桂木提取物的制备方法。该制备方法为：

将白桂木(Artocarpus hypargyreus Hance)的茎枝粉碎后，用溶剂提取制备得到总提取物；将总提取物溶于水后，依次以卤代烃类溶剂和酯类溶剂萃取；取酯类溶剂萃取相，回收溶剂后干燥，即得到本发明的白桂木提取物。

所述溶剂为醇、水或其混合物。

所述醇为乙醇或甲醇等。

优选地，所述溶剂为95％(v/v)含水乙醇。

所述卤代烃类溶剂可以为氯仿或二氯甲烷；优选为氯仿。

所述酯类溶剂优选为乙酸乙酯。

所述提取使用的提取方法优选为浸泡或渗漉。

根据本发明的第三个目的，本发明提供上述白桂木提取物的用途，即本发明的白桂木提取物在制备酪氨酸酶抑制剂中的用途和在制备自由基清除剂中的用途。

由此，本发明的白桂木提取物可以用于化妆品、药品、食品和保健品领域。

具体地，本发明的白桂木提取物在制备黑色素生成抑制剂中的用途和在制备抗氧化剂中的用途。从而可以预防皮肤衰老、保护皮肤或美白皮肤，治疗包括变色、雀斑、斑点等的皮肤色素沉着。可以作为预防食物因被氧化而变色或防止产品氧化的天然抗氧化剂，用于食品和保健品的保鲜；具体可以作为动植物油脂、焙烤食品、水产品、肉制品、调味剂及饮料、医药、化妆品和保健食品的抗氧化剂，以及预防食物包括水果、蔬菜和鱼变色。

根据本发明的第四个目的，本发明提供了一种组合物，其含有上述的白桂木提取物。

在上述组合物中，本发明的白桂木提取物作为酪氨酸酶抑制剂和自由基清除剂可以单独使用，也可以与其它化合物混合使用，并可以进一步含有化妆品/药学上所允许的辅料或常规的载体，以制备成用作抑制黑色素生成或清除自由基的延缓衰老的化妆品或药物。

所述的组合物可以制成片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂。

附图说明

图1为本发明白桂木提取物随时间对B16细胞来源酪氨酸酶的抑制率的曲线。

图2为本发明白桂木提取物随时间对B16细胞来源酪氨酸酶的抑制率的柱状图。

图3为本发明白桂木提取物对B16细胞黑色素生成量的影响的柱状图。

图4为本发明白桂木提取物的浓度对B16细胞活力的影响的曲线图。

图5为本发明白桂木提取物的浓度对自由基清除率的影响的柱状图。

具体实施方式

下面结合具体实施实例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。

制备实施例

实施例1

白桂木干燥茎枝20公斤粉粹后，用95％(v/v)含水乙醇100升浸泡12小时后渗漉，收集渗漉液400升，浓缩干燥，得到浸膏1.8公斤。将此浸膏溶于蒸馏水后分别依次用氯仿、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯溶剂萃取相，回收乙酸乙酯溶剂浓缩至干，即得本发明白桂木提取物500克。经高效液相色谱测定，色谱条件为：色谱柱为HyperClone BDS C18(4.6mm×250mm，5μm)柱，流动相为70％(v/v)甲醇-0.2％磷酸水溶液，检测波长为300nm，该提取物中异戊烯基取代的黄酮类化合物artopetelin B、artonin A、artocarpin和brosimone I含量之和为40重量％。

实施例2

白桂木干燥茎枝20公斤粉粹后，用70％(v/v)含水乙醇100升浸泡12小时后渗漉，收集渗漉液400升，浓缩干燥，得到浸膏1.5公斤。将此浸膏溶于蒸馏水后分别依次用氯仿、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯溶剂萃取相，回收乙酸乙酯溶剂浓缩至干，即得本发明白桂木提取物450克。经高效液相色谱测定，色谱条件为：色谱柱为HyperClone BDS C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)柱，流动相为70％(v/v)甲醇-0.2％磷酸水溶液，检测波长为300nm，该提取物中异戊烯基取代的黄酮类化合物artopetelin B、artonin A、artocarpin和brosimone I的含量之和为34重量％。

实施例3

白桂木干燥茎枝20公斤粉粹后，依次用100升、80升、60升的80％(v/v)含水甲醇室温浸泡三次，第一次24小时，第二次和第三次分别12小时，合并提取液，浓缩干燥，得到浸膏1.2公斤。将此浸膏溶于蒸馏水后分别依次用氯仿、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯溶剂萃取相，回收乙酸乙酯溶剂浓缩至干，即得本发明白桂木提取物420克。经高效液相色谱测定，色谱条件为：色谱柱为HyperClone BDS C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)柱，流动相为65％(v/v)乙腈-0.2％磷酸水溶液，检测波长为300nm，该提取物中异戊烯基取代的黄酮类化合物artopetelin B、artonin A、artocarpin和brosimone I的含量之和为28重量％。

测试实施例(即药理实施例)

为了证实本发明白桂木提取物的用途，对本发明白桂木提取物进行了蘑菇及B16细胞来源的酪氨酸酶的抑制作用、B16黑色素瘤细胞的测试、抗自由基氧化活性测试。结果显示，本发明白桂木提取物具有强的抑制黑色素生成及清除自由基能力。

实施例4蘑菇来源的酪氨酸酶活性测试：

蘑菇来源的酪氨酸酶购自sigma(T3824)。以曲酸作为对照品，首先将底物多巴溶解在磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)中达到4mM。在96孔板中，加入120μL的PBS、20μL的PBS稀释的不同浓度的样品(上述的制备实施例1中制备的白桂木提取物)以及10μL的20μg/mL的酪氨酸酶的稀释液，最后加入50μL的上述4mM底物溶液开始反应，27℃下反应20分钟，每隔2分钟在492nm下测定每孔的吸光度。

根据在492nm下的吸光度计算化合物对酪氨酸酶的抑制率(％)，并将酶活性抑制率(％)达到50％时抑制剂的浓度测定为IC₅₀值。抑制率(％)可以根据下式进行：

抑制率(％)＝[(A-B)-(C-D)]/(A-B)×100

上式中，A表示反应20分钟后空白孔在492nm下的吸光度；B表示反应前空白孔在492nm下的吸光度；C表示反应20分钟后样品孔在492nm下的吸光度；D表示反应前样品孔在492nm下的吸光度。

结果：见表1。

        表1对蘑菇来源酪氨酸酶的抑制活性

                                                

 样品                           IC₅₀(ng/mL)

                                               

 曲酸                           3400±192

 本发明实施例1的白桂木提取物    34.58±4.31

                                                 

结论：从表1可以看出，本发明的白桂木提取物具有很强的抑制蘑菇来源的酪氨酸酶的活性，IC₅₀比曲酸强约100倍。

实施例5B16细胞来源的酪氨酸酶活性测试：

B 16黑色素瘤细胞(简称B 16细胞)是来源于C57BL6小鼠皮肤的自发性肿瘤。B16细胞来源的酪氨酸酶提取方法为：将B16细胞培养基吸掉，用冰冷的PBS洗2次，加入适量含1％Triton X-100的PBS，4℃裂解30分钟。将裂解物4℃12000转离心，取上清即为B16细胞的酶提取液。在96孔板150μL的反应体系中，使用上述的制备实施例1中制备的白桂木提取物，底物多巴终浓度1mM，酶提取液3倍稀释，反应温度为37℃。每隔5分钟测492nm吸光度，共80分钟，计算反应5分钟、20分钟、40分钟、80分钟时的酶的抑制率。另外12小时过夜后再检测一次，计算反应30分钟和12小时时酶的抑制率，计算方法同“实施例4”。

结果：见表2、图1和图2。图1和图2分别为样品随时间对B16细胞来源酪氨酸酶的抑制率的曲线和柱状图。

           表2对B16细胞来源酪氨酸酶的抑制活性

                                          

样品                        IC₅₀(μg/mL)

                                          

曲酸                        6.48±0.389

本发明实施例1的白桂木提取物 11.46±1.127

                                          

结论：从表2、图1和图2可以看出，本发明白桂木提取物具有抑制B16细胞来源的酪氨酸酶的活性，且随时间抑制作用逐渐增强，而曲酸随时间抑制作用逐渐减弱(见图1)。12小时后，本发明白桂木提取物仍具有强的抑制作用，而曲酸的抑制作用消失(见图2)。

实施例6对B16细胞黑色素生成的影响测试：

3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)可促进B16细胞的黑色素的生成。将B16细胞接种于48孔板，2×10⁴个/孔，用含10％胎牛血清(FBS)的H-DMEM培养基培养。24小时后换上含100μM IBMX的培养基，同时加入不同浓度的样品(上述的制备实施例1中制备的白桂木提取物)。72小时后，吸取150μL培养液检测后，弃培养基，PBS洗两次，每孔加入150μL的1.5M的NaOH溶液，60℃水浴放置30分钟后，于492nm处检测培养液和细胞内的黑色素总的含量。结果见图3(^*表示与对照组(IBMX组)相比，p＜0.001)。图3为本发明白桂木提取物对B16细胞黑色素生成量的影响的柱状图。

B16细胞接种于96孔板，2×10³个/孔，用DMEM培养基(10％FBS，高糖)培养。24小时后换上含或不含100μM的IBMX的培养基，并加入不同浓度的样品(上述的制备实施例1中制备的白桂木提取物)。48小时后弃培养基，加入100μL的5g/L的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)，4小时后弃去上清液，加入150μL的DMSO，酶标仪上检测吸光度值，测定波长为570nm，参考波长为630nm。结果见图4。图4为本发明白桂木提取物的浓度对B16细胞活力的影响的曲线。

结论：从图3中可以看出，与对照组相比，本发明白桂木提取物可有效地减少B16黑色素瘤细胞产生黑色素的量，且从图4可以看出，在小于10μg/mL的浓度范围内对细胞活力没有明显损伤。

实施例7DPPH法抗氧化能力测试

1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)用无水乙醇配成300μM，将上述的制备实施例1中制备的白桂木提取物用DMSO配成不同浓度溶液，在96孔板中分别加入95μL的DPPH溶液和5μL的DMSO(空白孔)、95μL的无水乙醇和5μL的DMSO(空白对照孔)、95μL的DPPH溶液和5μL的不同浓度样品溶液(样品孔)、95μL的无水乙醇和5μL不同浓度样品溶液(样品对照孔)，避光25℃室温反应20min，517nm检测吸收。

测定DPPH自由基清除率达到50％时的样品浓度，其为IC₅₀值。抑制率(％)可以根据下式进行：

抑制率(％)＝[(A-B)-(C-D)]/(A-B)×100

上式中，A表示空白孔反应20分钟时在517nm下的吸光度；B表示空白对照孔反应20分钟时在517nm下的吸光度；C表示样品孔反应20分钟时在517nm下的吸光度；D表示样品对照孔反应20分钟时在517nm下的吸光度。

结果见图5。图5为本发明白桂木提取物的浓度对自由基清除率的影响的柱状图。

结论：从图5可以看出，本发明白桂木提取物可长时间且有效地清除DPPH自由基。

正如本文前面所述，本发明的白桂木提取物对蘑菇和小鼠B16细胞来源的酪氨酸酶有非常强的抑制作用，在对B16细胞基本没有明显毒性的前提下，可以显著的抑制黑色素的含量。而且，本发明的白桂木提取物可长时间且有效地清除DPPH自由基。因此，本发明的白桂木提取物可用于制备化妆品，具有预防皮肤衰老、保护皮肤或美白皮肤的功能；可用于制备药物，用于治疗包括变色、雀斑、斑点等的皮肤色素沉着；可用于制备天然抗氧化剂，用于食品和保健品的保鲜。