利用基因工程技术获得高抗病毒马铃薯植株的方法

摘要

本发明公开了一种利用基因工程技术获得高抗病毒马铃薯植株的方法，包括Tm-22基因的克隆及其超表达载体的构建、农杆菌的侵染转化、高抗病毒马铃薯植株的检测；本发明根据已知番茄抗病基因Tm-22抗病机理及其对病毒(如TMV、ToMV等)的高抗特性，利用番茄与马铃薯亲缘关系较近特点，采用基因工程技术将Tm-22基因转入马铃薯，并通过筛选、鉴定而获得已表达Tm-22基因的高抗病毒马铃薯植株，提高了马铃薯植株对常见病毒的抗性；本发明通过植物基因转化马铃薯，能够避免环境风险及食用安全风险，有助于把马铃薯抗病研究推向一个新的台阶，为实际应用于农业生产作出了积极探索。

说明书

技术领域

本发明涉及利用基因工程技术获得高抗病毒马铃薯植株的方法。

背景技术

马铃薯是世界上产量仅次于小麦、玉米和水稻的第四大粮食作物，其单位面积单位时间的产量高于前三种作物。马铃薯粮菜兼用，营养丰富，联合国充分肯定了马铃薯在确保世界粮食安全和消除贫困中起的重大作用，并确定2008年为“国际马铃薯年”。但病毒侵染一直是导致马铃薯品种退化的主要因素，严重影响马铃薯的产量和品质。传统的育种方式已经不能满足马铃薯生产的需要，不能从根本上长期解决马铃薯病毒害问题。近年来，随着基因工程的迅速发展和转基因技术体系的日益完善，基因工程技术在提高马铃薯抗病性方面(尤其是抗病毒)显示了极大的潜力，必将成为马铃薯抗病毒育种的主要手段。

由于马铃薯是同源四倍体作物，用常规的方法去改良品种非常缓慢，一般育成一个品种至少需要8～10年，因此病毒病就成为马铃薯生产育种中一个非常棘手的问题。而传统的控制和防治病毒的方法有茎尖脱毒组织培养和农药喷施，其中茎尖脱毒组织培养技术有其成本高、受检测条件制约、脱毒后栽培后易再感染病毒以及品种变异等局限性，而农药喷施又严重污染环境，所以这两种方法都不能有效的解决马铃薯病毒害问题。

Hamilton于20世纪80年代初首先提出了基因工程保护的设想，在转基因植物中表达病毒基因组序列可能是防御病毒侵染的途径之一。于是1988年出现第一例成功抗PVX(马铃薯X病毒)转基因马铃薯，使得以后的20年间马铃薯抗病毒基因工程研究在广度和深度上都进展迅速，为防治马铃薯病毒病开辟了新途径。

尽管在马铃薯抗病毒基因工程中，转基因的技术和方法已经进行了多次的改进和完善，转入的抗病目的基因也在朝多样化发展，国内外实验研究也取得了很多可喜的成绩，但还是存在一些问题亟待解决：

①在各种实验报道中，农杆菌介导转化马铃薯的体系都相对独立，目前对大多数马铃薯品种和不同的外植体还没有一个普遍适合的转化模式，因此还需要研究者通过实验去进一步优化筛选。

②高抗病毒马铃薯植株再生率较低且不稳定，不同的研究报告中使用的转化体系标准以及方法均不相同，这就让其他研究者很难进行对比分析以及评价借鉴。

③目前采取农杆菌介导转化马铃薯的过程中，大多在导入目的基因的同时也导入了抗生素抗性基因，这种选择标记在转化过程中有可能会转移到其他生物如微生物或马铃薯植株体内。

④现今的许多实验研究中导入的异源基因即病毒基因作为转化马铃薯的抗病毒基因，这些来源病毒的基因有的具有一定的潜在危险性，如CP基因的异源包壳现象，转病毒基因的马铃薯植株体内易发生与病毒RNA重组可能会产生新的病毒，病毒基因RNA产生突变等等从而引起生物安全性问题。

目前很少有人用非病毒基因(如植物基因)转化马铃薯。随着分子生物学技术的快速发展，人们已经分离克隆出了一些植物抗病基因，尤其是与马铃薯亲缘关系很近的茄科作物，如已经从番茄染色体上分离并克隆出来已经鉴定具有抗病毒能力的Tm-1、Tm-2以及Tm-2²等基因。因为同源基因来源于作物本身或与之亲源关系近的种，这样可以排除环境风险和食用安全风险。同源转基因的马铃薯更容易被公众接受，将极可能会成为转基因产业的一个突破口。

在未来的马铃薯抗病毒基因工程研究中，转入非病毒来源基因、设计RNA介导的抗病毒路线，并采取复合基因策略，以获得具有广谱病毒抗性并且对环境及食用的安全的高抗病毒马铃薯植株，必将是当前和将来的发展趋势。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种利用基因工程技术获得高抗病毒马铃薯植株的方法，根据已知番茄抗病基因Tm-2²抗病机理及其对病毒(如TMV、ToMV等)的高抗特性，利用番茄与马铃薯亲缘关系较近特点，采用基因工程技术将Tm-2²基因转入马铃薯，并通过筛选、鉴定已表达Tm-2²基因的高抗病毒马铃薯植株，提高马铃薯植株对常见病毒的抗性，同时避免环境风险及食用安全风险。

本发明的利用基因工程技术获得高抗病毒马铃薯植株的方法，包括如下步骤：

(1)制取番茄抗病基因Tm-2²；

根据番茄抗病基因Tm-2²的序列设计两对特异性引物并在上游引物5’端加上限制性内切酶酶切位点，然后提取番茄RNA并分别以两对特异性引物进行RT-PCR扩增，得到Tm-2²基因前段和后段的扩增产物；将所得Tm-2²基因前段和后段的扩增产物克隆入两个pMD18-T载体，再进行酶切，酶切产物经纯化后连接，得全长Tm-2²基因DNA序列；

(2)超表达载体的构建

提取全长Tm-2²片段并克隆到含CaMV35S启动子和终止子的pDH51载体中，得pDH51-Tm-2²质粒，酶切pDH51-Tm-2²质粒并将所得片段克隆到pBIN19载体，得超表达双元载体pBIN19-Tm-2²；

(3)农杆菌的侵染转化

将经过预培养获得的马铃薯外植体置于含有pBIN19-Tm-2²双元载体的LBA4404农杆菌的菌液中浸染并经共培养、诱导生芽及选择性生根培养，得转基因马铃薯植株；

(4)转基因植株的检测

采用PCR、RT-PCR检测方法从所得转基因马铃薯植株中筛选阳性植株，所得阳性植株经活体抗病性接种鉴定获得抗病性高抗病毒马铃薯植株。进一步，步骤(3)所述马铃薯外植体由以下步骤获得：

a.将马铃薯脱毒试管苗单节段接种于培养基上，然后于温度20±2℃、16h/d光周期和1000-2000lx光照强度的条件下培养，所述培养基为MS培养基，培养基中包括的组分及相应组分在培养基中的质量分数分别为：蔗糖3％、琼脂0.6-0.8％，调节pH为5.8；

b.待脱毒试管苗长至6-7个叶片后将生长健壮的马铃薯脱毒试管苗剪成1叶1节的茎段，将所述茎段接种至诱导固体培养基中并于20±2℃的全黑暗条件下诱导培养以获得试管薯；

c.所述试管薯切片，得马铃薯外植体；

进一步，步骤b所述诱导固体培养基为MS培养基，诱导固体培养基中包括的组分及相应组分在诱导固体培养基中的质量分数分别为：蔗糖8-10％，调节pH为5.8；

进一步，所述诱导固体培养基还包括琼脂和6-BA，琼脂在诱导固体培养基中的质量分数为0.6％，6-BA在诱导固体培养基中的质量浓度为2mg/L；

进一步，步骤(3)所述含有pBIN19-Tm-2²双元载体的LBA4404农杆菌的菌液按如下步骤制得：

①将含有pBIN19-Tm-2²双元载体的LBA4404农杆菌接种于YEB固体培养基中并于28±2℃条件下黑暗培养2-3d，得培养物；

②按照0.01∶1的体积比将所得培养物加入到YEB液体培养基中并培养至OD₆₀₀为1.8-2.0后于4000-6000rpm条件下室温离心并用新鲜YEB液体培养基重悬菌体，得菌悬液；

③所得菌悬液于4000-6000rpm室温离心后用MS盐溶液重悬菌体，得含有pBIN19-Tm-2²双元载体的LBA4404农杆菌的菌液。

所述YEB固体培养基包括的组分及相应组分在YEB固体培养基中的浓度分别为：质量分数为1.5％的琼脂、50mg/L的Kan、500mg/L的Sm和50mg/L的Rif，调节pH为7.0；

所述YEB液体培养基包括的组分及相应组分在YEB液体培养基中的浓度分别为：50mg/L的Kan、500mg/L的Sm和50mg/L的Rif，调节pH值为7.0；

所述MS盐溶液的pH为5.8；

进一步，所述含有pBIN19-Tm-2²双元载体的LBA4404农杆菌菌液浸染时间为8-10min，所述共培养是将经过LBA4404农杆菌菌液浸染的马铃薯外植体于芽诱导培养基中在20±2℃下黑暗共培养2-3d，所述芽诱导培养基为MS培养基，芽诱导培养基中包括的组分及相应组分在芽诱导培养基中的浓度分别为：质量分数为3％的蔗糖、质量分数为0.8％的琼脂、1mg/L的IAA、2mg/L的ZT、0.2mg/L的GA和0.5mg/L的BA，调节pH值为5.8；

进一步，所述诱导生芽操作为：将经过共培养的马铃薯外植体转到抗性选择培养基中，并在20-25℃光照16h、18-20℃黑暗8h和1000-2000lx光强的条件下培养直至抗性芽产生并形成新的植株，所述抗性选择培养基为MS培养基，抗性选择培养基中包括的组分及相应组分在选择抗性培养基中的浓度分别为：质量分数为3％的蔗糖、质量分数为0.8％的琼脂、1mg/L的IAA、2mg/L的ZT、0.2mg/L的GA、0.5mg/L的6-BA、500mg/L的CarB和65-80mg/L的Kan，调节pH值为5.8；

所述选择性生根培养操作为：将经诱导生芽后形成的新的植株切段，再将所得茎段置于选择生根培养基中于20-25℃光照16h、18-20℃黑暗8h和1000-2000lx光强的条件下培养并进行生根筛选，所述选择生根培养基为MS培养基，选择生根培养基中包括的组分及相应组分在选择生根培养基中的浓度分别为：质量分数为3％的蔗糖、质量分数为0.8％的琼脂、200mg/L的CarB和50mg/L的Kan，调节pH值为5.8；

进一步，步骤(4)所述PCR和RT-PCR检测方法包括如下步骤：

I根据超表达双元载体pBIN19-Tm-2²的NPT II报告基因序列设计特异性引物(F1、R1)，其序列如下：

F1：5’-CTATGACTGGGCACAACAGACAAT-3’

R1：5’-CAATATCACGGGTAGCCAACG-3’；

II将Tm-2²与非转基因马铃薯基因组进行对比，查找Tm-2²中含有的与非转基因马铃薯基因组同源性较低的片段区域，据此设计引物，其序列如下：

To-F：5′-CGCGCGTGTTATAGAGATTATGGAC-3′

To-R：5′-ATAACCATTTGCCTCGCCCG-3′

III PCR检测

分别提取所得转基因马铃薯植株与非转基因马铃薯植株的基因组DNA，然后以提取的DNA为模板，用所述特异性引物(F1、R1)(To-F、To-R)进行PCR扩增，得到目标带后，分别连接pMD18-T载体并测序，筛选阳性植株；

IV RT-PCR检测

分别提取步骤III所得阳性植株与野生型马铃薯植株的基因组RNA，用所述特异性引物(To-F、To-R)进行RT-PCR扩增，得到目标带后，连接pMD18-T载体并测序，筛选阳性植株；

进一步，步骤(1)所述特异性引物为两对，分别为：(TF2、TR2)和(T22F、T22R)，T22F引物的5’端加上限制性内切酶酶切位点(下划线部位为限制性内切酶酶切位点)，其各自的序列如下：

TF2：5’-GCATGTTAAGGGCAAGAGAA-3’

TR2：5’-GCGACAACTTGAAATTCTTCC-3’

T22F：5’-GGATCCTTGGCCGTGGACTCCATCT-3’

T22R：5’-GTCGACCACTACTACACTCACGTTGC-3’。

本发明中各英文名称的中文解释如下：6-BA为6-苄氨基嘌呤、Kan为卡那霉素、LSm为链霉素、Rif为利福平、IAA为吲哚乙酸、ZT为玉米素、CarB为羧苄青霉素、CaMV 35S为花椰菜花叶病毒35S启动子。

本发明的有益效果是：

本发明的利用基因工程技术获得高抗病毒马铃薯植株的方法具有如下优点：

1、根据已知番茄抗病基因Tm-2²抗病机理及其功能，以及Tm-2²转化茄科植物烟草并对侵害茄科植物的病毒(如TMV、ToMV等)具高抗特性的报道，利用番茄与马铃薯亲缘关系较近特点，采用基因工程技术将Tm-2²基因转入马铃薯，并筛选、鉴定已表达Tm-2²基因的高抗病毒马铃薯植株，分析其对危害马铃薯常见病毒的抗性，得到具有较强病毒抗性的马铃薯植株，同时抗病毒谱广。

2、本发明利用与马铃薯亲缘关系很近的番茄染色体上的Tm-2²基因转化马铃薯，排除了因病毒基因RNA重组或突变等给环境及食用带来的风险，为马铃薯抗病的研究作出积极探索，有助于为外源抗病基因在马铃薯植株上成功表达提供参考。

3、本发明方法提高了获得试管薯的转化效率。

附图说明

图1及图2为Tm-2²基因的克隆流程图；

图3和图4为番茄总RNA经RT-PCR扩增后所得Tm-2²基因前后两段序列扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；

图5为超表达双元载体的构建流程图；

图6为pBIN19-Tm-2²质粒PCR检测结果图；

图7为酶切pBIN19-Tm-2²载体所得产物PCR检测结果图；

图8农杆工程菌浸染马铃薯外植体操作流程图；

图9与图10为鄂马铃薯3号转基因植株与野生型马铃薯植株基因组DNA的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，图9中1为野生型马铃薯株系对照，2为鄂马铃薯3号转基因株系；图10中1-4为鄂马铃薯3号转基因株系，5-6为野生型马铃薯株系对照)；

图11为经PCR检测所得鄂马铃薯3号转基因阳性植株与野生型马铃薯植株的基因组RNA的RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，其中，1-6为鄂马铃薯3号转基因阳性株系，7-12为野生型马铃薯株系对照。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

供试材料：番茄KBV品系幼叶、鄂马铃薯3号脱毒苗(重庆市脱毒种薯育种中心提供)。

质粒：-T Easy Vector(Promega)，pDH51(携带CaMV35S启动子和终止子)，pBIN19等由本实验室保存。

菌株：大肠杆菌JM109由本实验室保存

试剂：TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒、5-Full RACE CoreSet试剂盒、限制性内切酶、Taq酶等购自大连TaKaRa公司；超薄/普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)为TIANGEN公司产品；X-gal和IPTG购自北京赛百胜公司；其余试剂均为进口或国产分析纯试剂。

1、Tm-2²基因的克隆，克隆流程如图1和图2；

1.1引物设计

根据已报道的番茄抗病毒的抗性基因Tm-2²(AF536201)的序列设计两对特异性引物，分别为：(TF2、TR2)和(T22F、T22R)，在T22F引物的5’端加上BamHI酶切位点(下划线部位)，三对特异性引物的序列如下：

①TF2：5’-GCATGTTAAGGGCAAGAGAA-3’

②TR2：5’-GCGACAACTTGAAATTCTTCC-3’

③T22F：5’-GGATCCTTGGCCGTGGACTCCATCT-3’

④T22R：5’-GTCGACCACTACTACACTCACGTTGC-3’

1.2RT-PCR

①以KBV品系番茄幼叶总RNA为模板，根据TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0操作说明进行第一链cDNA的合成；

②以cDNA第一链为模板，分别以特异性引物(T22F、TR2)和(TF2、T22R)进行PCR扩增，PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳鉴定，得大小为1321bp和1502bp的扩增片段，分别如图3和图4。

反应体系如表1：

表1

  ddH₂O  16.5μl  10×PCR Buffer  2.5μl  MgCl₂  2.5μl  dNTP(20μM)  1.0μl  F  0.5μl  R  0.5μl  cDNA模板  1.0μl  Taq DNA polymerase  0.5μl  Total  25.0μl

针对(T22F、TR2)和(TF2、T22R)的PCR扩增循环参数均为：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，共35个循环；72终延伸3min，结束PCR扩增。

③PCR产物的回收和纯化：采用超薄/普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)(TIANGEN公司产品)按说明书操作。

④重组质粒的转化及鉴定，操作如下，将步骤③所得纯化产物与-T Easy Vector连接，用大肠杆菌JM109感受态细胞进行转化实验，蓝白斑筛选阳性克隆，然后用M13引物(英潍捷基(上海)贸易有限公司产品)进行单菌落PCR检测，阳性重组子由英潍捷基(上海)贸易有限公司测序鉴定。

1.3全长Tm-2²基因片段的拼接

测序验证正确的扩增片段分别为1321bp和1502bp，其中1321bp的cDNA序列通过RACE使其5’端加上PstI酶切位点，然后将两个扩增片段连入-T Easy Vector载体，记为pMD18-Tm-2²，用大肠杆菌JM109感受态细胞进行转化实验，蓝白斑筛选阳性克隆。

2、超表达双元载体的构建

2.1具体操作

BamHI酶切pMD18-Tm-2²质粒和含CaMV35S启动子及终止子的空载体pDH51，将所得全长Tm-2²片段导入pDH51中得到过渡质粒载体pDH51-Tm-2²，然后再用EcoRI酶切质粒载体pDH51-Tm-2²(所得片段包含CaMV35S启动子，Tm-2²片段和CaMV35S终止子)并克隆到表达载体pBIN19，获得超表达双元载体pBIN19-Tm-2²，其流程如图5。

2.2结果的验证

EcoRI酶切pBIN19-Tm-2²载体结果出现11000bp左右和3400bp左右的2条电泳带，如图7；用M13通用引物以pBIN19-Tm-2²质粒为模板进行PCR扩增，电泳结果出现3400bp左右的电泳带，如图6，证明结果与理论相符合。

3、农杆菌的侵染转化

本步骤中转接入诱导培养基的马铃薯茎段不经过光照培养直接进行黑暗处理，使短时间内能够诱导出试管薯，因块茎伤口面积最大，所以感染能力强，而且块茎易操作，可以不经过愈伤过程直接诱导成苗，在适宜的培养基上使试管薯获得较高频率的转化再生芽。操作流程如图8，操作步骤如下：

3.1马铃薯外植体制备

①马铃薯脱毒苗的继代增殖

培养基采用MS培养基，培养基中包括的组分及相应组分在培养基中的质量分数分别为：蔗糖3％和琼脂0.6％，培养基灭菌前调整pH为5.8，灭菌后将培养基按20-25ml分装于组培玻璃瓶中；分别将所述两个品种的马铃薯脱毒试管苗单节段接种于培养基上，置于温度20±2℃、16h/d光照条件和1000lx光照强度的光温培养箱中培养，基础苗每四周继代一次，本步骤中，MS培养基中琼脂的质量分数为0.6-0.8％、光照强度可以为1000-2000lx均可。

②试管薯的诱导

待脱毒试管苗长至约6-7个叶片时，将生长健壮、来源一致的马铃薯脱毒试管苗剪成1叶1节的茎段，无菌条件下将每个品种的茎段分别接种至装有25ml诱导固体培养基的培养皿中，每培养皿10-15个茎段，将接种后的培养皿置于20±2℃全黑暗条件下直接诱导结薯，得试管薯，所述诱导固体培养基为MS培养基，诱导固体培养基中包括的组分及相应组分在诱导固体培养基中的浓度分别为：质量分数为10％的蔗糖、质量分数为0.6％的琼脂，调节pH为5.8；本步骤所述的诱导固体培养基中，蔗糖质量分数在8-10％均可，同时还可添加6-BA，6-BA在诱导固体培养基中的浓度2mg/L即可，表2为诱导固体培养基单独添加6-BA和KT后试管薯诱导率差异；

表2分别对培养基中添加激素6-BA和KT后试管薯诱导率的差异

③待所述两个品种生长两周后诱导出的试管薯切成0.5cm左右的薄片，即为所需的马铃薯外植体。

3.2农杆菌介导的试管薯的转化

3.2.1含有pBIN19-Tm-2²双元载体的LBA4404农杆菌菌液的制备

①将含有pBIN19-Tm-2²双元载体的LBA4404农杆菌接种于YEB固体培养基中并于28±2℃条件下黑暗培养2d，得培养物，本步骤所述黑暗培养在2-3d之间均可；

②挑取单菌落在20mlYEB液体培养基培养2d后，按照0.01∶1的体积比将所得培养物加入到YEB液体培养基中过夜扩大培养至OD₆₀₀为1.8-2.0，然后6000rpm条件下室温离心并再次用新鲜YEB液体培养基重悬菌体，得菌悬液，本步骤中，离心转速为4000-6000rpm均可；

③所得菌悬液于4000rpm室温离心后用MS盐溶液重悬菌体，得含有pBIN19-Tm-2²双元载体的LBA4404农杆菌菌液，本步骤中，离心转速为4000-6000rpm均可；

所述YEB固体培养基包括的组分及相应组分在YEB固体培养基中的浓度分别为：质量分数为1.5％的琼脂、50mg/L的Kan、500mg/L的Sm和50mg/L的Rif，调节pH为7.0；

所述YEB液体培养基包括的组分及相应组分在YEB液体培养基中的浓度分别为：50mg/L的Kan、500mg/L的Sm和50mg/L的Rif，调节pH值为7.0；

所述MS盐溶液的pH为5.8。

因农杆菌的浓度首先影响其菌体在植物细胞上的附着，在一定范围内菌液浓度越大附着率越高，转化率越大，但超过了一定范围之后会因为菌的毒害作用或生长过快等，使外植体受到农杆菌过度伤害而导致外植体切口褐化腐烂严重，且不利于共培养后去除农杆菌；较低的菌液浓度致使T-DNA不能有效地整合进植物细胞基因组，大大降低转化效果；本发明所得的农杆菌菌液浓度适宜，能够有效保证含有Tm-2²基因质粒的转化率。

3.2.2马铃薯外植体的浸染

将所得两个个品种的马铃薯外植体浸于含有pBIN19-Tm-2²双元载体的LBA4404农杆菌菌液中10min；对于浸染时间，如果过短，农杆菌不能充分吸附细胞上，影响转化；时间太长，外植体的伤口会褐化且农杆菌污染严重并在后续实验难以控制，本步骤中，浸泡时间在8-10min之间均可充分保障浸染效果。

3.2.3共培养

将浸染后的马铃薯外植体置于芽诱导培养基中并于20±2℃下黑暗共培养2d，所述芽诱导培养基为MS培养基，芽诱导培养基中包括的组分及相应组分在芽诱导培养基中的浓度分别为：质量分数为3％的蔗糖、质量分数为0.8％的琼脂、1mg/L的IAA、2mg/L的ZT、0.2mg/L的GA和0.5mg/L的BA，调节pH值为5.8；共培养是影响转化的重要因素，时间过长会使外植体会因农杆菌污染而死亡，时间过短会导致农杆菌感染和DNA转化不充分，从而降低转化率，同时也会增加假转化体的出现，本发明中共培养的适宜时间为2-3d。

3.2.4诱导生芽

分别将共培养后的马铃薯外植体转到抗性选择培养基中，并在25±2℃光照16h、18±2℃黑暗8h和1000lx光强的条件下培养至抗性芽产生并形成新的植株，所述抗性选择培养基为MS培养基，抗性选择培养基中包括的组分及相应组分在选择抗性培养基中的浓度分别为：质量分数为3％的蔗糖、质量分数为0.8％的琼脂、1mg/L的IAA、2mg/L的ZT、0.2mg/L的GA、0.5mg/L的6-BA、500mg/L的CarB和75mg/L的Kan，调节pH值为5.8；本步骤中，20-25℃光照16h、18-20℃黑暗8h和1000-2000lx光强均为本发明所得马铃薯外植体的适宜培养条件，假阳性植株一般会出现不生长或者生长缓慢现象，仅阳性植株正常生长。

激素是影响再生频率的主要因素之一，不同的激素水平及激素的组合对诱导不同外植体愈伤和出芽的影响不同，由于马铃薯苗对卡那霉素(Kan)很敏感，Kan的浓度低选择压不足，易产生非转基因植株，反之则不利于芽分化，本实施例的抗性选择培养基中Kan的浓度为75mg/L，本发明中Kan在抗性选择培养基中的允许浓度为65-80mg/L之间。

3.2.5选择性生根培养

将经诱导生芽后形成的新植株切段，再将所得茎段置于选择生根培养基中于25±2℃光照16h、18±2℃黑暗8h和2000lx光强的条件下培养并进行生根筛选，得转基因马铃薯植株，所述选择生根培养基为MS培养基，选择生根培养基中包括的组分及相应组分在选择生根培养基中的浓度分别为：质量分数为3％的蔗糖、质量分数为0.8％的琼脂、200mg/L的CarB和50mg/L的Kan，调节pH值为5.8，采用本发明所述选择生根培养基进行选择性生根培养后，其生根率能够达到60％以上。

在农杆菌介导的外源基因转化马铃薯中，除以上因素外，转化效率也较易受马铃薯品种的影响，本实施实验数据表明本发明方法优先适用于鄂马铃薯3号品种的转化，其次还可适用于其它品种的脱毒马铃薯(如川薯27号)的基因转化。

4、所得转基因植株的检测

4.1设计引物

A根据本实施例所得超表达双元载体pBIN19-Tm-2²上NPT II基因序列设计一对特异性引物(F1、R1)，其序列如下：

F1：5’-CTATGACTGGGCACAACAGACAAT-3’

R1：5’-CA ATATCACGGGTAGCCAACG-3’

B进行基因序列对比，依据Tm-2²中含有的与非转基因马铃薯基因组同源性较低的区域，设计引物：

To-F：5′-CGCGCGTGTTATAGAGATTATGGAC-3′

To-R：5′-ATAACCATTTGCCTCGCCCG-3′

4.2PCR检测

取步骤3.2.5所得转基因马铃薯植株并扩繁移栽，分别取不同株系及野生型马铃薯植株的基因组DNA，然后以提取的DNA为模板，用上述设计的特异性引物(F1、R1)和(To-F、To-R)进行PCR扩增检测，筛选得到阳性植株，PCR扩增的反应体系如表1，扩增的循环参数为：

针对(F1、R1)的PCR扩增循环参数为：94℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环；72终延伸10min，结束PCR扩增。

针对(To-F、To-R)的PCR扩增循环参数为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环；72终延伸10min，结束PCR扩增。

图9与图10为鄂马铃薯3号转基因植株与野生型马铃薯植株基因组DNA的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，所得目标条带连接pMD18-T载体，经过测序证明转化结果正确。(图9中1为野生型马铃薯株系对照，2为鄂马铃薯3号转基因株系；图10中1-4为鄂马铃薯3号转基因株系，5-6为野生型马铃薯株系对照)

4.3RT-PCR检测Tm-2²在马铃薯植株中的表达情况

分别提取步骤4.2中筛选得到的鄂马铃薯3号转基因阳性植株与野生型马铃薯植株的基因组RNA，用特异性引物(To-F、To-R)进行RT-PCR扩增检测，进一步筛选阳性植株。针对特异性引物(To-F、To-R)的扩增体系及参数与步骤4.2相同，图11为经PCR检测所得鄂马铃薯3号转基因阳性植株与野生型马铃薯植株的基因组RNA的RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，得到目标带后，分别用连接液连接pMD18-T载体并测序，证明结果正确。(图11中，1-6为鄂马铃薯3号转基因阳性株系，7-12为野生型马铃薯株系对照)

4.4病毒侵染

4.4.1植物材料、毒源

植物材料：所得鄂马铃薯3号转基因植株，野生型马铃薯

毒源：番茄花叶病毒(ToMV)和烟草花叶病毒(TMV)由浙江大学提供；马铃薯X病毒(PVX)和马铃薯Y病毒(PVY)由华中农业大学马铃薯实验室暨湖北省马铃薯工程技术研究中心提供。

4.4.2操作步骤

①接种病毒的制备：番茄花叶病毒(ToMV)烟草花叶病毒(TMV)毒源先接种在心叶烟上，20天后收集发病心叶烟叶片，按照1g病叶加入20ml的磷酸缓冲液(0.01mol/L，pH7.0)后在研钵中匀浆，然后用双层纱布过滤，收集滤液备用，马铃薯X病毒(PVX)和马铃薯Y病毒(PVY)通过试管续代培养；

②接种方法：来回轻轻摩擦叶片，然后用蒸馏水冲洗叶面；

4.4.3实验结果

经过病毒侵染观察，排除外界环境因素影响，得到的转基因株系病毒抗性结果如下表。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110>重庆大学

<120>利用基因工程技术获得高抗病毒马铃薯植株的方法

<160>8

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>TF2

<400>1

gcatgttaag ggcaagagaa        20

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>TR2

<400>2

gcgacaactt gaaattcttc c       21

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>T22F

<400>3

ggatccttgg ccgtggactc catct    25

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>T22R

<400>4

gtcgaccact actacactca cgttgc    26

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>F1

<400>5

ctatgactgg gcacaacaga caat      24

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>R1

<400>6

caatatcacg ggtagccaac g         21

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>To-F

<400>7

cgcgcgtgtt atagagatta tggac     25

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>To-R

<400>8

ataaccattt gcctcgcccg    20