基于核酸外切酶Ⅲ/Ⅰ保护分析检测单核苷酸多态性的荧光生物传感方法

摘要

本发明公开了一种基于核酸外切酶保护分析检测单核苷酸多态性的荧光生物传感方法，它包括小分子修饰的单个脱氧核苷酸等位特异性延伸和延伸后带有小分子的寡核苷酸DNA链引物与结合蛋白的相互作用以及核酸外切酶III/I的保护分析及基于双链指示染料进行末端保护的发夹型寡核苷酸DNA探针引物的荧光定量检测。本发明利用引物等位特异性延伸在特定引物的3’末端结合单个小分子修饰的脱氧核苷酸，在和小分子结合蛋白特异性结合保护该引物不被核酸外切酶III/I降解，通过被保护的寡核苷酸DNA引物与双链嵌合染料的复合物的荧光进行单核苷酸多态性基因分型的检测。该方法操作简便、经济快速、灵敏、特异性强，可望为基因突变相关的遗传病的人群筛查、产前诊断提供一个通用的技术平台。

说明书

技术领域

本发明属于一种检测单核苷酸多态性的生物传感方法，包括小分子修饰的单个脱氧核苷酸等位特异性延伸技术，延伸后带有小分子的寡核苷酸DNA链引物与结合蛋白的相互作用以及核酸外切酶III/I的保护分析和基于双链指示染料进行末端保护的双链结构寡核苷酸DNA链的荧光定量检测。

背景技术

人类的许多遗传疾病如α和β地中海贫血症等都是由于单基因突变产生的。这些遗传疾病是我国最主要的出生缺陷之一，严重影响我国的人口质量，给社会与家庭带来沉重的经济负担，因此，需要建立一种快速、灵敏、特异性的检测技术。传统基因突变检测主要借助于电泳、质谱或基因芯片方法，这些方法需昂贵精密仪器，操作程序复杂，技术外延性差，分析周期长，故不适于进行大规模人群筛查与产前诊断。目前国际上的主要趋势都集中于以DNA修饰酶为基础，利用酶催化反应提高基因突变鉴定方法的忠实性、可靠性与灵敏度，发展操作简便、快速可靠、低成本、高通量的基因突变分析手段。例如，基于DNA聚合酶的等位特异性延伸或外切建立的TaqMan探针分析、单核苷酸延伸分析等，基于DNA连接酶的等位特异性连接建立的寡核苷酸连接分析、连接酶链分析等，基于DNA内切酶结构识别的Invader分析等。但是，这些技术通常需采用特殊的荧光标记探针(如双标记)，分析成本较高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对现有技术存在的不足，提出了一种基于核酸外切酶III/I保护分析检测单核苷酸多态性的荧光生物传感方法，这种方法不需要特殊的荧光标记，可用于单核苷酸多态性的准确、快速检测。

本发明的技术方案是，基于核酸外切酶III/I保护分析检测单核苷酸多态性的荧光生物传感方法包括：

(1)小分子修饰的单个脱氧核苷酸等位特异性延伸和延伸后带有小分子的寡核苷酸DNA链引物与结合蛋白的相互作用以及核酸外切酶III/I的保护分析

(2)基于双链指示染料进行末端保护的双链结构寡核苷酸DNA链的荧光定量检测。

以下对本发明做出进一步说明。

本发明中，延伸了小分子标记的单个脱氧核苷酸的发夹型探针引物与结合蛋白相互作用使其不被核酸外切酶III/I降解以及被保护的引物的检测采用生物素标记的单个脱氧核苷酸的等位特异性延伸以及核酸外切酶III/I保护。

进一步地，所述基于核酸外切酶III/I保护分析检测单核苷酸多态性的荧光生物传感方法采用以下步骤实现：

取发夹型探针引物和小分子标记的四种脱氧核苷酸于PCR管中，在待测目标物和DNA聚合酶存在的情况下进行单个碱基等位特异性聚合延伸反应，再加入小分子结合蛋白与PCR管中，然后加入核酸外切酶III/I反应。

所述末端保护的发夹型探针引物DNA链的定量检测可采用标准的双链荧光嵌入染料指示剂法进行检测。

本发明中，所述基于核酸外切酶III/I保护分析检测单核苷酸多态性由以下几个步骤实现：

小分子标记的单个脱氧核苷酸的等位特异性延伸：碱基延伸反应的总体积为25μL，在四个不同的PCR管中进行，其中每管包括待检测的目标链，5pmol的检测探针50pmol的Biotin-ddNTP四种单脱氧核苷酸的一种，2unit Taq DNA聚合酶，1×DNA聚合酶缓冲溶液，反应在在200μL的PCR管中进行，94℃变性3min，94℃变性30s，62℃退火30s，68℃延伸10s，共20循环，最后停留在4℃。延伸之后的产物在80℃热失活30min，终止延伸反应。

核酸外切酶III/I保护：取1.5μL浓度为1mg/mL的链酶亲和素于上述单碱基延伸反应后的溶液中，37℃恒温反应0.5小时；再加入80U的核酸外切酶I和40U的核酸外切酶III，置于37℃恒温反应0,5小时后，升温到80℃反应10min，进行灭火以终止酶切反应。

注意，以上反应条件为最优条件，所述溶液体积均可成倍变化不改变最优结果。

本发明中，所述基于核酸外切酶III/I保护分析检测单核苷酸多态性的荧光生物传感方法的定量检测可采用标准的双链荧光指示剂法进行，以下是用双链荧光嵌入染料SYBR-GREEN 1指示剂法对基于核酸外切酶III/I保护分析检测单核苷酸多态性的的定量检测步骤：

所述核酸外切酶III/I作用后的反应溶液中，加入5μl SYBR-GREEN 1(一种双链荧光嵌入染料，1∶30000稀释)，用核酸外切酶反应缓冲液稀释到100μl，放入荧光光谱仪，以480nm为激发波长、520nm为发射波长测其荧光信强度。

本发明提出了一种基于核酸外切酶III/I保护分析检测单核苷酸多态性的分析检测方法，该方法无需荧光标记，仅需设计一条发夹型的寡核苷酸探针引物，在目标链存在的情况下延伸一个小分子标记的脱氧核苷酸，即可利用小分子与其结合蛋白相互作用保护该引物不被外切酶III/I降解对单核苷酸多态性进行基因分型；其操作快速简便、灵敏特异，样品用量少、操作简便、成本较低、能快速自动化实现，可望为人群筛查、产前诊断提供一个通用的技术平台。

具体实施方式：

实施例1：基于核酸外切酶III/I保护分析用于β地贫654位点的突变检测

1)生物素标记的单个脱氧核苷酸的等位特异性延伸：碱基延伸反应的总体积为25L，在四个不同的PCR管中进行，其中每个管中包括待检测的目标链，5pmol的发夹型寡核苷酸探针引物，引物序列为GAA TTC CAA GCG CGA AG TTTT CTT CGC GCT TGG AAT TC TTTTTTCAC CAT TCT AAA GAA TAA CAG TGA TAA TTT CTG GGT TAA GG，50pmol的四种Biotin-dNTP(Invitrogen)的一种碱基，2unit Taq DNA聚合酶(NEB)，1×Tap DNA聚合酶标准缓冲溶液(10mM Tris-HCL(pH 8.6)，50mM KCL，1.5mM MgCL₂)，反应在200μL的PCR管中进行，94℃变性3min，94℃变性30s，62℃退火30s，68℃延伸10s，共进行20循环，最后停留在4℃.延伸之后的产物在80℃热失活10min，终止延伸反应.

2)核酸外切酶III/I保护：取3μL浓度为1mg/mL的链酶亲和素于上述单碱基延伸反应后的溶液中，37℃恒温反应0.5小时；再加入80U的核酸外切酶I(NEB)和40U的核酸外切酶III(NEB)，置于37℃恒温反应0,5小时后，升温到80℃反应10min，进行灭火以终止酶切反应。

单核苷酸多态性的检测；加入5μl SYBR-GREEN 1(一种双链荧光嵌入染料，1∶30000稀释)，用核酸外切酶III反应缓冲液(10mM Bis Tris Propane-HCL，10mM MgCL2，1mMDTT(pH 7.0))稀释酶切终产物到100μl，放入荧光光谱仪，以480nm为激发波长、520nm为发射波长测其荧光强度。

按照上述步骤1)、2)对8个四种不同基因型的目标链(人工合成)的标准溶液(浓度从100pM到100nM)进行检测，记录各标准溶液的荧光强度，未知样品的荧光强度和标准的液的荧光强度对照，从而确定未知样品的基因型。

实施例2：基于核酸外切酶III/I保护分析用于K-ras基因第12密码子的突变检测

1)生物素标记的单个脱氧核苷酸的等位特异性延伸：碱基延伸反应的总体积为25L，在四个不同的PCR管中进行，其中每个管中包括待检测的目标链，5pmol的发夹型寡核苷酸探针引物，引物序列为(GAA TTC CAA GCG CGA AG TTTT CTT CGC GCT TGG AAT TCTTTTTTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTG)，50pmol的四种Biotin-dNTP(Invitrogen)的一种碱基，2unit Taq DNA聚合酶(NEB)，1×Tap DNA聚合酶标准缓冲溶液(10mMTris-HCL(pH 8.6)，50mM KCL，1.5mM MgCL₂)，反应在200μL的PCR管中进行，94℃变性3min，94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸10s，共进行20循环，最后停留在4℃。延伸之后的产物在80℃热失活15min，终止延伸反应。

核酸外切酶III/I保护：取3μL浓度为1mg/mL的链酶亲和素于上述单碱基延伸反应后的溶液中，37℃恒温反应0.5小时；再加入80U的核酸外切酶I(NEB)和40U的核酸外切酶III(NEB)，置于37℃恒温反应0，5小时后，升温到80℃反应10min，进行灭火以终止酶切反应。

2)单核苷酸多态性的检测；加入5μl SYBR-GREEN 1(一种双链荧光嵌入染料，1∶30000稀释)，用核酸外切酶III反应缓冲液(10mM Bis Tris Propane-HCL，10mM MgCL2，1mMDTT(pH7.0))稀释酶切终产物到100μl，放入荧光光谱仪，以480nm为激发波长、520nm为发射波长测其荧光强度。

按照上述步骤1)、2)对8个四种不同基因型的目标链(人工合成)的标准溶液(浓度从100pM到100nM)进行检测，记录各标准溶液的荧光强度，未知样品的荧光强度和标准的液的荧光强度对照，从而确定未知样品的基因型。