一种用于肿瘤及淋巴转移肿瘤影像学诊断的叶酸复合物

摘要

本发明属化学制药领域，涉及一种可与影像学核素结合用于肿瘤诊断的叶酸-聚乙二醇类复合物，其中的叶酸复合物叶酸、聚乙二醇、功能性寡聚赖氨酸和多个DTPA以共价键形式连接。经用于动物核磁共振或放射性显像诊断实验结果表明，该类复合物在组织间隙不透过毛细血管而导入淋巴系统，并且在淋巴结动态浓聚和消除，并竞争性与叶酸受体高表达的肿瘤细胞结合，表现出良好的淋巴导向性及肿瘤部位的蓄积性。能有效用于肿瘤和淋巴系统转移性肿瘤的靶向诊断，具有肿瘤和淋巴肿瘤诊断的高靶向性和高分辨率。

说明书

技术领域

本发明属化学制药领域，涉及用于肿瘤影像学诊断的叶酸复合物，具体涉及一种可与影像学核素结合用于肿瘤诊断的叶酸-聚乙二醇类复合物。该类物质可以有效用于肿瘤和淋巴系统转移性肿瘤的靶向诊断。

背景技术

随着人类生存环境的恶化，诱发癌症的因素越来越多，癌症的发病率呈明显的上升趋势，而癌症的主要生物学特征是侵袭和转移，肿瘤一旦发生转移将会给治疗带来很大的困难，因此肿瘤的早期诊断具有重要的意义，是否能早期诊断和治疗是治愈癌症的关键。因此癌症的早期诊断就显得十分重要。

肿瘤的转移是多数癌症至今难以克服及致死的主要原因。肿瘤转移主要通过血管和淋巴管途径实现，其中，淋巴管是其转移的主要通道。目前，临床上对于肿瘤及转移肿瘤的诊断主要是针对一些特异性的肿瘤标志物，采用组织切片，免疫组化，流式细胞等检测手段，但均为侵入性的，给患者带来身体的痛苦。近年来，无创伤性的肿瘤及转移肿瘤的影像学诊断有了很大的进展，除了传统的X线、超声波诊断技术、X线计算机体层摄影术(CT)、内镜及其衍生的相关技术以外，磁共振成像(MRI)，正电子发射体层扫描(PET)等技术和应用，更极大的提高了微小转移灶的检出率。MRI与PET均要求有采用双功能连接剂螯合相应的核素(如用于MRI的Gd以及放射性显像的^99mTc，¹¹¹In等)。临床上在利用MRI或CT等显像来进行淋巴转移肿瘤诊断时往往是通过淋巴结的大小及形状来区分肿瘤和正常组织，无法达到真正的靶向诊断(van den Brekel MW.Lymph node metastases：CT and MRI.Eur J Radiol 2000，33：230-8.)，该种诊断方式往往会造成假阴性。

叶酸是一种分子结构中有喋呤环的小分子，广泛参与核酸的嘧啶和嘌呤的合成。研究发现，叶酸受体在许多人体肿瘤细胞膜表面的表达数量及其活性显著高于正常组织细胞，且在一些淋巴转移的恶性肿瘤中表达量更高。人体内叶酸受体有α和β两个异构体，有研究证实两种受体都在许多种肿瘤细胞膜表面过度表达，而在正常组织中很少，因此叶酸受体可被视为肿瘤特异性靶点，不仅有潜力作为癌症治疗的靶点，还可以作为淋巴转移肿瘤影像学诊断的新靶点。DTPA-Folate是目前研究得比较深入的叶酸复合物，¹¹¹In-DTPA-Folate的I/II期临床实验已经完成，利用γ衍射照相法测定的结果显示该化合物可以在卵巢癌患者的恶性肿瘤处有效蓄积，在良性肿瘤中则没有表达，其诊断的灵敏度达到92％而特异性可以达到83％，由此采用叶酸受体作为特异性靶点，利用DTPA作为螯合剂进行肿瘤靶向诊断的策略是可行的。

核磁共振成像在医疗诊断中有很好的应用价值，但钆(Gd)作为一种常用的核磁共振造影剂存在有灵敏度低和特异性差的缺点。核素^99mTc具有优良的核性质和生产成本低的特点，短半衰期的核素符合小分子显像剂的要求，即药物要快速达到靶组织并迅速从血液中排出，因此有关^99mTc标记叶酸小分子的研究越来越多。然而，用^99mTc作为影像诊断具有空间分辨率低和特异性差的缺点。有报道采用PAMMA作为中间体连接多个螯合剂从而增加单个分子连接核素的数量，但是PAMMA本身的毒性限制了其进一步再临床上的应用(Noriko Sato et al，3D-Micro-MR Angiography of Mice UsingMacromolecular MR Contrast Agents With Polyamidoamine Dendrimer Core WithReference to Their Pharmacokinetic Properties，Hisataka Kobayashi.Magnetic Resonance inMedicine 2001，45：454-460)

发明内容

本发明的目的在于提供一种可与影像学核素结合用于肿瘤诊断的叶酸-聚乙二醇类复合物。

本发明首先构建一种叶酸受体介导的靶向性载体，在和影像学核素特异性结合后可以用于淋巴系统原发或转移瘤的诊断。

本发明的用于淋巴转移肿瘤影像学诊断的叶酸复合物，具有以下通式：

X-Y-CpL-Z

其中，X为叶酸及其衍生物，Y为聚乙二醇类及其衍生物，CpL为端位带有巯基化合物的寡聚赖氨酸，Z为用于螯合影像学核素的螯合剂。

所述物质X可以为叶酸、亚叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、2-去氨基-羟基叶酸、1-去氮叶酸、3-去氮叶酸、8-去氮叶酸，或其羧基位的乙二胺衍生物。

所述聚乙二醇类及其衍生物为具有O(CH₂O)_n-重复结构的聚乙二醇及其衍生物，其中聚乙二醇平均分子量为800～20,000；聚乙二醇类衍生物末端活性基团可以是马来酰亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺。

所述物质CpL其中的巯基化合物为半胱氨酸或一端为半胱氨酸修饰的，可以提供一个巯基与马来酰亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺特异性反应的巯基化合物，其中的寡聚赖氨酸为枝状结构寡聚赖氨酸，含有赖氨酸的个数为3，7或15，其可以提供多个末端氨基，所述末端可提供的游离氨基数分别为4，8或16个。

所述螯合剂为可螯合影像学核素的二乙三氨五醋酸，其分子数量是4、8或16个；所述的二乙三氨五醋酸可由羧基直接与CpL上的氨基连接，或以其他活性基团如异硫氰基间接连接。

本发明提供的用于肿瘤和淋巴转移肿瘤影像学诊断的高分子叶酸复合物，其中的叶酸复合物叶酸、聚乙二醇、功能性寡聚赖氨酸(CpL)和多个DTPA以共价键形式连接。通过寡聚赖氨酸增加螯合剂的密度，用大分子的聚乙二醇连接叶酸提高药物的亲水性，避免单核-巨噬细胞的吞噬作用，提高药物的肿瘤及淋巴转移肿瘤的靶向性，其中的小分子寡聚赖氨酸(CpL)能实现一个分子连接多个核素，达到肿瘤和淋巴肿瘤诊断的高靶向性和高分辨率。

所述的的叶酸复合物，可以与影像学核素形成复合物，用于核磁共振或放射性显像诊断。用于影像学诊断的放射性核素为^99mTc或¹¹¹In，所述核磁共振核素为Gd。

本发明同时提供了该复合物的制备方法及体内外表征：

1)半胱氨酸修饰的功能性寡聚赖氨酸(CpL)的固相合成

利用固相合成的方法在Boc-Cys(Mbzl)-PAM树脂上依次接上氨基Boc保护的赖氨酸，最终氟化氢切割树脂，纯化后得到，根据最后接的赖氨酸的个数不同，得到不同聚合度的CpL

2)叶酸-聚乙二醇(Folate-PEG)的制备

将叶酸或叶酸衍生物通过衍生化进行末端活性氨基修饰，在碱性条件下可与功能性聚乙二醇的N-羟基琥珀酰亚胺端高效反应，产物以凝胶色谱法纯化。

3)Folate-PEG-CpL的制备

将叶酸-聚乙二醇与CpL在pH7.4的磷酸盐缓冲液中搅拌反应制得，产物以凝胶色谱法纯化。

4)Folate-PEG-CpL-multiDTPA的制备

将Folate-PEG-CpL与DTPA酸酐或者p-SCN-Bn-DTPA在碱性条件下反应30小时后产物以凝胶色谱法纯化。

本发明进行了Folate-PEG-CpL-multiDTPA的体外表征及细胞学验证：

HPLC检测复合物的纯度，并利用FITC标记该复合物，通过叶酸受体高表达肿瘤细胞的内吞实验验证其肿瘤细胞的靶向性；

进行了Folate-PEG-CpL-multiDTPA用于荧光和放射性^99mTc标记及动物体内分布实验，利用整体动物荧光成像系统，观察荧光素标记的复合物在荷瘤裸鼠体内的分布，并对^99mTc标记的复合物的淋巴靶向性进行考察；

进行了Folate-PEG-CpL-multiDTPA用于核磁共振下显像剂Gd的裸鼠体内核磁共振显像试验。

本发明的实验结果表明该类复合物可以在组织间隙不透过毛细血管而导入淋巴系统，并且在淋巴结动态浓聚和消除，同时可以竞争性与叶酸受体高表达的肿瘤细胞结合，在动物实验中表现出了良好的淋巴导向性及肿瘤部位的蓄积性。

本发明的复合物具有如下特点

1)叶酸与叶酸受体高亲和力结合特性来实现肿瘤靶向；

2)利用亲水性的聚乙二醇来实现淋巴导向；

3)设计了一种半胱氨酸修饰的功能性寡聚赖氨酸(CpL)用以将多个螯合剂(如DTPA)与聚乙二醇连接起来；

4)该复合物同时与多个金属离子螯合(如^99mTc或¹¹¹In或Gd等)，用于肿瘤的放射性或者核磁共振影响学诊断，提高诊断的灵敏性。

附图说明

图1CKK₂的HPLC图谱，

色谱方法：色谱柱：Diamonsil C185μm 200×4.6mm迪马；流动相A：0.1％TFAH2O；流动相B：0.1％TFA乙腈；洗脱程序：0-2min 0％B，2～32min 0％-10％B，32～33min10％～90％B，33～36min 90％B；流速：0.7ml/min；柱温：25℃；检测：UV214nm，TR＝11.22min。

图2CKK2的质谱图，

由质谱结果可得其分子量为505.6与理论分子量相符合。

图3Folate-PEG的HPLC图谱，

色谱条件：色谱柱：YMC C18 300A 200×4.6mm；流动相A：0.1％TFA H2O；流动相B：0.1％TFA乙腈；洗脱程序：0-2min 5％B，2～32min 5％-65％B，32～33min65％～90％B，33～36min 90％B；流速：1.0ml/min；柱温：40℃；检测：UV280nm。

图4Folate-PEG-CKK2的HPLC图谱，

色谱条件同附图3。

图5Folate-PEG-CKK2-multiDTPA(I)的HPLC图谱，

色谱条件：色谱柱：TSK GEL G2000PWXL column 300×4.6mm；流动相：水；流速：0.5ml/min；柱温：25℃；检测：UV280nm；TR＝11.27min。

图6Folate-PEG-CKK2-multiDTPA(II)的HPLC图谱，

色谱条件：色谱柱：TSK GEL G2000PWXL column 300×4.6mm；流动相：水；流速：0.5ml/min；柱温：25℃；检测：UV280nm；TR＝11.55min。

图7Folate-PEG-CKK2-multiDTPA(I)-FITC细胞内化照片，

Folate-PEG-CKK2-multiDTPA(I)-FITC 100nM于37℃与SGC7901细胞作用4小时的荧光显微照片，其中A，B分别为正常给药组的明场与暗场照片；C，D分别为叶酸抑制组的明场与暗场照片。

图8Folate-PEG-CKK2-multiDTPA(II)-FITC细胞内化照片，

Folate-PEG-CKK2-multiDTPA(II)-FITC 100nM于37℃与KB细胞作用4小时的荧光显微照片，其中A，B分别为正常给药组的明场与暗场照片；C，D分别为叶酸抑制组的明场与暗场照片。

图9Folate-PEG-CKK2-multiDTPA(I)-FITC在裸鼠体内各脏器分布，

Folate-PEG-CKK2-multiDTPA(I)-FITC尾静脉注射荷SGC-7901瘤裸鼠，在2小时后处死裸鼠，取各脏器于NightOWL IILB 983活体动物成像系统内显像，由图中可得在肿瘤分布最高，肾脏其次，其余脏器分布较低，有良好的肿瘤靶向性。

图10Folate-PEG-CKK2-multiDTPA(II)在正常大鼠体内组织分布，

Folate-PEG-CKK2-multiDTPA(II)放射性99mTc标记后，于正常大鼠右足垫注射给药，在相应时间点处死老鼠，取各脏器测量放射性计数并计算ID％值作图，由分布图可得药物分子主要在给药侧淋巴结蓄积，在血液及其他脏器中无明显分布，具有良好的淋巴靶向性。

具体实施方式

通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但并不限制本发明的内容。

实施例1Folate-PEG-CKK₂-multiDTPA的制备

1、CKK₂(接有3个赖氨酸的CpL)的制备

称取Boc-Cys(Mbzl)-PAM树脂0.4167g(取代度0.6mmol/g)于接肽瓶中，树脂用DMF溶胀，二十分钟后，抽干。加入约两倍树脂体积的TFA搅拌反应1min，抽去TFA，再加入TFA同法操作一次，脱去Boc保护基。树脂用DMF洗涤后加入Boc-Lys(Boc)活化液(1.1mmolBoc-Lys(Boc)用2ml 0.5mmol/mlHBTU的DMF溶液和0.5mLDIPEA活化2min)，振摇反应40min。反应结束后抽去反应液，并用DMF洗涤树脂。随后按上述方法加入TFA进行脱保护，DMF洗涤后再加入Boc-Lys(Boc)活化液(2.2mmolBoc-Lys(Boc)用4ml 0.5mmol/mlHBTU的DMF溶液和1mLDIPEA活化2min)，振摇反应60min。反应结束后按前述方法洗涤树脂、TFA脱保护基。依次用DMF、DCM/MeOH(1/1)洗涤树脂，真空干燥。

将0.75g resin放入多肽切割管中，加入0.7g P-cresol，P-kresol，然后通入10mlHF，冰浴搅拌反应1hr。反应结束后减压抽去管中HF，残液用适量冰乙醚沉淀，过滤得沉淀并用冰乙醚洗涤沉淀3次。沉淀重新用TFA溶解，过滤得滤液。滤液再于冰乙醚中沉淀，砂芯漏斗过滤，弃滤液，以水复溶沉淀，冻干得CKK₂纯品，其HPLC图谱及质谱图(图1，2)。

2、叶酸-聚乙二醇(Folate-PEG)的制备

12mg(0.024mmol)EDA-叶酸(γ)分散在2.5mL DMSO中，超声30min待全部溶解后加入32mg(0.016mmol)Mal-PEG₂₀₀₀-NHS避光搅拌反应30min即结束反应，将反应溶液以等体积双蒸水(dH2O)稀释，于G-15凝胶柱上以dH₂O为流动相洗脱，收集相应组分，冷冻干燥，HPLC检测产物纯度，得淡黄色粉末状Folate-PEG，HPLC图谱(图3)。3、Folate-PEG₂₀₀₀-CKK₂的制备

用PBS(pH 7.0)缓冲溶液作为反应溶剂，溶解10mg(0.004mmol)叶酸(γ)-PEG，然后投入5mg(0.01mmol)CKK₂，在N₂保护下避光反应，反应过程用HPLC监测，30min后反应基本完全，结束反应，反应液以等体积双蒸水(dH₂O)稀释，于G-15凝胶柱上以dH₂O为流动相洗脱，收集相应组分，冷冻干燥，HPLC检测产物纯度，得淡黄色粉末状Folate-PEG-CKK₂，HPLC图谱(图4)。

4、Folate-PEG-CKK₂-multiDTPA的制备及表征

利用DTPA酸酐制备Folate-PEG-CKK₂-multiDTPA(I)及表征

DMF溶解6mg(0.002mmol)Folate-PEG₂₀₀₀-CKK₂，边搅拌边加入5.72mg(0.016mmol)DTPA酸酐，一开始为悬浊液，但随反应进行变为溶液，反应过程用Kaiser Test和HPLC监测，避光反应30h后结束反应。反应液以等体积双蒸水(dH₂O)稀释，于G-15凝胶柱上以含有20％乙醇的pH3.4醋酸缓冲盐为流动相洗脱，收集相应组分，冷冻干燥，得淡黄色粉末状Folate-PEG-CKK₂-multiDTPA(I)，HPLC图谱(图5)。

利用p-SCN-Bn-DTPA制备Folate-PEG-CKK₂-multiDTPA(II)

制备与纯化方法与4.1相同，将DTPA换成相应0.01mmol的p-SCN-Bn-DTPA即可，HPLC图谱(图6)。

实施例2Folate-PEG-CKK₂-multiDTPA的细胞验证

1、Folate-PEG-CKK₂-multiDTPA(I)荧光标记物的制备

Folate-PEG-CKK₂-multiDTPA(I)5mg与2mg EDC·HCl，2mg HOBt溶于DMSO中，室温搅拌1h后加入适量FITC-EDA，40℃反应2h，过程以HPLC监测，待反应基本结束后以200μL dH₂O稀释反应液有沉淀产生，离心取上清，并以150mL dH₂O洗涤沉淀3次后合并清液，上G-15凝胶柱分离纯化，收集相应产品，冻干得深黄色固体1.95mg。

2、Folate-PEG-CKK₂-multiDTPA(I)荧光标记物的叶酸受体亲和性评价

分别取对数生长期的单层培养SGC7901细胞，用0.25％胰蛋白酶和0.025％乙二胺四乙酸二钠消化单层培养细胞，用含10％小牛血清的RPMI1640培养液配成单细胞悬液，以每孔1×105个细胞接种于24孔培养板中，每孔体积1ml，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37℃，5％二氧化碳及饱和湿度条件下培养过夜，使细胞贴壁。次日，用含10％胎牛血清无叶酸RPMI1640培养液洗24孔板三遍，换成该培养液培养，以避免培养液中叶酸含量高出正常生理浓度时，对细胞摄取药物的影响。第三天，再用无叶酸RPMI1640培养液洗24孔板一遍，分别加入浓度为2×10^-7mol/L的Folate-PEG-CKK₂-multiDTPA(I)-FITC，叶酸抑制孔加入1mmol/L Folic acid，37℃孵育3h，吸弃上清液。用RPMI1640培养液洗板三次，在荧光显微境下观察，细胞内化照片(图7)。

3、Folate-PEG-CKK₂-multiDTPA(II)荧光标记物的制备

制备及纯化方法同Folate-PEG-CKK₂-multiDTPA(I)荧光标记物的制备

4、Folate-PEG-CKK₂-multiDTPA(II)荧光标记物的叶酸受体亲和性评价

叶酸受体特异性内吞实验同Folate-PEG-CKK₂-multiDTPA(I)，观察细胞内化结果(图8)。

实施例3Folate-PEG-CpL-multiDTPA荧光素和放射性^99mTc标记物在动物体内的验证

1、Folate-PEG-CKK₂-multiDTPA(I)荧光标记物在荷瘤裸鼠体内的分布

KB荷瘤裸小鼠四只，尾静脉注射给药Folate-PEG-CKK₂-multiDTPA(I)-FITC，剂量为1mg/只，2h后处死小鼠，在NightOWLIILB 983活体动物成像系统内进行观察，并取其心、肺、肝、脾、肾和肿瘤等脏器置活体动物成像系统内观察在各脏器内的分布(图9)。

2、Folate-PEG-CKK₂-multiDTPA(II)的放射性^99mTc标记物的淋巴系统导向性验证

(1)Folate-PEG-CKK₂-multiDTPA(II)的放射性^99mTc标记

将5mg Folate-PEG-CKK₂-multiDTPA(II)溶于208μL pH7.2等渗磷酸盐缓冲液中，在溶液中加入35μg/35μL的SnCl₂·2H₂O溶液，再在上述溶液中加入500μL 20mCi/mLNa^99mTcO₄，以磷酸盐缓冲液补充体积至1mL，反应15min，标记物通过纸层析测定其放化纯度达到90％以上。

(2)Folate-PEG-CKK₂-multiDTPA(II)-^99mTc在正常大鼠体内的淋巴导向性

取Wistar大鼠15只，体重160～180g。随机分为5组，每组3只。大鼠右足垫注射50μL Folate-PEG-multiDTPA(II)-^99mTc溶液(10mCi/ml，5.2mg/mL)。分别于给药10min、30min、1h、2h和4h后尾静脉取血，处死大鼠，取心、肝、脾、肺、肾、肌肉等脏器或组织，称重，测定放射性计数；并分别取其左、右侧的腘，髂淋巴结测定放射性计数，并计算占注射总放射性计数的百分数(ID％/g)，组织分布结果见附图10。

实施例4Folate-PEG-CpL-multiDTPA的Gd复合物制备

将5mg Folate-PEG-CKK₂-multiDTPA(II)溶于800μL醋酸盐缓冲液中(0.2MpH5.0)，在溶液中加入200μL GdCl₃溶液(0.05g/mL)搅拌反应24h后，于G-15凝胶柱上以dH₂O为流动相洗脱，收集相应组分，冷冻干燥，产物以HPLC检测，并通过高频电感耦合等离子体发射光谱法测定样品中Gd的含量为7.032％。