戊二酰胆固醇及其脂质体和该脂质体作为疫苗佐剂的应用

摘要

本发明涉及药物制剂领域，具体公开了戊二酰胆固醇(I)及其脂质体和该脂质体作为疫苗佐剂的应用。本发明的戊二酰胆固醇用于制备脂质体，该脂质体可以作为疫苗佐剂，将疫苗与本发明的戊二酰脂质体混合孵育即可用于临床。空白戊二酰-脂质体和疫苗可以分别贮存，随时可将疫苗溶液与该空白戊二酰-脂质体混合共孵育偶联，疫苗的结合率在85％以上。C57L/J动物实验研究表明，戊二酰-脂质体与蛋白疫苗或细胞疫苗偶联后应用，均提高了抗体滴度水平，增强其免疫应答。

说明书

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，具体涉及一种戊二酰胆固醇及用戊二酰胆固醇制备的脂质体，该脂质体可作为疫苗佐剂。

背景技术

随着生物工程技术的发展，人用疫苗的安全性已经得到了很大的提高，但其免疫原性却很弱，尤其是重组蛋白多肽类疫苗和DNA疫苗。因此需要免疫佐剂来提高免疫应答效果，而传统免疫佐剂的毒副作用比较大，当前迫切需要开发安全、有效的新型免疫佐剂来提高新一代疫苗的免疫应答效果。

脂质体(liposomes)是磷脂分散在水相中形成的脂质双分子层，其内部为水相的闭合囊泡。由于结构类似生物膜，故又称人工生物膜。自从1974年Allison和Gregoriadis首次证实脂质体能够增强机体对白喉类毒素的体液免疫应答以来，脂质体作为激活免疫系统的佐剂受到国内外学者的广泛关注。大量试验证实，脂质体具有良好的安全性、组织相容性和生物降解性，能够协助抗原或半抗原诱导体液免疫和/或细胞免疫，与其他佐剂联合应用时具有协同作用。而且脂质体可以通过多种免疫途径将各种来源的抗原(如细菌、病毒、肿瘤、寄生虫等)靶向传递至抗原递呈细胞(antigen presentig cells，APCS)。

脂质体作为一种新型疫苗佐剂已经得到生物学领域的广泛关注，但由于脂质体在作为疫苗佐剂应用时，多采用脂质体包裹疫苗的方式，包封率较低，且对于疫苗研究者来说自行制备脂质体和包裹疫苗的操作过程均比较难以实施，实际应用中需要一种可以广泛应用于各类疫苗，且使用简便的脂质体作为疫苗佐剂。

目前市面上可供使用的疫苗佐剂约有100余种，但从应用现状上来讲都不是很理想，原因是人们对免疫应答机制的原理尚不是很清楚，而且由于佐剂的自身局限性，即便针对同一抗原使用不同的佐剂也会产生完全不同的免疫效果，一些新的免疫佐剂研究还局限于动物模型实验。对于应用来说，各种佐剂急待于解决的缺点分别包括：(1)毒副作用问题，如铝佐剂、CT佐剂、QS21等；(2)免疫途径问题；(3)应用范围(用于不同的抗原)问题，如铝佐剂、CT佐剂等；(4)免疫剂量问题，如CpG-OND等；(5)免疫作用机制的不合理及作用机制不清楚问题，如铝佐剂不能诱导产生Th1型反应，干扰细胞免疫；CT等大多数佐剂分子作用不清楚等问题。而作用机制又是解决上述存在问题的关键。

脂质体作为佐剂可以克服上述大部分问题.它是生物可降解材料，没有毒性，没有免疫原性，免疫途径可以多选，因为它作为佐剂，既有细胞免疫又有黏膜免疫，还有体液免疫.因此应用范围比较广泛，除了自身可以诱导CTL和Th2免疫应答外，还可以包裹其他的一些免疫佐剂，进行互补.且其作用机制比较明确，主要是介导抗原靶向m细胞，并阻断抑制性m细胞的作用，m细胞进行颗粒加工后，大颗粒优先被m细胞摄取，加工后的抗原传递给DC和B细胞，再由它们递呈给T细胞.同时，它还可以诱导CTL，通过改变双层膜中的磷脂成分和两性分子，可调节所诱导的淋巴细胞和辅助细胞的反应.以脂质体作为佐剂制备疫苗的最大缺点是，生产工艺复杂、稳定性差、疫苗包封率低.目前已经有一些改进的方法以克服脂质体的部分缺点，例如，制备多囊脂质体或者凝胶包埋的脂质体提高稳定性，采用凝胶包埋脂质体避开有机溶剂的使用，保持疫苗的活性通过在脂质体表面连接能够靶向m细胞的功能基团提高靶向性等.但这些方法不能解决生产工艺复杂，贮存条件高和疫苗包封率低等问题.

发明内容

本发明公开了一种戊二酰胆固醇(Glutaryl-cholest)，结构式(I)如下：

本发明的戊二酰胆固醇是在胆固醇的末端修饰了戊二酰基。其分子式为C₃₀H₅₁O₄，分子量为500道尔顿，元素分析：C75.69％，H10.66％，质谱分析：MW 499道尔顿。

戊二酰胆固醇的制备方法如下：将戊二酸酐、胆固醇和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，加入CH₂Cl₂中溶解，50-100℃回流搅拌，即得。回流搅拌时间优选48-96h。产物后处理优选的方法：用HCl洗涤三次，饱和食盐水洗涤三次，加Na2SO4吸水，静置，抽滤，二氯甲烷洗涤，合并滤液，旋蒸。

以石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇(2∶1∶0.1)为展开剂，以20％乙醇-硫酸为显色剂，对产物进行TLC检测。

反应式为：C₅H₆O₃+C₂₇H₄₆O→C₃₀H₅₁O₄

本发明公开了一种空白脂质体制剂，它含有结构式I的戊二酰胆固醇、磷脂和水。本发明还公开了一种空白脂质体制剂，它含有结构式I的戊二酰胆固醇、磷脂和冻干保护剂。这两种空白脂质体均可成为戊二酰脂质体。

本发明的戊二酰脂质体可用以下方法制备：将戊二酰胆固醇和磷脂溶解在无水乙醇中，在25℃-40℃水浴中旋转蒸发，成膜后抽真空，加入水合液，在25℃-40℃水浴中下水合，在水浴中超声，制得粒径分布为180-250nm的空白脂质体。

上述水合液选自2-10％甘露醇水溶液、pH6.8磷酸盐缓冲液或pH7.4磷酸盐缓冲液。其中最佳选择是5％(w/v)甘露醇水溶液。

水合液的体积优选磷脂和戊二酰胆固醇混合有机相的2～5倍。

本发明的戊二酰脂质体表面有羧基，可以与蛋白疫苗或者多肽疫苗的氨基经活化剂活化后结合。

将疫苗与本发明的戊二酰脂质体混合孵育即可用于临床，或将冻干的戊二酰脂质体用水复溶后，与疫苗混合孵育即得。

疫苗与戊二酰脂质体在室温水相孵育后耦联，两者耦联的摩尔比比例优选为1∶1-3，偶联时优选加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和硫代对苯二甲醇活化终端基团(S-NHS)，约10-30分钟，再加入疫苗孵育，孵育时间优选1-4h.

将游离疫苗和与脂质体偶联的疫苗分离后，分别测定浓度，可以测得疫苗与本发明戊二酰脂质体的结合率在85％以上。疫苗和脂质体偶联后，脂质体的被动靶向性可以引导疫苗靶向巨噬细胞，并可以增强免疫应答，因此本发明的戊二酰脂质体可以作为疫苗的佐剂，提高疫苗的免疫原性。本发明的戊二酰脂质体经实验表明，对蛋白疫苗，和细胞疫苗均有免疫增强作用。

经C57L/J动物实验研究表明，戊二酰脂质体与蛋白疫苗和细胞疫苗结合后，可以有效提高该类疫苗的免疫活性。

附图说明

图1是接种HG-6蛋白疫苗的荷瘤小鼠的抗体滴度水平

(其中磷酸盐缓冲液组表示注射磷酸液缓冲液的荷瘤鼠在8周内的抗体滴度水平变化，空白脂质体组表示注射空白脂质体的荷瘤鼠在8周内的抗体滴度水平变化，疫苗组表示注射HG-6蛋白疫苗的荷瘤鼠在8周内的抗体滴度水平变化，疫苗-脂质体组表示注射与预制脂质体耦联的HG-6蛋白疫苗的荷瘤鼠在8周内的抗体滴度水平变化)

图2是接种Hepa1-6细胞疫苗的荷瘤小鼠的抗体滴度水平

(其中磷酸盐缓冲液组表示注射磷酸液缓冲液的荷瘤鼠在8周内的抗体滴度水平变化，空白脂质体组表示注射空白脂质体的荷瘤鼠在8周内的抗体滴度水平变化，疫苗组表示注射Hepa1-6细胞疫苗的荷瘤鼠在8周内的抗体滴度水平变化，疫苗-脂质体组表示注射与预制脂质体耦联的Hepa1-6细胞疫苗的荷瘤鼠在8周内的抗体滴度水平变化)

具体实施方式

实施例1

戊二酰胆固醇的合成方法

1.在100ml茄形瓶中加入戊二酸酐300mg(3mmol)，胆固醇290mg(0.75mmol)，DMAP351mg(1.5mmol)，加入适量CH₂Cl₂溶解，在75℃水浴下回流搅拌96h，抽滤得戊二酰胆固醇。

2.将上述产物置于干净分液漏斗中，用HCl将上述所得洗涤三次，饱和食盐水洗涤三次，加入烘干的Na₂SO₄吸水，静置，抽滤。

3.以二氯甲烷再次洗涤产物，合并滤液，旋蒸，抽滤，得纯化产物。

4.以石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇(2∶1∶0.1)为展开剂，以20％乙醇-硫酸为显色剂，对产物进行TLC检测。

5.将纯化产物称重，计算收率和纯度。用德国ELEMENTAR公司的元素分析仪检测C，H含量，理论值C％为76.80％，H％为10.40％，实测值C％为75.69％，H％为10.66％。用质谱仪检测其分子量，理论分子量为500道尔顿，实测分子量为499道尔顿。经计算收率为75.43％，纯度为99％。结构式如下：

实施例2

戊二酰脂质体的制备方法：

精密称取大豆磷脂90mg、戊二酰胆固醇30mg，置250ml茄形瓶中，加入3ml无水乙醇溶解卵磷脂和胆固醇。在37℃水浴温度下旋转1小时蒸除有机溶剂，使脂质在器壁上形成一层均匀的薄膜。加入5％甘露醇12ml作为水合液，在室温下旋转洗膜，水化30分钟。水合后的混悬液在水浴中超声20分钟，得平均粒径为180-230nm的脂质体。

实施例3

参照实施例2的制备方法，所不同的是，溶解卵磷脂和胆固醇所用的有机溶剂替换为乙醚，水合液5％甘露醇的体积增加至15ml。制得脂质体平均粒径为220-260nm。

实施例4

参照实施例2的制备方法，所不同的是，将卵磷脂的用量增加至120mg，将水合液替换为pH7.4的PBS溶液。水合后的超声时间缩短至10分钟，制得脂质体平均粒径470-530nm。

实施例5

参照实施例3的制备方法，所不同的是，将旋转蒸发的成膜时间增加至1.5小时，将旋转水合时间增加为1小时。制得脂质体平均粒径为200-250nm。

实施例6

将上述实施例制得的脂质体放置1，2，3，6月后测定其粒径，观察其性状。其粒径测定结果见表1，脂质体仍呈混悬状态，无沉淀，说明其稳定性好。

表1脂质体粒径测定

实施例7

蛋白疫苗和戊二酰脂质体结合率的测定

1.蛋白疫苗和戊二酰脂质体的偶联

蛋白疫苗溶解于50mmL的硼酸盐缓冲液，0.1mol/LNaCl，pH7.5，蛋白浓度为1mg/ml。取200μL本发明的戊二酰脂质体(1μL脂质)中加入20μL EDC(0.25mol/L水溶液)和20μL S-NHS(0.1mol/L水溶液)，孵育10分钟，加入200μL蛋白溶液混合，孵育3小时。

2.蛋白疫苗和戊二酰脂质体偶联后得到的溶液过G100柱分离，分别得到游离蛋白疫苗和与戊二酰脂质体偶联的蛋白疫苗。精密量取游离蛋白和与戊二酰脂质体偶联的蛋白溶液的体积，用考马思亮兰法测定蛋白浓度。根据下列公式计算蛋白疫苗和戊二酰脂质体的偶联率：

计算所得平均耦联率为87.3％。

结果见表2。

表2疫苗和脂质体结合率的测定

说明疫苗和戊二酰脂质体的结合较稳定。

实施例8

蛋白疫苗药理试验

1.动物：雄性C57L/J小鼠32只，7-8周龄，随机分为A，B，C，D三组，每组8只，安静条件下饲养一周。A组为建模空白对照组，B组为阴性对照组，注射空白脂质体，C组为阳性对照组，注射HG-6蛋白疫苗，D组为给药组，注射本发明的与预制空白脂质体耦联的HG-6蛋白疫苗。

2.动物免疫方案：

空白对照组：每只C57L/J小鼠皮下注射PBS缓冲液0.1ml，之后每隔2周注射一次，总共4次。

阴性对照组：第一次免疫时，将脂质体以生理盐水稀释，配成脂质浓度为0.5mg/ml的溶液，小鼠皮下注射100μl/只，含50μg的脂质。以后每隔2周加强免疫一次，共进行3次加强免疫。

阳性对照组：第一次免疫时，将HG-6纯化蛋白溶解于生理盐水，配成蛋白浓度为1mg/ml的溶液，然后与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后小鼠皮下注射100μl/只，含50μg的蛋白。以后每隔2周加强免疫一次，共进行3次加强免疫，加强免疫与初次免疫的不同是将蛋白溶液与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化后小鼠皮下注射。

给药组：第一次免疫时，将与预制脂质体耦联的HG-6蛋白溶解于生理盐水，配成蛋白浓度为0.5mg/ml的溶液，小鼠皮下注射100μl/只，含50μg的蛋白和50μg的脂质.以后每隔2周加强免疫一次，共进行3次加强免疫.

从第一次免疫后一周开始，每周小鼠眼眶后静脉丛取血一次，每次0.1ml左右，4000rpm离心十分钟，取血清冷冻保存。

3.抗体滴度检测：

用纯化的GFP-(GRP-10)作为包被抗原4℃过夜包被96孔ELISA酶标板，每孔100μl含50μg包被抗原。包被后，用5％牛血清白蛋白(BSA)溶液在37℃满孔封闭1h。免疫后取血所得抗血清，用5％BSA(于PH7.4的PBS中)稀释100倍，然后每孔加入100μl稀释后的抗血清于37℃作用1h。用PBST(含0.05％Tween-20)洗涤6次后加入100μl以1∶20000稀释的羊抗小鼠IgG二抗(辣根过氧化物酶标记)，每孔100μl，37℃作用1h。PBST洗涤6次后，每孔加入100μl显色液，于37℃闭光显色30min后，加入50μl 2mol/L H₂SO₄终止反应，于450nm处测定吸光值。

4.结果：

小鼠免疫后每周眼眶取血一次，并分离血清用于抗体ELISA检测。以GFP-(GRP-10)蛋白作为包被蛋白，用间接ELISA法测定血清中抗GRP抗体水平，结果见图1。从图1可以看出，第一次免疫后的两周内都只有很低的抗体产生，当第二次免疫后也就是第三周开始HG-6-脂质体组抗体达到0.4μg/ml并开始逐渐升高，最后一次免疫后血清中检测到较高浓度的抗GRP的抗体水平达到1.7μg/ml左右，PBS对照组几乎检测不到抗GRP的抗体产生，HG-6蛋白组的小鼠血清中抗GRP的抗体水平为1.2μg/ml左右。

实施例9

细胞疫苗药理学实验

1.动物：雄性C57L/J小鼠32只，7-8周龄，随机分为A，B，C，D三组，每组8只，安静条件下饲养一周。A组为建模空白对照组，B组为阴性对照组，注射空白脂质体，C组为阳性对照组，注射加入弗氏不完全佐剂的细胞疫苗，D组为给药组，注射本发明与预制空白脂质体耦联的细胞疫苗。

2.动物免疫方案：

空白对照组：每只C57L/J小鼠皮下注射PBS缓冲液0.1ml，之后每隔2周注射一次，总共4次。

阴性对照组：第一次免疫时，将脂质体以生理盐水稀释，配成脂质浓度为0.5mg/ml的溶液，小鼠皮下注射100μl/只，含50μg的脂质。以后每隔2周加强免疫一次，共进行3次加强免疫。

阳性对照组：第一次免疫时，将细胞疫苗溶解于生理盐水，配成细胞疫苗浓度为1mg/ml的溶液，然后与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后小鼠皮下注射100μl/只，含50μg的细胞疫苗。以后每隔2周加强免疫一次，共进行3次加强免疫，加强免疫与初次免疫的不同是将细胞疫苗溶液与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化后小鼠皮下注射。

给药组：第一次免疫时，将与预制脂质体耦联的细胞疫苗溶解于生理盐水，配成细胞疫苗浓度为0.5mg/ml的溶液，小鼠皮下注射100μl/只，含50μg的细胞疫苗和50μg的脂质。以后每隔2周加强免疫一次，共进行3次加强免疫。

从第一次免疫后一周开始，每周小鼠眼眶后静脉丛取血一次，每次0.1ml左右，4000rpm离心十分钟，取血清冷冻保存.

3.抗体滴度检测：

用纯化的粉碎的细胞作为包被抗原4℃过夜包被96孔ELISA酶标板，每孔100μl含50μg包被抗原。包被后，用5％牛血清白蛋白(BSA)溶液在37℃满孔封闭1h。免疫后取血所得抗血清，用5％BSA(于PH7.4的PBS中)稀释100倍，然后每孔加入100μl稀释后的抗血清于37℃作用1h。用PBST(含0.05％Tween-20)洗涤6次后加入100μl以1∶20000稀释的羊抗小鼠IgG二抗(辣根过氧化物酶标记)，每孔100μl，37℃作用1h。PBST洗涤6次后，每孔加入100μl显色液，于37℃闭光显色30min后，加入50μl 2mol/L H₂SO₄终止反应，于450nm处测定吸光值。

4.结果：

小鼠免疫后每周眼眶取血一次，并分离血清用于抗体ELISA检测。以粉碎的细胞作为包被液，用间接ELISA法测定血清中抗体水平，结果见图2。从图2可以看出，第一次免疫后的两周内都只有很低的抗体产生，当第二次免疫后也就是第三周开始细胞疫苗和弗氏不完全佐剂给药组的抗体达到0.4μg/ml并开始逐渐升高，而细胞疫苗-脂质体给药组的抗体达到0.7μg/ml，最后一次免疫后血清中检测到细胞疫苗-脂质体给药组的抗体高达1.6μg/ml，PBS对照组几乎检测不到抗体产生，细胞疫苗和弗氏不完全佐剂混合组的小鼠血清中抗体水平为0.9μg/ml左右。