一种滇桂艾纳香水溶性多糖的制备方法

摘要

本发明公开了一种滇桂艾纳香水溶性多糖的制备方法。该方法之一包括：提取、膜分离、脱蛋白、除盐、脱色、精制和精制。该方法之二包括：提取、膜分离、脱蛋白、硅胶柱色谱分离、脱色、透析和精制。本发明具有工艺流程简单、节约能耗、产物纯度较高，质量稳定等优点。特别是本发明产品在凝血复钙实验和小白鼠离体子宫实验中具备显著的止血活性作用。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体是一种滇桂艾纳香水溶性多糖的制备方法。

背景技术

滇桂艾纳香系菊科艾纳香属植物，《中华药海》中记载，滇桂艾纳香性味归经：淡、甘平，入肝、肾、膀胱三经；功效主治：活血止血-本品甘淡入肝，养肝活血、质涩，收敛止血，具有活血不伤血、止血不留瘀之功，可用于各种出血症；《新华本草纲要》中也提到其活血、止血功能，可用于经期提前，产后血崩等妇科出血症状。

滇桂艾纳香做为广西民间用药已有较长的历史，在民间均以水煎汤剂服用，用于治疗妇女功能性子宫出血，产后出血等症有独特的疗效。目前以滇桂艾纳香开发的中成药物主要是广西南宁桂西制药厂生产的妇血康颗粒，妇血康胶囊等药品。因此，滇桂艾纳香是一个极具开发利用价值的民间中草药。国内各学科领域的专家学者对该植物所含化学成分和药物作用展开了大量的研究工作。从中发现了豆甾醇、表木栓醇、木栓酮、棕桐酸乙酯、十八酸乙酯、咖啡酸、β-谷甾醇、小麦黄素、小麦黄素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、芹菜素、芹菜素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、木犀草、木犀草素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等化合物。但目前国内外仍少见有关滇桂艾纳香具体化学成分在药理活性方面的研究报告。特别是对滇桂艾纳香植物所含多糖类物质的相关研究还非常有限。

各种研究表明，糖类物质具有多样的生物功能，如在抗癌、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、降血糖等方面具有独特功效。由于多糖的生物活性非常广泛且细胞毒性作用小，在癌症治疗、糖尿病治疗和抗病毒感染等多种疾病方面有相当显著的治疗效果。人们对多糖，特别是中药多糖进行了深入的研究和应用，其生物学意义受到了广泛关注，成为医药界热点领域之一。

发明内容

本发明提供一种从滇桂艾纳香植物中提取滇桂艾纳香水溶性多糖的制备方法。以便于明确滇桂艾纳香在治疗妇女功能性子宫出血、产后出血等症中发挥止血作用的具体化学成分，为滇桂艾纳香植物的进一步研究和药物开发利用提供参考依据。

本发明为了解决上述技术问题的技术方案如下：

滇桂艾纳香水溶性多糖的制备方法之一，包括如下步骤：

(1)提取：将滇桂艾纳香干药材每次加入15倍重量的去离子水或蒸馏水煎煮，共2次，每次3小时，过滤，合并滤液。

(2)膜分离：将提取的滤液用中空管状陶瓷微滤膜及中空管状有机超滤膜进行微滤和超滤分离，得到分子量范围在10³至10⁴之间的分离液，将该分离液用旋转蒸发仪60℃减压浓缩至约0.1g/mL。

(3)脱蛋白：在冰浴及搅拌条件下，加入重量浓度为20％三氯乙酸水溶液，使多糖溶液体系中三氯乙酸的重量浓度达到5％，静置过夜后离心去除植物蛋白沉淀。

(4)除盐：离心后的上清液用1mol/L的NaOH溶液中和至pH等于7；减压浓缩至约0.2～0.5g/mL，冷却至室温后加无水乙醇至溶液中乙醇的浓度为75～80％，在5℃冰箱中静置使盐沉淀，离心分离除去沉淀的三氯乙酸纳盐；将上清液减压蒸干除去乙醇后，用100mL去离子水或蒸馏水溶解。

(5)脱色：将上述脱盐及去除乙醇后的多糖溶液，以DEAE阴离子交换柱色谱脱色分离，用去离子水洗脱多糖，收集含糖溶液，减压浓缩至糖含量0.5g/mL，经冷冻干燥得初步纯化的棕黄色絮状粗多糖。

(6)精制：将(5)的粗多糖溶于10mL去离子水中，用0.45μm微孔过滤膜减压过滤后，过Sephadex G-10凝胶色谱分离去除残余的盐份和其他小分子杂质，再利用Sephadex G-50凝胶色谱进行纯化，以超纯水为流动相，经自动部分接收器定量接收，紫外光谱检测，合并单峰部分溶液，将该溶液减压浓缩至糖含量0.5～1.0g/mL，经冷冻干燥，获得得精制的滇桂艾纳香水溶性多糖。

滇桂艾纳香水溶性多糖的制备方法之二，包括如下步骤：

(1)提取：将滇桂艾纳香干药材每次加入10倍重量的去离子水或蒸馏水煎煮，共3次，每次2小时，过滤，合并滤液。

(2)膜分离：将提取的滤液用中空管状陶瓷微滤膜及中空管状有机超滤膜进行微滤和超滤分离，得到分子量范围在10³至10⁴之间的分离液，将该分离液减压浓缩至约0.2g/mL。

(3)脱蛋白：在冰浴条件下，边搅拌边加浓度为20％三氯乙酸水溶液，使三氯乙酸的浓度达到5％，在5℃冰箱中静置过夜后离心去除植物蛋白沉淀；上清液用1mol/L的NaOH溶液中和至pH等于7，减压浓缩后过滤除去沉淀的盐分。

(4)硅胶柱色谱分离：将脱蛋白后的多糖浓缩溶液约0.5g/mL。，均匀拌入200目硅胶减压蒸干后，干法上样过硅胶柱，用甲醇和乙酸乙酯按不同比例混合的溶液体系梯度洗脱。收集含糖部分洗脱液，减压蒸干除完甲醇和乙酸乙酯后用约50mL的水溶解并过滤，经冷冻干燥得初步纯化的棕黄色粗多糖。

(5)脱色：将粗多糖溶于5倍重量的去离子水。以DEAE阴离子交换柱色谱脱色分离，用去离子水洗脱多糖。收集含糖溶液，减压浓缩至约0.1g/mL。

(6)透析：将脱色的多糖浓缩液用截留分子量为10³Da的透析袋流水透析48h，去离子水透析24h，除去盐及小分子量杂质。减压浓缩透析袋内溶液至0.5～1.0g/mL。

(7)精制：将多糖浓缩液用0.45μm微孔过滤膜减压过滤后，再利用Sephadex G-50凝胶色谱进一步纯化，以超纯水为流动相，经自动部分接收器定量接收，紫外光谱检测，合并单峰部分溶液，减压浓缩后冷冻干燥，获得精制的滇桂艾纳香水溶性多糖。

上述制备方法之一和制备方法之二中，所述步骤(2)膜分离：所用膜分离设备为合肥世杰膜工程有限责任公司生产，陶瓷微滤膜的截留分子量为10⁵Da，有机超滤膜的截留分子量分别为10⁴Da和10³Da。

上述制备方法之一和制备方法之二中，所述减压浓缩均利用旋转蒸发仪在不高于60℃条件下减压蒸发浓缩。

上述制备方法之一和制备方法之二制备的滇桂艾纳香水溶性多糖的特征为：(a)滇桂艾纳香多糖外观为白色棉状固体，是分子量分布均一的单纯组分，其数均分子量和重均分子量分别为2654和2716；(b)滇桂艾纳香水溶性多糖由甘露糖和果糖组成。

上述制备方法之一和制备方法之二制备的滇桂艾纳香水溶性多糖具有止血功能，可用于治疗妇女功能性子宫出血、产后出血等症。

本发明的优点是：

1.本发明结合使用膜分离、硅胶柱色谱及凝胶柱色谱等方法分离纯化水溶性多糖，具有工艺流程简单、节约能耗等优点。

2.产物纯度较高，质量稳定；特别是在凝血复钙实验和小白鼠离体子宫实验中具备显著的止血活性作用。

附图说明

图1是本发明滇桂艾纳香水溶性多糖的GPC凝胶渗透色谱图。

图2是本发明滇桂艾纳香水溶性多糖的紫外图谱。

图3是本发明滇桂艾纳香水溶性多糖的红外图谱。

图4是本发明滇桂艾纳香水溶性多糖的高效液相色谱。

图5是标准单糖的高效液相色谱。

具体实施方式

对本发明滇桂艾纳香水溶性多糖的成分分析：

1.滇桂艾纳香水溶性多糖分子量分布测试

对滇桂艾纳香水溶性多糖采用凝胶渗透色谱(GPC)分析，如.图1所示，单一对称峰型表明该多糖是分子量分布均一单纯组份，用已知分子量的多糖为标样，并且建立GPC校正曲线。根据标准校正曲线求得该多糖的数均分子量和重均分子量分别为2654和2716。

2.紫外光谱检测

对滇桂艾纳香水溶性多糖进行紫外光谱检测：取滇桂艾纳香多糖约1mg，加适量水溶解，在波长200～600nm范围内进行扫描，以去离子水作为空白。经紫外扫描280nm处无吸收，如图2所示，确定不含有多肽、蛋白质。

3.红外光谱检测

对滇桂艾纳香水溶性多糖进行红外光谱检测：取纯化干燥的滇桂艾纳香水溶性多糖样品约2mg，加适量KBr研磨至细，压片，测定红外光谱。如图3所示，图谱显示滇桂艾纳香水溶性多糖在4000～500cm^-1范围内具有β-呋喃糖类物质的特征吸收峰。

4.单糖组成分析

对滇桂艾纳香水溶性多糖进行单糖组成分析：滇桂艾纳香水溶性多糖经硫酸完全水解后，利用高效液相色谱分析如图4所示。通过与D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、L-鼠李糖等单糖标品对照，如图5所示，证实滇桂艾纳香水溶性多糖由果糖和甘露糖构成。

下面结合实本发明的二个实施例对本发明作详细说明。但需要说明的是，实施例并不构成对本发明要求保护范围的限制。

实施例1

滇桂艾纳香水溶性多糖制备方法一，操作步骤依次如下：

1.提取：将3.0kg滇桂艾纳香干药材每次加入15倍重量的去离子水煎煮2次，每次3小时，过滤，合并滤液。

2.膜分离：利用膜分离设备进行粗分，将步骤1提取的滤液过截留分子量为10⁵Da的陶瓷膜，分子量小于10⁵Da的滤液通过截留分子量为10⁴Da的有机膜，滤液继续通过截留分子量为10³Da的有机膜，得到分子量范围在10³至10⁴之间的截留液，减压浓缩至500mL。

(3)脱蛋白：在冰浴及搅拌条件下加入重量浓度为20％的三氯乙酸水溶液约170mL，使溶液体系中三氯乙酸重量浓度为5％，5℃冰箱静置过夜后离心去除沉淀的植物蛋白。

4.除盐：脱蛋白后的上清液用1mol/L的NaOH溶液中和至pH值等于7，浓缩多糖溶液至至糖含量0.5g/mL，冷却至室温后加无水乙醇至溶液的乙醇浓度约为75～80％，使三氯乙酸钠盐沉淀，于5℃冰箱静置12h，离心除去沉淀的盐份。将上清液减压蒸干除去乙醇后，用100mL去离子水或蒸馏水溶解。

5.脱色：将上述脱盐及去除乙醇后的多糖溶液以DEAE阴离子交换柱色谱脱色。以去离子水洗脱多糖成分。减压浓缩至糖含量约0.5g/mL。经冷冻干燥得4g初步纯化的浅黄色絮状粗多糖。

6.精制：将脱色完全的粗多糖溶于约10mL去离子水，用0.45μm的微孔过滤膜减压过滤后，过SephadexG-10凝胶柱色谱，分离去除残余的盐份和其他小分子杂质，再利用Sephadex G-50凝胶色谱进行纯化，以超纯水为流动相，经自动部分接收器定量接收，紫外光谱检测。合并单峰部分溶液，冷冻干燥，得2.70g纯净的滇桂艾纳香水溶性多糖。

实施例2

滇桂艾纳香水溶性多糖制备方法二，操作步骤依次如下：

1.提取：将3.0kg滇桂艾纳香干药材每次加入10倍重量的蒸馏水煎煮3次，每次2小时，过滤，合并滤液。

2.膜分离：利用膜分离设备进行粗分，将步骤1提取的滤液过截留分子量为10⁵Da的陶瓷膜，分子量小于10⁵Da的滤液通过截留分子量为10⁴Da的有机膜，滤液继续通过截留分子量为10³Da的有机膜，得到分子量范围在10³至10⁴之间的截留液，减压浓缩至500mL。

3.脱蛋白：在冰浴条件下，边搅拌边加重量浓度为20％三氯乙酸水溶液约170mL，使三氯乙酸的重量浓度达到5％，冰箱静置过夜后离心去除沉淀的植物蛋白。上清液用1mol/L的NaOH溶液中和，浓缩至50mL约0.2克g/mL后过滤除去沉淀的盐分。

4.硅胶柱色谱分离：将脱蛋白的多糖浓缩液约0.5g/mL，均匀拌入100g硅胶(200目)减压蒸干，干法上样过硅胶柱，用甲醇和乙酸乙酯按1∶4、2∶3、3∶2和4∶1不同比例的混合体系梯度洗脱。收集合并甲醇、乙酸乙酯为4∶1的流动相洗脱的含糖溶液，减压蒸干甲醇和乙酸乙酯后用约50mL水溶解并过滤，经冷冻干燥得6g初步纯化的棕黄色粗多糖。

5.脱色：将粗多糖溶于30mL去离子水，以DEAE阴离子交换柱色谱脱色。以去离子水洗脱水溶性多糖。收集含糖溶液并减压浓缩至80mL。

6.透析：将脱色的多糖浓缩液用透析袋截留分子量为10³Da流水透析48h，去离子水透析24h，除盐及小分子量杂质。将透析袋内溶液减压浓缩至10mL。

7.精制：将多糖浓缩液用0.45μm的微孔过滤膜减压过滤后再利用Sephadex G-50凝胶色谱进一步纯化，以超纯水为流动相，经自动部分接收器定量接收，紫外光谱检测。合并单峰部分溶液，浓缩后冷冻干燥，获得3.15g纯净的滇桂艾纳香水溶性多糖。