一种木聚糖酶/纤维二糖酶复合酶及其制备方法

摘要

本发明提供了利用黑曲霉菌株(Aspergillus niger)CGMCC3.3147制备的木聚糖酶/纤维二糖酶复合酶及其制备方法。本发明可通过黑曲霉菌株高效联产木聚糖酶和纤维二糖酶，通过优选的发酵培养基，其中产酶木聚糖酶可达10000IU/g，纤维二糖酶可达900IU/g；制备的复合酶可直接与纤维素酶混合使用于秸秆发酵酒精、木糖醇、柠檬酸等生产中。对于人类解决环境污染、食品短缺和能源危机具有重大的现实意义。

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，具体的说，涉及一种木聚糖酶/纤维二糖酶复合酶及其制备方法。

背景技术

木聚糖在植物细胞壁中的含量仅次于纤维素，是含量最丰富的半纤维素。纤维质原料中纤维素、半纤维素、木质素分别占30～40％、15～30％、10～20％。其中木聚糖是半纤维素的主要组成部分。木聚糖是由D-木糖主链(以β-1，4键相连)和L-阿拉伯糖分枝(a-1，2和a-1，3相连)所组成的聚合物。它结合在纤维素微纤维的表面，并且相互连接，构成了坚硬的细胞相互连接的网络。这种坚硬的网络阻碍了纤维素酶对纤维素吸附，从而影响了纤维素的降解速率。目前纤维质原料酒精发酵主要是利用纤维素酶降解纤维素得到的六碳糖进行酒精发酵，而其中的半纤维素没有得到充分利用，并且造成了资源浪费和严重的环境污染。

木聚糖酶是专一降解木聚糖的酶，属于水解酶类，可将木聚糖分解为木寡糖。木聚糖酶是具有四级结构的大分子活性蛋白，主要由β-1，4-D-内切木聚糖酶、β-1，4-D-外切木糖苷酶和α-L-阿拉伯糖苷酶、α-D-氨基酸醛酸酶等脱支链酶组成。木聚糖酶通过破坏木聚糖分子中的共价交联(阿拉伯糖残基取代区)以及通过氢键形成的连接区，使木聚糖降解。作为一种工业用酶制剂，木聚糖酶在乙醇发酵、饲料工业和食品工业等具有重要的应用价值。

纤维素酶是一种多组分的复合酶，它主要包括内切型葡聚糖酶(EC3.2.1.4，也称Cx酶、CMC酶)、外切型葡聚糖酶(EC3.2.1.91，也称C1酶、微晶纤维素酶)和纤维二糖酶(EC3.2.1.21，也称β-葡萄糖苷酶)。有关纤维素的酶水解机理至今仍未完全研究清楚，但普遍认为在将天然纤维素水解成葡萄糖的过程中，必须依靠上述3种组分的协同作用才能完成。纤维素大分子首先在C1酶和Cx酶的作用下逐步降解成纤维二糖，而纤维二糖酶则进一步将纤维二糖水解成2个葡萄糖。由于纤维二糖对C1酶和Cx酶活力有强烈的抑制作用，如果纤维素酶复合组分中缺乏纤维二糖酶组分就会严重影响纤维素的降解速率。而目前已知的纤维素酶生产菌株中缺少纤维二糖酶组分，因此生产过程中有必要添加外源的纤维二糖酶。

目前的纤维质原料酒精发酵中，随着可以同化五碳糖(主要是木糖)生产酒精的重组酵母的出现，半纤维素有望得到充分利用，但是由于酵母不能直接利用半纤维素，所以需要添加木聚糖酶来将木聚糖降解为木糖。因此廉价、高效木聚糖酶的开发就变得非常紧迫。

本发明针对纤维质原料酒精发酵所遇到的问题，提供一种木聚糖酶/纤维素酶复合酶及其制备方法。

发明内容

本发明的目的是提供利用黑曲霉菌株CGMCC3.3147制备的木聚糖酶/纤维二糖酶复合酶。

本发明还针对纤维质原料预处理用酶技术的不足，提供一种操作简便，成本低，酶活力高，酶组分配比合理的固体发酵生产木聚糖酶/纤维二糖酶复合酶的方法。

本发明以黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC3.3147为出发菌株，将该菌株在玉米芯、麦草、稻草等农林废弃物上进行培养，对培养基配方中麸皮、尿素、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钴、初始pH、水分共8个因素(其中两个为培养条件)进行研究，选用N＝12的Plackett-Burman使用设计，筛选影响木聚糖酶和二糖酶产量的关键因子，根据Plackett-Burman实验分析的结果利用最陡爬坡法确定中心组合试验的中心点，逼近最大响应区域，最后设计中心组合实验，拟合出一个二元二次多项式方程，找出最佳培养基配方。通过上述方法获得的优化发酵培养基配方为：

农作物废弃物50～80％、麸皮15～45％、尿素1～3％、铵盐0.2～1％、磷酸盐0.03～0.1％、硫酸镁0.002～0.008％、氯化钴0.0001～0.001％，余量水，初始pH5.0～7.0；后加入水调整水分为60～80％。

所述发酵培养基中还包括微量元素，如硫酸镁、氯化钴等，一般硫酸镁的含量为0.002％-0.004％；氯化钴的含量一般为0.0001％-0.0005％。

本发明所述农作物废弃物包括玉米秸秆、玉米芯、小麦秸秆、稻草等收获农作物籽实后的剩余部分；

所述铵盐为硫酸铵和/或硝酸铵。

所述磷酸盐为磷酸氢二钾和/或磷酸二氢钾。

所述发酵培养基为固体发酵培养基。

本发明所述的木聚糖酶/纤维二糖酶复合酶的制备方法为：将黑曲霉诱变菌株按1～15％的接种量接种至上述发酵培养基中，在26-40℃培养4～5天；然后按照常规方法培养生产复合酶，其中，接种量优选10％。

在将菌株接种至发酵培养基前，本发明所述的木聚糖酶/纤维二糖酶复合酶的制备方法还包括将变异黑曲霉按1～2％接种量先接入麸曲培养基中，在20-30℃下条件培养5-10天。

所述麸曲培养基含有农作物废弃物50～80％、麸皮15～45％、尿素1～3％、铵盐0.2～1％、磷酸盐0.03～0.1％，余量水。

在培养过程中，麸曲培养基和发酵培养基可采用相同成分的固体培养基。

所述麸曲培养基中还包括微量元素，如硫酸镁、氯化钴等，一般硫酸镁的含量为0.002％-0.004％；氯化钴的含量一般为0.0001％-0.0005％。

其中，所述铵盐为硫酸铵和/或硝酸铵，优选硝酸铵。

所述磷酸盐为磷酸氢二钾和/或磷酸二氢钾，优选的磷酸氢二钾。

本发明的关键点在于利用菌种CGMCC3.3147并优化培养基配方，使木聚糖酶和纤维二糖酶同时高产，其产酶木聚糖酶可达10，000IU/g，纤维二糖酶可达900IU/g。

本发明通过黑曲霉菌株CGMCC3.3147可高效联产木聚糖酶和纤维二糖酶，通过优选的发酵培养基，其产酶木聚糖酶可达10，000IU/g，纤维二糖酶可达900IU/g；制备的复合酶可直接与纤维素酶混合使用于秸秆发酵酒精、木糖醇、柠檬酸等生产中.对于人类解决环境污染、食品短缺和能源危机具有重大的现实意义.

附图说明

图1为木聚糖酶/纤维二糖酶复合酶生产工艺路线图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将结合实施例来进一步详细描述本发明。这些实施例只是起到说明的作用，本发明并不局限于这些实施例。

下面实施例中所采用的菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC3.3147(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)；所使用的方法如无特殊说明均为常规实验方法。

实施例1

选择长势良好的黑曲霉CGMCC3.3147菌种斜面，轻轻挑取斜面孢子接入含有20％麸皮和70％玉米秸秆的培养基的麸曲瓶中，塞上棉塞并包扎好牛皮纸，用力摇匀麸曲瓶使孢子在培养基中分散均匀，将麸曲瓶搬到培养间中，置27℃下培养。培养到第10天孢子完全长满整个培养基后移入冷藏室备用。

固体发酵培养基的成分为20％麸皮、70％玉米秸秆、尿素1％、硫酸铵0.2％、磷酸二氢钾0.03％、硫酸镁0.002％、氯化钴0.0001％，余量水，初始pH5.6。

加水后搅拌均匀，水分65％。将固体培养基装入浅盘中，121℃高压灭菌60分钟。将无菌水倒入麸曲瓶中，搅拌均匀后，倒在浅盘上。将固体培养基和麸曲菌种拌匀、铺平，盖上盖子，27℃，培养10天。

将培养好的复合酶加水1～2倍混匀后倒入预处理反应容器中进行酶解。

实施例2

选择长势良好的黑曲霉CGMCC3.3147菌种斜面，轻轻挑取斜面孢子接入含有20％麸皮和70％小麦秸秆培养基的麸曲瓶中，塞上棉塞并包扎好牛皮纸，用力摇匀麸曲瓶使孢子在培养基中分散均匀，将麸曲瓶搬到培养间中，置28℃下培养。培养到第7天孢子完全长满整个培养基后移入冷藏室备用。

固体培养基成分为20％麸皮、70％小麦秸秆、尿素1.5％、硫酸铵0.2％、磷酸二氢钾0.04％、硫酸镁0.003％、氯化钴0.0002％、余量为水，初始pH5.6。加水后搅拌均匀，水分70％。

将固体培养基装入浅盘中，121℃高压灭菌60分钟。将无菌水倒入麸曲瓶中，搅拌均匀后，倒在浅盘上。将固体培养基和麸曲菌种拌匀、铺平，盖上盖子，28℃，培养7天。

实施例3

选择长势良好的黑曲霉CGMCC3.3147菌种斜面，轻轻挑取斜面孢子接入含有30％麸皮和60％稻草培养基的麸曲瓶中，塞上棉塞并包扎好牛皮纸，用力摇匀麸曲瓶使孢子在培养基中分散均匀，将麸曲瓶搬到培养间中，置27℃下培养。培养到第10天孢子完全长满整个培养基后移入冷藏室备用。

固体培养基成分为30％麸皮、60％稻草、尿素2.0％、硫酸铵0.1％、磷酸二氢钾0.04％、硫酸镁0.003％、氯化钴0.0005％、余量为水，初始pH6.0。

加水后搅拌均匀，水分75％。将固体培养基装入浅盘中，121℃高压灭菌60分钟。将无菌水倒入麸曲瓶中，搅拌均匀后，倒在浅盘上。将固体培养基和麸曲菌种拌匀、铺平，盖上盖子，27℃，培养10天。

实施例4

选择长势良好的黑曲霉CGMCC3.3147菌种斜面，轻轻挑取斜面孢子接入含有15％麸皮和80％玉米芯培养基的麸曲瓶中，塞上棉塞并包扎好牛皮纸，用力摇匀麸曲瓶使孢子在培养基中分散均匀，将麸曲瓶搬到培养间中，置29℃下培养。培养到第8天孢子完全长满整个培养基后移入冷藏室备用。

固体培养基成分为15％麸皮、80％玉米芯、尿素1.5％、硫酸铵0.2％、磷酸二氢钾0.04％、硫酸镁0.003％、氯化钴0.0005％、余量为水，初始pH6.0。

加水后搅拌均匀，水分75％。将固体培养基装入浅盘中，121℃高压灭菌60分钟。将无菌水倒入麸曲瓶中，搅拌均匀后，倒在浅盘上。将固体培养基和麸曲菌种拌匀、铺平，盖上盖子，29℃，培养8天。