人α-防御素5抗病毒活性突变体多肽及制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种人α-防御素5(HD5)抗病毒活性突变体多肽及制备方法和应用，所述突变体多肽的氨基酸序列的HD5中第21位谷氨酸被替换为精氨酸(E21R)。所述突变体多肽的制备方法，有固相化学合成法和基因工程制备法两种。本发明的HD5突变体多肽在有无血清存在的情况下均具有高效的抗病毒活性，其抗病毒作用较母本HD5多肽显著提高。本发明的HD5突变体多肽可以用于防治HSV、HPV及HIV等病毒的感染。

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质工程和抗病毒药物制备技术领域，特别涉及一种人α-防御素5抗病毒活性突变体多肽及其制备方法和应用。

背景技术

病毒感染性疾病严重危害人类健康，研制高效、特异性抗病毒药物具有重要的现实意义。

防御素是人们在研究哺乳动物、昆虫等防御和抵抗病原微生物侵袭及感染的过程中发现的一种分子量为3-6kD的内源性阳离子肽。之所以被称为阳离子肽，是因为成熟的防御素分子内富含精氨酸(一种碱性氨基酸)，因而在多数情况下防御素分子都带有较强的正电荷。人们对防御素的最初认识是基于其快速、强效的杀菌活性，但后来研究发现，除了抗菌活性外，大部分防御素还具有抗真菌、抗螺旋体以及抗病毒的作用。尤其是一些防御素对严重影响人类健康的病毒，如单纯疱疹病毒(HSV)、人乳头瘤状病毒(HPV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)等显示出一定的杀伤和抑制作用。研究资料表明，防御素分子可以通过阻碍病毒颗粒粘附和侵入哺乳动物细胞以及抑制病毒DNA转录等个环节发挥抗病毒作用。由于防御素是一种内源性分子，本身具有识别病原微生物与机体正常细胞的能力，所以在有效剂量范围内不会对人体正常细胞造成明显影响，也不会诱发产生耐药现象。正因如此，防御素的研制与开发在病原微生物感染防治方面具有广阔的应用前景。

人α-防御素5(HD5)主要由肠道上皮细胞和生殖道粘膜上皮细胞分泌表达。由于生殖道粘膜是HIV、HPV和HSV-2等病毒在人体内的主要传播部位，因此，理论上讲HD5应具有更明显的抗此类病毒活性。Buck等在进行α防御素抗HPV研究时发现，与其它已知的人类防御素分子相比，HD-5的抗病毒活性最为突出(Buck CB et al，PNAS，2006，103：1516-1521)。但是，无论哪一种防御素，其抗病毒作用都不如抗菌效果显著，研究表明α防御素抗病毒时的半数有效浓度(IC50)一般要比抗菌时的IC50高数倍以上(Tanabe Het al，J Virol，2004，78：11622-11631)。这就意味着当应用防御素多肽进行抗病毒治疗时其用量要显著增加，如此不仅会加重病人的经济负担，更重要的是会超出人体正常细胞对其的耐受力，引发毒副反应。此外，包括HD5在内的大多数防御素多肽在血清存在的情况下，其抗病毒活性会受到显著抑制，从而使得防御素的体内应用受到很大限制。

已知，防御素的抗菌及抗病毒活性不仅与其自身所特有的双极性有关，而且还与整个分子及分子内部重要位置氨基酸残基所带正电荷的多少有关。有研究证实，当将防御素分子内带正电荷的精氨酸(碱性氨基酸)替换为中性氨基酸或酸性氨基酸时，防御素的抗菌和抗病毒活性会显著下降。反之，如果将防御素分子内某一或某些酸性氨基酸突变为碱性氨基酸时，突变后的防御素分子的抗菌和抗病毒活性有可能得到显著提高(Higgs R et al，Immunogenetics，2007，59：573-580)。

发明内容

本发明的目的是提供一种人α-防御素5抗病毒活性突变体多肽及制备方法和应用。根据改变防御素分子内氨基酸残基组成和所带电荷量可影响其生物学功能的特性，在HD5自身具有一定抗HSV、HPV和HIV等病毒作用的基础上，通过重要位置氨基酸定点突变和抗病毒活性筛选，获得抗病毒活性显著增强的HD5突变体多肽。本发明的HD5突变体多肽在有无血清存在的情况下均具有高效的抗病毒活性，其抗病毒作用较母本HD5多肽显著提高。本发明的HD5突变体多肽可以用于防治HSV、HPV及HIV等病毒的感染。

本发明的技术方案是：

人α-防御素5抗病毒活性突变体多肽的氨基酸序列如下：

Ala Thr Cys Tyr Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser

1                5                  10                  15

Leu Ser Gly Val Cys Arg Ile Ser Gly Arg Leu Tyr Arg Leu Cys

                20                  25                  30

Cys Arg

在天然HD5的第21位谷氨酸(Glu，E)被替换为精氨酸(Arg，R)。

编码权人α-防御素5抗病毒活性突变体多肽的DNA序列，其序列如下：

GCC ACC TGC TAT TGC CGA ACC GGC CGT TGT GCT ACC CGT GAG TCC CTC TCCGGG GTG TGTATC AGT GGC CGC CTC TAC AGA CTC TGC TGT CGC

HD5突变体多肽的制备方法，包括固相化学合成法和基因工程制备法。

基因工程法制备HD5突变体多肽的方法，将上述人α-防御素5抗病毒活性突变体多肽的DNA序列克隆到表达载体中，转染宿主细胞，经诱导表达、纯化，即得所述HD5突变体多肽。

所述的表达载体为质粒表达载体。

所述的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。

所述原核细胞为大肠杆菌细胞。

所述真核细胞为酵母细胞。

人α-防御素5抗病毒活性突变体多肽在预防和治疗单纯疱疹病毒(HSV)感染或人乳头瘤状病毒(HPV)感染或人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的应用。该HD5突变体多肽可以单独应用，也可以与其他药物或制剂配伍使用。

上述表达本发明HD5突变体多肽的宿主细胞可以是细菌、酵母及哺乳动物细胞等，其中优选的是毕赤酵母。

纯化本发明HD5突变体多肽的方法包括粗提、盐析及液相层析等，其中液相层析又包括了离子交换、疏水等层析技术。

本发明的HD5突变体多肽具有突出的抗HSV-2、HSV-1及HPV等病毒的能力。

本发明的HD5突变体多肽在2％、10％及20％血清中同样具有显著的抗病毒作用，其抗病毒活性较母本HD5多肽显著提高。

本发明的HD5突变体多肽无明显的细胞毒性。

本发明HD5突变体多肽的特点是，在保持HD5基本生物学特性的基础上(例如：对人体正常细胞无毒副作用、不会诱导病毒产生耐药等)，HD5突变体多肽不仅显著提高了抗病毒的能力，而且其抗病毒活性基本上不受血清存在的影响，从而使该突变体多肽既可以作为外用药又可作为内用药应用于HSV、HPV及HIV等病毒感染性疾病的防治.

附图说明：

图1为HD5突变体多肽在无血清情况下抑制HSV-2感染vero细胞效果的分析，其中，柱状1代表正常细胞对照，柱状2代表病毒对照，柱状3代表HD5多肽对照，柱状4代表HD5突变体多肽，*：p＜0.01vs.病毒对照；

图2为HD5突变体多肽在2％血清条件下抑制HSV-2感染vero细胞效果的分析，其中，柱状1代表正常细胞对照，柱状2代表病毒对照，柱状3代表HD5多肽对照，柱状4代表HD5突变体多肽，*：p＜0.01vs.病毒对照；#：p＜0.01vs.HD5多肽对照；

图3为HD5突变体多肽在10％血清条件下抑制HSV-2感染vero细胞效果的分析，其中，柱状1代表正常细胞对照，柱状2代表病毒对照，柱状3代表HD5多肽对照，柱状4代表HD5突变体多肽，*：p＜0.01vs.病毒对照；#：p＜0.01vs.HD5多肽对照；

图4为HD5突变体多肽在20％血清条件下抑制HSV-2感染vero细胞效果的分析，其中，柱状1代表正常细胞对照，柱状2代表病毒对照，柱状3代表HD5多肽对照，柱状4代表HD5突变体多肽，*：p＜0.01vs.病毒对照；#：p＜0.01vs.HD5多肽对照。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本方明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。

主要试剂和材料

1.Pyrobest^TM DNA Polymerase试剂盒(TaKara公司产品，中国大连)

2.限制性核酸内切酶EcoR I、SacI(New England BioLabs公司产品，美国)

3.质粒载体pPIC9K、毕赤酵母菌株GS115(Invitrogen公司产品，美国)

4.Red/ET重组酶redγ/redβ/redα/redA质粒pSC101-BAD-gbaA、大肠杆菌HS996(Gene Bridges公司产品，德国)

5.L-阿拉伯多糖(Sigma公司产品，美国)

6.CCK-8细胞增殖/毒性检测试剂盒(DOJINDO公司产品，日本)

7.Vero细胞株(本室保存)

8.HSV-2病毒株(本室保存)

9.G418、氨苄青霉素(Roche公司产品，德国)

10.DMEM培养基、胎牛血清(Hyclone公司产品，美国)

11.SP Sepharose Fast Flow、Source 15RPC等层析介质(GE公司产品，美国)

12.C18反相层析、FINELINE PILOT 35层析柱(GE公司产品，美国)

13.酵母提取物、胰蛋白胨、无氨基酸酵母氮源(Oxford公司产品，美国)

14.LB培养基

酵母提取物5g

胰蛋白胨  10g

NaCl      10g

溶于1000ml去离子水中，并用1mol/L的NaOH调节pH值至7.0，高压蒸气灭菌。

15.YPD液体培养基

酵母提取物2g

胰蛋白胨  4g

溶于180ml去离子水中，高压灭菌。冷却后加入20ml经滤器除菌后的20％的右旋糖和0.2ml浓度为100mg/ml氨苄青霉素。

16.BMGY液体培养基

酵母提取物      10g

胰蛋白胨        20g

无氨基酸酵母氮源13.4g

甘油            10g

磷酸钾          26.631g

溶于1000ml双蒸水中高压灭菌，冷至室温后补加生物素至终浓度为4×10^-5/L，氨苄青霉素终浓度为100μg/ml，调节pH至6.0，4℃保存备用。

17.磷酸盐缓冲液

NaCl     8g

KCl      0.2g

Na₂HPO₄  1.44g

KH₂PO₄   0.24g

溶于1000ml去离子水中，并用浓HCl调节pH值至7.4，高压蒸气灭菌。

实施例1HD5突变体多肽的固相化学法合成：

1、根据HD5突变体的氨基酸序列，利用全自动多肽合成仪(433A，AppliedBiosystem)委托上海生工生物工程公司合成HD5突变体多肽。

2、通过HPLC反相C18柱层析、脱盐对合成的HD5突变体多肽进行纯化。

3、采用同样方法合成、纯化母本HD5多肽对照品。

4、对于纯化的HD5突变体多肽，采用高压液相(HPLC)方法进行纯度鉴定，应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF)对其分子量进行测定，通过等电聚焦电泳测定其等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

5、HPLC结果显示，最终所得HD5突变体多肽的纯度＞95％；等电聚焦电泳结果显示所得HD5突变体多肽的等电点为9.2左右；质谱分析结果显示所得HD5突变体多肽的分子量为3615.27，均与理论推导值一致。

实施例2重组HD5突变体多肽在毕赤酵母中的表达及纯化制备

1、合成编码HD5突变体的全长基因。委托上海生工生物工程公司合成编码HD5突变体的全长基因，基因序列如下：

GCC ACC TGC TAT TGC CGA ACC GGC CGT TGT GCT ACC CGT GAG TCC CTC TCCGGG GTG TGTATC AGT GGC CGC CTC TAC AGA CTC TGC TGT CGC

注：阴影部分的3个碱基所编码的氨基酸即为突变后的精氨酸，方框内的3个碱基所编码的是终止密码子。

2、重组HD5突变体酵母表达载体的构建

(1)PCR引物设计：为了保证酵母表达的重组HD5突变体N端无多余的氨基酸，采用Red/ET重组技术将编码HD5突变体的基因序列直接插入到酵母表达载体pPIC9K中的STE₁₃蛋白酶识别位点之后。为此，首先合成带有50bp同源臂的上、下游PCR引物，引物序列如下：

mHD5-up：5′--3′

mHD5-down：5′--3′

其中mHD5-up中5′端斜体部分为pPIC9K质粒中STE₁₃蛋白酶识别位点之前的50个碱基的序列，阴影部分为HD5突变体基因的特异性上游引物序列；mHD5-down中5′端斜体部分为pPIC9K质粒中多克隆位点之后的50个碱基的序列，阴影部分为HD5突变体基因的特异性下游引物序列。这样在进行PCR扩增编码HD5突变体基因片段的同时，其两端分别加载上了与pPIC9K质粒载体骨架部分同源的50bp序列。

(2)PCR扩增：以合成的HD5突变体全长基因DNA片段为模板，以mHD5-up和mHD5-down作为上、下游引物，进行PCR反应，反应条件如下：①变性：94℃，5min；②变性：94℃，30s；③复性：55℃，30s；④延伸：72℃，30s；⑤返回步骤“②”，35循环；⑥延伸：72℃，5min；⑦4℃保存，总循环次数为35次。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果显示扩增出约150bp大小的DNA条带。所得PCR产物即为两端分别带有50bp同源臂的HD5突变体基因片段。

(3)Red/ET介导重组HD5突变体酵母表达载体的构建：将EcoR I酶切线型化的pPIC9K片段和上述PCR扩增产物按相等浓度共电击转化已用0.1％L-阿拉伯糖诱导表达redγ/redβ/redα/redA重组酶的HS996感受态细胞，然后接种于LB平板，37℃培养过夜，挑取经卡那霉素筛选的阳性克隆再培养，并提取质粒进行酶切和测序鉴定，结果显示获得的质粒序列正确，阳性克隆命名为pPIC9K-HD5-E21/R。

将测序正确的pPIC9K-HD5-E21/R质粒DNA用Sac I酶切回收后，分别转化GS115感受态细胞。电击转化参数为：1500V，200Ω，25μF。然后将转化菌液接种于YPD平板，对经基因组PCR鉴定整合有目的基因的克隆株进行培养，制备感受态细胞，按前述方法再次进行电击转化和鉴定。接着用常规方法进行表型和G418抗性筛选，最终挑选出具有His+/Mμt+表型且耐受5.0mg/ml G418的克隆株接种培养，并标识冻存于-70℃保种。

(4)酵母工程菌株的发酵和重组HD5突变体多肽的纯化

取-70℃冻存的整合有pPIC9K-HD5-E21/R的酵母工程菌种接种于YPD平板30℃过夜培养活化，挑选外观优良的单个菌落接种于BMGY培养基，30℃恒温摇床220rpm振荡培养16～18h至OD₆₀₀≈3～5，然后按1∶10转种1次培养至OD₆₀₀约为4，以此菌液为种子液。然后将种子液移种于装有基础盐培养基(添加微量盐PTM₁)的15L发酵罐(B.Braun公司，德国)进行高密度培养发酵。发酵温度控制在30℃(开始甲醇诱导后控制为28℃)，溶解氧控制在30％～40％之间，pH值控制在5.0(开始甲醇诱导后控制为3.5)，细胞培养至OD₆₀₀≈150时开始流加甲醇诱导，甲醇流加速率控制在1％左右.诱导表达60h后停止发酵，低温离心取上清，随后进行纯化.首先将上清进行超滤层析，以去除部分色素和降低高强度的盐离子浓度，并将目的多肽浓缩约100倍，同时用20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH值7.2)更换缓冲体系.接着过SP Sepharose Fast Flow柱进行阳离子交换层析，去除绝大部分残留色素和杂蛋白，收集含有目的多肽的组分，再上FINELINE柱(Source RPC 15填料，柱高5cm)进行反相层析，将收集分离组分于-80℃冻干机内分步冻存即获得纯化的重组HD5突变体多肽。

实施例3HD5突变体多肽的细胞毒性测定

接种vero细胞(非洲绿猴肾细胞)于96孔板中，接种密度为2000个细胞/孔，接种体积为100μl，vero细胞在含10％胎牛血清的1640培养液中培养24h至细胞完全贴壁，弃培养液，换用含有不同浓度HD5突变体多肽的培养液继续培养，每一浓度均重复5孔，同时设置母本HD5多肽对照组和空白对照组。培养72h后，每孔加入CCK-8反应液10μl，37℃继续培养4h，轻轻吸弃上清液，振荡混匀，酶标仪测定490nm波长处吸光度值(A值)。细胞存活率(％)＝药物组A值/空白对照组A值×100％。结果显示，在100μg/ml以内HD5突变体多肽不会显著影响细胞的增殖活性，而且相同浓度的HD5突变体多肽处理组与母本HD5多肽处理组之间的细胞存活率没有明显差别，表明HD5突变体的细胞毒性没有增加。

实施例4HD5突变体多肽的抗病毒活性测定

首先常规方法制备HSV-2病毒液，并测定病毒的半数感染量(TCD₅₀)。接种vero细胞于96孔板中，接种密度为2000个细胞/孔，接种体积为100μl，vero细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养液中培养24h至细胞完全贴壁，弃培养液，更换同时含有100倍TCD₅₀病毒液和100μg/ml HD5突变体多肽的DMEM培养液，培养液中的血清浓度可选择为0％、2％、10％、20％，同时设置正常细胞对照组(既不加病毒液，也不加HD5突变体多肽)、病毒对照组(只加病毒液，不加HD5突变体多肽)和母本HD5多肽处理组(同时加入100倍TCD₅₀病毒液和100μg/ml母本HD5多肽)。37℃培养48h后，每孔加入CCK-8反应液10μl，37℃继续培养4h，轻轻吸弃上清液，振荡混匀，酶标仪测定490nm波长处吸光度值(A值)。细胞保护率＝(药物组A值-病毒对照组A值)/(正常细胞对照组A值-病毒对照组A值)×100％。结果显示，浓度为100μg/ml的HD5突变体多肽无论在有无血清存在的情况下，均可以显著保护vero细胞不被HSV-2感染，尤其在血清存在情况下，其保护效果显著强于母本HD5多肽(见图1-4)。

结论：本发明HD5突变体不仅具有高效、低毒的抗HSV-2病毒能力，而且其抗病毒活性基本上不受血清存在的影响，从而使该突变体多肽既可以作为外用药又可作为内用药应用于HSV、HPV及HIV等病毒感染性疾病的防治。